Az emberi homológ étrendi mikroRNS-ek túlélése és sokfélesége hagyományosan főtt hátszínben és szárított szarvasmarha-szövet kivonatokban

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Joseph T. Dever, Michael Q. Kemp, David M. Barnes

mikrorns-ek

Társulás-kutatási és fejlesztési osztály, Standard Process, Inc., Palmyra, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Joseph T. Dever, Michael Q. Kemp, David M. Barnes

Társulás-kutatási és fejlesztési osztály, Standard Process, Inc., Palmyra, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

¶ ‡ Ezek a szerzők is egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Társulás-kutatási és fejlesztési osztály, Standard Process, Inc., Palmyra, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

¶ ‡ Ezek a szerzők is egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Társulás-kutatási és fejlesztési osztály, Standard Process, Inc., Palmyra, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

¶ ‡ Ezek a szerzők is egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Társulás-kutatási és fejlesztési osztály, Standard Process, Inc., Palmyra, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

¶ ‡ Ezek a szerzők is egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Társulás-kutatási és fejlesztési osztály, Standard Process, Inc., Palmyra, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Joseph T. Dever, Michael Q. Kemp, David M. Barnes

Társulás-kutatási és fejlesztési osztály, Standard Process, Inc., Palmyra, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

  • Joseph T. Dever,
  • Michael Q. Kemp,
  • Amber L. Thompson,
  • Hana G. K. Keller,
  • James C. Waksmonski,
  • Chris D. Scholl,
  • David M. Barnes

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Dever JT, Kemp MQ, Thompson AL, Keller HGK, Waksmonski JC, Scholl CD és mtsai. (2015) Az emberi homológ étrendi mikroRNS-ek túlélése és sokfélesége hagyományosan főzött felső bélszín- és szárított szarvasmarha-szövet kivonatokban. PLoS ONE 10 (9): e0138275. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0138275

Szerkesztő: Yun Zheng, Kunming Tudományos és Műszaki Egyetem, KÍNA

Fogadott: 2015. április 28 .; Elfogadott: 2015. augusztus 26 .; Közzétett: 2015. szeptember 22

Adatok elérhetősége: Az összes releváns adatot a dokumentum és annak kiegészítő információ fájljai tartalmazzák. A kéziratban említett összes kis RNS-szekvenálási profilt letétbe helyeztük az NCBI GEO/SRA-ban. A tanulmány GEO belépési száma GSE69874.

Finanszírozás: A Standard Process, Inc. finanszírozta ezt a munkát. A finanszírozó fizetés formájában nyújtott támogatást minden szerző számára, de nem volt további szerepe a tanulmány tervezésében, adatgyűjtésében és elemzésében, a közzététel döntésében vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők megerősítik, hogy minden szerző a Standard Process, Inc. alkalmazottja. A szerzők kijelentik azt is, hogy „A Standard Process, Inc. állati szöveti eredetű fogyóeszközöket forgalmaz, de ez nem változtatja meg az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek betartását.

Bevezetés

A mikroRNS-ek (miRNS) a növényekben és állatokban a kis, nem kódoló RNS mindenütt megtalálható osztálya, amelyek antiszensz kötéssel gátolják a messenger RNS (mRNS) fehérje transzlációját [1]. Jelenleg több mint 2500 emberi miRNS szerepel a miRBase-ben (21. verzió) [2], és szabályozó hatásuk a sejtes és fiziológiai folyamatokra széles körben elterjedt. Az érett, egyszálú, jellemzően 22 nukleotid hosszúságú miRNS-ek hosszabb hajtű prekurzorokból származnak Drosha és Dicer hasításával [1]. Ezután az Argonaute 2-hez kötődnek az RNS-csendesítő komplex részeként, amely megkönnyíti a miRNS-ek megkötését az mRNS-céljaikhoz.

Ebben a tanulmányban mély miRNS-szekvenálást és kvantitatív reverz transzkripciós PCR-t (RT-qPCR) alkalmaztunk az emberi homológ szarvasmarha miRNS-ek profiljának és stabilitásának jellemzésére élelmiszeripari minőségű szarvasmarha-szövetekben, beleértve a felső hátszínt, a szívet és a mellékvesét. Teszteltük a hagyományos főzés (serpenyőben sütés) vagy pasztőrözés, majd a folyékony szövetkivonatok fagyasztva szárításának hatását a szöveti miRNS-ekre. Átfogó célunk az volt, hogy olyan előfeltételes információkat nyújtsunk be, amelyek szükségesek a hús alapú miRNS-ek táplálkozás szempontjából releváns szélesebb körű meghatározásához.

Mód

Minta kollekció

A vizsgált szarvasmarhafélék izom- és szervszövetei az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériumának megfelelő minőségűek és emberi fogyasztásra alkalmasak voltak. A húskészítményeket nem érlelték, és fajták összesítéséből származtak. Frissen vágott hátszínmintákat (egyenként 12–15 font) az élelmiszerboltokból szereztek Wisconsin déli-középső részén (WI), beleértve a Walmart Supercentert (Monona, WI), a Piggly Wiggly (Cambridge, WI) és a Pick 'n Save (Fort) Atkinson, WI). A szarvasmarha-szíveket (Long Prairie Packing, Long Prairie, MN, Federal Establishment # 253) és a szarvasmarha-mellékveséket (Cargill Wyalusing, Wyalusing, PA, Federal Establishment # 9400) közvetlenül az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériumának ellenőrzött létesítményeiből vásárolták. Minden szervminta egyesített szövetekből (egyenként 12–15 font) állt, több állatból.

Minta előkészítés

A bélszín-, szív- és mellékvese-mintákat kezdetben STX Turbo Force húsdarálóval őrölték. A hagyományosan főtt szövetminták előkészítéséhez az őrölt szöveteket serpenyőben megsütötték (rózsaszín hús nem maradt) 177 ° C-ra beállított elektromos serpenyőben. A szárított szövetkivonatok előállításához az őrölt szövetet folyékony szövetkivonattá dolgozták fel laboratóriumi léptékű módszerrel, amely gyártási léptékben, élelmiszeripari extrakciós eljáráson alapult (Standard Process, Inc., Palmyra, WI). A folyékony szövetkivonatot ezután 72 ° C-on 15 másodpercig gyors pasztőröztük, majd fagyasztva szárítottuk. A fagyasztva szárított kivonatokat habarcs és mozsár segítségével porokká őrölték. Ezután az összes mintát -20 ° C-on tároltuk.

RNS extrakció

A teljes RNS-t minden nyers, főtt és szárított szövetből kivontuk a mirVana ™ miRNS Isolation Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA) felhasználásával a gyártó utasításai alapján. Röviden: 100 mg nyers vagy serpenyőben sült mintát és 25 mg szárított kivonatot 5 percig ultrahanggal kezeltünk 600 μl Lysis/Binding TM oldatban, majd savas-fenolos extrakcióval. A teljes RNS-t centrifugáló oszlopba gyűjtöttük, és 50-100 ul eluáló oldattal eluáltuk. A mennyiséget és a tisztaságot Nanodrop ND-1000 alkalmazásával határoztuk meg. Az RNS integritását Bioanalyzer (Agilent, CA) alkalmazásával értékeltük. A mintákat száraz jégen szállítottuk az Arraystar, Inc.-hez (Rockville, MD) szekvenálás céljából.

Mély miRNS szekvenálás

Minden minta teljes RNS-ét használtuk fel a miRNS szekvenáló könyvtár előállítására, amely a következő lépéseket tartalmazta: 1) 3'-adapter ligálás T4 RNS ligáz 2-vel (csonka); 2) 5'-adapter ligálás T4 RNS ligázzal; 3) cDNS szintézis RT primerrel; 4) PCR-amplifikáció; 5) kivonása és tisztítása

135-155 bp PCR-amplifikált fragmensek (megfelelnek a

15–35 nt kis RNS-ek) a PAGE gélből. Miután az elkészült könyvtárakat egy Agilent 2100 Bioanalyzer segítségével kvantifikáltuk, a könyvtárakban lévő DNS-fragmentumokat 0,1 M NaOH-val denaturáltuk, így egyszálú DNS-molekulákat állítottunk elő, Illumina áramlási sejteken megfogva, in situ amplifikálva és végül 36 ciklust szekvenálva az Illumina HiSeq-en. ® 2000 a gyártó utasításainak megfelelően. A képek szekvenálása után képelemzést és bázishívást hajtottak végre az Off-Line Basecaller szoftver (OLB V1.8.0) segítségével. Ezt követően a 3 ’adapter szekvenciákat tiszta leolvasásokból (a Solexa CHASTITY minőségi szűrőn átesett olvasásokból) vágtuk le, és a 15nt-nál rövidebb olvasmányokat elvetettük. A 3’-adapterrel vágott leolvasásokat (> = 15nt) a legújabb ismert tehén- és humán referencia miRNS prekurzor készlethez (Sanger miRBase 20) illesztettük a Novoalign (v2.07.11) alkalmazásával. Olvas (számít az 1. ábra).

A) Az összes RNS reprezentatív képe minden nyers és előkészített szövetből elektroforetikus elválasztást követően. B) Az adapterrel vágott leolvasások százaléka szarvasmarha- vagy humán miRNS-ként van jelölve. C) Olvasási hosszúságú frekvencia grafikonok a nyers és az előkészített szövetekhez. Az adatokat átlag ± SD-ként fejezzük ki, * szignifikánsan eltérő (p 2. ábra. A miRNS-profilok korrelációja és egyváltozós elemzése.

Az átlagolt log2 transzformált normalizált leolvasási számok korrelációs hőtérképe legalább egy szövet és folyamat mindhárom replikátumában 10 vagy nagyobb leolvasással detektált 198 miRNS-nek. A szignifikánsan különböző miRNS-ek száma (p 3. ábra. A miRNS-profilok többváltozós elemzése.

A) Alapkomponens-elemzés és B) a log2-transzformált normalizált leolvasási szám hierarchikus csoportosítása az ANOVA által meghatározott 105 differenciálisan detektált miRNS-ben.

A szövet előkészítési módszerek hatása az étrendi miRNS-ekre

Ezután megvizsgáltuk a specifikus humán homológ miRNS-ek azonosságát és relatív hozzájárulását minden nyers és előkészített szövet esetében. Minden esetben a tíz legelterjedtebb miRNS jelentette az összes miRNS-sel ellátott átlagolt normalizált leolvasás többségét (71–93%) (S3 táblázat, 4. ábra). A főtt hátszín, a főtt szív és a szívkivonat miRNS profiljai nagyon hasonlóak voltak a nyers szöveteikhez. Ezzel szemben a főbb mellékvese- és mellékvese-kivonatban a 10 legelterjedtebb miRNS profilja némileg eltért a nyers mellékvese-tartalmától, amely nagyjából a felét tartalmazza ugyanezen 10 legbőségesebb nyers szöveti miRNS-nek. Két miRNS, a miR-10b-5p és a miR-143-3p, a három szövet összes készítményében a legjobban expresszált miRNS-ek közé tartozott, míg a miR-26a-5p és a miR-30a-5p az összes csoportban az első tíz miRNS-ben a főtt mellékvese kivételével. Az izom-specifikus miR-1 kiemelkedő volt a hátszínben és a szívalapú készítményekben, míg a miR-206, egy másik izom-specifikus miRNS, mind a nyers, mind a főtt hátszínben elterjedt volt. Valamennyi mellékvese-alapú csoportban a miR-146b-5p-t magasabb olvasószám mellett detektálták, mint a hátszín és a szívcsoportok.

Az egyes szövet- és folyamatcsoportok 10 leggyakoribb miRNS-jének humán annotált miRNS-profiljának átlagos százalékos hozzájárulása. A nyers szöveti miRNS-ek mindegyikének egyedi színt adtak. Az összes fehér hátteret kapott miRNS megtalálható a 10 leggyakoribb miRNS között főtt vagy szárított kivonat mintákban, de nem a megfelelő nyers szövetben.

A mély szekvenálási eredmények kvantitatív reverz transzkripciós PCR (RT-qPCR) validálása

A nyers és az előkészített szövetek szekvenálási eredményeit RT-qPCR segítségével validáltuk Taqman® vizsgálatokkal. Először két miRNS-t (miR-10b-5p és miR-143-3p) validáltunk, amelyeket minden szekvenciás mintában mindenütt kimutattunk. Jelentős korrelációt figyeltünk meg a log10-transzformált olvasási számok (3,2–5,7) és a Ct-értékek (22,6–35,3) között mindkét fenti miRNS esetében (5. ábra). Három, a bélszín (miR-206), a szív (miR-221-3p) és a mellékvese (miR-146b-5p) magasabb olvasási számánál talált három miRNS-t is validáltuk. Mindegyik esetben alacsonyabb (magasabb expressziónak megfelelő) Ct értékeket kaptunk a várt szövetben (5. ábra). Végül két miRNS-t (miR-506 és miR-889) validáltunk, amelyeket szekvenálással egyetlen minta sem mutatott ki. Ahogy az várható volt, ezen miRNS-ek RT-qPCR elemzése hátszín-, szív- és mellékvese-alapú nyers és elkészített mintákban megerősítette ezen miRNS-ek hiányát vagy közeli hiányát (Ct-értékek nagyobbak, mint 36 vagy meghatározatlanok).

A) A Pearson által végzett log10 normalizált szekvenálás korrelációs elemzése a miR-10b-5p és miR-143-3p Ct értékeivel olvasható le a szövet- és folyamatcsoportokban. B) A miR-206, miR-221-3p és miR-146-5p Ct értékei a szövet- és folyamatcsoportokban. Az adatokat átlag ± SD-ként fejezzük ki, * szignifikánsan különböznek egymástól (p + CD25 + FoxP3 + szabályozó T-sejtek [15]. Ezt a hipotézist most megerősítették a közelmúltbeli megállapítások, miszerint a tejből származó szarvasmarha miRNS-eket az egerek és az emberek a szisztémás keringés [14].

Itt mély szekvenálás és RT-qPCR segítségével megmutattuk, hogy a tej mellett az ember-homológ miRNS-ek változatos és szövetspecifikus mintázatai is megtalálhatók mind a hagyományosan főtt marhahúsban, mind a szárított szövetekben. Tudomásunk szerint ezek a megállapítások jelentik az első erőfeszítést az emberi homológ étrendi miRNS-ek teljes profiljának katalogizálására a fogyasztható állati szövetekben.

Egyre több bizonyíték utal arra, hogy az étrendi miRNS-ek felszívódása a szisztémás keringésbe orális bevételt követően nem mindig hatékony emlősökben [5–7,10]. Az exoszómákon belül védett vagy a fehérjékhez kötöttek stabilabbak és biológiailag hozzáférhetőbbek lehetnek [11–15, 22–24]. Még ha nem is szívódnak fel jól a szisztémás keringésbe, az étrendi miRNS-ek hatással lehetnek magára a bélre. Például az immunológiai alapú étrendi miRNS-ek, például a tejben találhatók, hatásokat fejthetnek ki a bélhez kapcsolódó limfoid szövetben.

A jelen tanulmány egyik fontos korlátja, hogy a hús alapú miRNS-eknek csak relatív, nem pedig abszolút számszerűsítését adtuk meg. Elsődleges célunk az étkezési miRNS-ek stabilitásának és sokféleségének széles körű jellemzése az ehető állati szövetekben. Ezeket az adatokat ma már felhasználhatjuk alapként, hogy kiválasszuk a diétás miRNS-eket, amelyek a kvantitatív elemzéshez különös figyelmet fordítanak. Ez az erőfeszítés ma már sokkal megvalósíthatóbb a csepp digitális PCR technológia megjelenésével. Az étkezési miRNS-ek nettó dózisának pontos meghatározása az ehető állati termékekben, valamint biológiai hozzáférhetőségük elengedhetetlen a táplálkozási relevancia teljes értékeléséhez.

Összefoglalva, számos emberi homológ étrendi miRNS-t azonosítottunk a főtt hátszínben és a szárított szarvasmarha-szövet kivonatokban. Minden szövetről kiderült, hogy a miRNS-ek egyedi profilját tartalmazzák, és ezek a profilok a hagyományos serpenyős sütést és a gyors pasztörizálást követően nagyrészt érintetlenek maradtak. Ezeket a miRNS-eket az ehető állati szövetek egyedülálló alkotóelemének tekinthetik, de további kísérletekre lesz szükség annak pontos táplálkozási hatásainak meghatározásához.