Az elhízás hatása az invazív emlődaganatok molekuláris jellemzőire: gén expressziós elemzés a nők nagy csoportjában

Absztrakt

Háttér

Az elhízás a posztmenopauzás nőknél az emlőrák kockázati tényezője, csökkenő túléléssel és kevésbé kedvező klinikai jellemzőkkel, például nagyobb daganatterheléssel, magasabb fokúsággal és rossz prognózissal jár együtt, függetlenül a menopauza állapotától. Az elhízás klinikai eredményre gyakorolt negatív hatása ellenére nem pontosan meghatározhatók azok a molekuláris mechanizmusok, amelyek révén a túlzott zsírbetegség befolyásolja az emlőrák etiológiáját.

Mód

Az Affymetrix U133 2.0 génexpressziós adatokat 405 primer emlődaganatra állítottuk elő, lézerrel mikrodisszektált szövetekből izolált RNS alkalmazásával. A betegeket normál súlyúnak (BMI

Háttér

A Betegségellenőrzési és Megelőzési Központ adatai azt mutatják, hogy az Egyesült Államokban (USA) a felnőttek 68% -a túlsúlyos (25 ≤ BMI 2) vagy elhízott (BMI ≥ 30 kg/m 2) [1]. Az elhízás az általános népességnél szignifikánsan magasabb, minden okból bekövetkező halálozással jár [2], és összefüggésbe hozható a 2-es típusú cukorbetegséggel, a szív- és érrendszeri betegségekkel, az asztmával, az osteoarthritissel és a rák számos típusával [3]. Ha az elhízás a jelenlegi ütemben tovább növekszik, az elhízással összefüggő ellátásnak tulajdonítható összes egészségügyi költség 2030-ra elérheti a 860 milliárd dollárt, és az Egyesült Államokban az összes egészségügyi kiadás 18% -át teszi ki [4].

Az elhízás és a testtömeg-gyarapodás 20-50 éves kor között jelentős kockázati tényező az emlőrák számára [5] a menopauzás nőknél [6, 7], különösen azoknál, akik nem alkalmaznak hormonpótló kezelést (HRT) [8]. Bár a testtömeg-index (BMI) és az emlőrák altípus közötti összefüggés nem világos [9–15], az elhízáshoz kevésbé kedvező kóros jellemzők társultak, beleértve az előrehaladott stádiumot, a nagyobb daganatméretet és az áttétes nyirokcsomó-érintettséget [16–19]. Ezenkívül a metaanalízisek jelentős összefüggéseket fedeztek fel az elhízás, az általános és az emlőrák-specifikus túlélés között [20, 21].

Tekintettel az Egyesült Államokban és az egész világon növekvő elhízási járványra, kritikus fontosságú megérteni, hogy az elhízás hogyan befolyásolja az emlőrák etiológiáját. A rossz prognózis a társbetegségeknek, a kemoterápiás szerek nem megfelelő adagolásának vagy a túlzott zsírosság biológiai hatásainak tulajdonítható, ideértve az ösztrogén megnövekedett szintjét, a hiperinsulinémiát vagy a krónikus gyulladást [22, 23]. A daganatos hámsejtek molekuláris tája és az adipozitás közötti összefüggések jobb megértése érdekében 405 mikrodisszektált emlő karcinómából gén expressziós adatokat állítottak elő, és a diagnózis idején a BMI elemezte.

Mód

Etika, beleegyezés és engedélyek

A Klinikai Mellgondozási Projektbe beiratkozott összes beteg megfelelt az alábbi alkalmassági feltételeknek: 1) 18 éven felüli felnőtt, 2) mentálisan kompetens és hajlandó megalapozott beleegyezés megadására, és 3) mellbetegség bizonyítékokkal jelentkezett az emlőközpontokban. A szövet- és vérmintákat a Walter Reed Országos Katonai Orvosi Központ emberi felhasználási bizottságának és az intézményi felülvizsgálati testület jóváhagyásával gyűjtötték. Valamennyi alany önként vállalta a részvételt, és írásos beleegyezését adta.

Mintagyűjtés és jellemzés

A szövetet sebészeti beavatkozásokon, többek között lumpectomián vagy mastectomián átesett betegektől gyűjtötték. A műtéti eltávolítástól számított 5–15 percen belül az emlőszövetet zúzott, nedves jégen vitték a patológiai laboratóriumba, ahol engedéllyel rendelkező patológus vagy patológus asszisztens rutinszerű kóros elemzéseket végzett. Minden minta diagnosztizálását mell-patológus végezte. A színpadot és az osztályzatot az AJCC által meghatározott irányelvek alapján osztották ki Cancer Staging Manual hetedik kiadás [24], illetve a Nottingham Histologic Score [25, 26]. A belső altípust a BreastPRS alkalmazásával határoztuk meg, a korábban leírtak szerint [27].

RNS izolálás, amplifikáció, aRNS jelölés és hibridizáció

Az emlőpatológus minden esetben azonosította a H&E-vel festett tárgylemezek lézeres mikrodisszekciójának daganatterületeit. Két-öt sorozatot (8 μm vastagságot) vágtak, üveg PEN fólia tárgylemezekre (Leica Microsystems, Wetzlar, Németország) szereltek fel, az LCM festőkészlettel (Applied Biosystems, Foster City, CA) festették és lézerrel mikroszkontálták AS-enLMD lézeres mikrodisszekciós rendszer (Leica Microsystems, Wetzlar, Németország). A tárgylemezek előkészítését, festését és vágását 15 percen belül végeztük az RNS integritásának megőrzése érdekében. Az RNS-t ezután az RNA vizes-mikrokészlet (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia) segítségével izoláljuk, és DNáz I-vel kezeljük a szennyező genom DNS eltávolítására. Az RNS integritását a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) alkalmazásával értékeltük, biotinnal jelölt aRNS-vé alakítva, a MessageAmpII aRNS Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) két amplifikációs fordulójával, valamint a koncentrációval és a minőséggel. a mintákat a NanoDrop 1000 (NanoDrop Products, Wilmington, DE) és a 2100 Bioanalyzer készülékkel mértük. A hibridizációt a gyártó által biztosított hibridizációs kontrollokkal, a HG U133A 2.0 tömbök (Affymetrix, Santa Clara, Kalifornia) mosását, festését és letapogatását a gyártó protokolljainak megfelelően végeztük [28].

Elemzés és statisztika

A statisztikai elemzések során a BMI-t nem folyamatos változóként kezelték; a betegeket inkább normál súlyúnak (BMI

Eredmények

A beteg jellemzői

2001 és 2011 között minden betegnél invazív emlőrákot diagnosztizáltak. Az elhízott nők szignifikánsan idősebbek voltak a diagnózis felállításakor (P = 0,009), és szignifikánsan nagyobb valószínűséggel voltak afroamerikai (P = 0,012), mint a normál testsúlyú nőknél. A túlsúlyos nők nem különböztek szignifikánsan életkorukban a diagnózis vagy az ősök vonatkozásában sem a normál testsúlyú, sem az elhízott nőktől. Nincsenek kóros jellemzők vagy a beteg kimenetele jelentősen különbözött a BMI-től (1. táblázat).

A PCA nem klaszterelte hatékonyan a mintákat a BMI segítségével (1. ábra). A BMI-csoportok között nem mutattak ki differenciáltan expresszált géneket a kezdeti elemzésben, amely az összes tumor-altípust magába foglalta, vagy ha elhízott és nem elhízott betegeket hasonlítottak össze. Míg a PCA nem különböztette meg hatékonyan a daganatokat a BMI-vel, a daganatok klasszifikáltak a belső altípus szerint. Így annak meghatározására, hogy a heterogén tumorcsoport bevonása eltakarja-e a jelentős génexpressziós különbségeket, elemzéseket végeztek a belső altípusokon belül. Nem találtunk különbséget a B luminalis esetében (n = 43), HER2-dúsított (n = 48) vagy bazális (n = 99) daganatok; mindazonáltal 42 gén 44 próbáját különböztettük meg BMI kategóriánként (2. táblázat; 2. ábra) a luminal A altípuson belül (n = 209). Ezek a differenciálisan expresszált gének számos, a tumorgenezisben részt vevő útvonalhoz kapcsolódnak, például a sejtciklus-szabályozáshoz, az mTOR és a p53 szignalizációhoz és a DNS-helyrehozáshoz (3. táblázat).

405 primer tumorminta gén expressziójának PCA-ja. A felső ábrát a BMI-csoportok színezik, nem észleltek nyilvánvaló klasztereket. A bal oldali ábrát altípus szerint színezik, és a minták altípus szerinti csoportosítását mutatják be

A box és a bajusz ábrázolja a differenciál gén expresszióját normál testsúlyú és elhízott nők daganataiban. Az elhízott daganatokban az APOD és az OGN esetében a legnagyobb eltéréseket 2,36- és 2,05-szer nagyobb expresszióval detektálták a normál testsúlyú nőknél; A MELK a normális expresszióban a legmagasabb (1,71-szeres) növekedést mutatta az elhízott nőkhöz képest

Vita

Az elhízás aránya világszerte riasztó mértékben növekszik [29], és az Egyesült Államokban a felnőttek> 50% -a várhatóan elhízik 2030-ig [4]. Az emlőrákban szenvedő elhízott nők rossz prognózisa miatt kritikus jelentőségű az elhízás hatásának jobb megértése. Az elhízással korreláló invazív emlő karcinómák molekulaprofiljainak azonosítása olyan célzott terápiás gyógyszerek vagy kockázatcsökkentési stratégiák kidolgozását teszi lehetővé, amelyek javíthatják az elhízott nők kimenetelét. Ebben a tanulmányban 42 egyedi gént detektáltunk, amelyek a normál testsúlyú A luminalis emlődaganatokban differenciálódtak az elhízott nőkhöz képest. A túlsúlyos betegek daganatai nem különböztek szignifikánsan a normál testsúlyú vagy elhízott nőkétől.

Tudomásunk szerint ez az első vizsgálat, amely azonosítja az elhízással járó transzkripciós változásokat az A luminalis tumorok hámsejtjeiben. Kwan és mtsai. kiértékelte a BMI hatásait egy 1676 korai stádiumú daganatban, ahol a belső altípust a PAM50 qRT-PCR assay segítségével határozták meg [11], és megállapította, hogy a magas elhízás (BMI ≥ 35) az ESR1 csökkent expressziójával és a proliferációs gének. A Kwan és mtsai által vizsgált 10 proliferációs gén közül négyet (CENPF, CEP55, MK167 és KIF2C) szintén szignifikánsan magasabb szinten fejeztek ki elhízott daganatokban, mint a normál testsúlyú betegeknél.

Fuentes-Mattei és mtsai. mikroszkópos alapú transzkriptómanalízist végzett ER + daganatokban, és 112 gént azonosított, amelyek eltérően expresszálódtak a nem elhízott és elhízott betegek között. A géndúsítási elemzés szignifikáns változásokat mutatott ki az AKT-target és az epithelialis-mesenchymalis átmeneti utakban. Az AKT/mTOR útvonal aktiválódását elhízott egerek daganataiban is kimutatták [30]. Noha a vizsgálatunkban kifejezetten expresszált gének egyike sem volt Fuentes-Mattei és mtsai tanulmányában, a differenciálisan expresszált génjeink útdúsítási elemzése az mTOR jelátviteli útváltozását is feltárta.

Az elhízás 662, differenciálisan expresszált gént felölelő transzkriptikus aláírásáról korábban beszámoltunk, a neoadjuváns vizsgálatokba beiratkozott, 103 lokálisan előrehaladott emlőrákban szenvedő nőbeteg tumorbiopsziás mintái alapján, függetlenül az ER státusztól [31]. A gén annotációs dúsítási elemzés két nyilvános adathalmazban egy olyan expressziós aláírást fedezett fel, amelyet a transzkripció és a mag szabályozásában részt vevő gének felülreprezentáltak, és amely a metasztázisig rövidebb idővel társult; négy másik adatbázisban azonban nem észleltek összefüggést. Megjegyzendő, hogy az afroamerikaiak lényegesen nagyobb arányban voltak elhízottak a normál vagy a túlsúlyosakhoz képest, és az adatkészletükben számos, különböző módon kifejezett szonda, köztük a 205048_s_at (PSPHL), a 206777_s_at (CRYBB2P1) és a 212777_at (SOS1) különbözik egymástól az afroamerikaiak és az európai amerikaiak között különféle szövettípusokban fejeződik ki [32–39]. Azok a késői stádiumú daganatok, amelyek nem altípus vagy ER státusz szerint vannak rétegezve, és a genetikai eredetnek tulajdonítható zavaró génexpressziós eredmények kombinációja befolyásolhatja a BMI-vel kapcsolatos transzkriptóm-változások kimutatásának képességét.

Kritikus különbség az adatok és az egyéb jelentések között az, hogy lézeres mikrodisszekciót alkalmaztunk a tumorsejtek izolálására, míg a többi vizsgálatból származó minták 15–30% sztrómasejtet tartalmaztak. Az emlő zsírszövet a daganat növekedésének üzemanyagaként toborozza a makrofágokat és stimulálja a gyulladásos reakciót [40]. Laboratóriumunk adatai azt mutatták, hogy a daganattal szomszédos zsírszövet megváltozott gyulladásos reakcióval és fokozott immunotoleranciával rendelkezik [41], és a legfrissebb adatok azt mutatják, hogy az ER + emlőrák sejtjeinek együttes kezelése az elhízott nők zsírstromájával/őssejtjeivel fokozta az emlőrák sejtjeinek szaporodását, és ezek az emlőrákos sejtek fokozott epitheliális-mezenhimális átmenetet és metasztázis gének expresszióját mutatták [42]. Tehát, bár a daganatsejtek lézeres mikrodisszekciója molekuláris portrét szolgáltathatott a daganat epitheliájában a génexpresszióról, a sztrómasejtek, köztük a zsírszövetek jelentős részének engedélyezését lehetővé tevő vizsgálatok a daganatban jelenlévő túlzott adipozitással járó változásokat fedezhettek fel. mikrokörnyezet.

Következtetés

A túlzott zsírbetegség nem érinti egyformán az összes melldaganatot; a BMI által végzett differenciális génexpresszió inkább a luminal A tumorokra korlátozódott. A sejtciklus-szabályozással, az mTOR és p53 szignalizációval, valamint a zsírsav-anyagcserével járó utak változásai magyarázhatják az elhízáshoz kapcsolódó kevésbé kedvező eredményeket. Ezenkívül ezen utak változásainak kimutatása lehetővé teszi olyan szerek, mint például az mTOR inhibitorok alkalmazását az elhízott, luminal A daganatos nők hatékonyabb kezelésére és az eredménykülönbségek csökkentésére.