Az endogén zsírszövet stromális progenitor sejtjei hozzájárulnak a tumor mikrokörnyezetét benépesítő pericitákhoz és adipocitákhoz

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízás a testzsír rendellenes felhalmozódásával jár. A hosszan tartó pozitív energiamérleg eredményeként a fehér zsírszövetben (WAT) lévő adipociták lipidcseppeket halmoznak fel, amelyek szisztémásan visszahatnak. A diszlipidémia, az inzulinrezisztencia és más szisztémás metabolikus változások az elhízás fontos hosszú távú következményei (1, 2). Az epidemiológia feltárta, hogy az elhízás, mivel a metabolikus szindróma alkotóeleme, a rák több típusának felgyorsult progressziójával jár (3, 4). Mind a rák (5), mind az elhízás (1) következtében kialakuló krónikus gyulladás állapota kulcsszerepet játszhat az elhízás és a rák összekapcsolásában (2). Azt is felvetették, hogy a WAT közvetlen hatással van a tumor növekedésére (6, 7); meggyőző bizonyítékok azonban hiányoztak (8, 9). A WAT egy erős endokrin szerv, amely szekretálja az adipokineket, például a citokineket és a növekedési faktorokat (1, 10). A leptint, az inzulinszerű növekedési faktorokat (IGF) és a szteroid hormonokat adipokinekként vizsgálták, amelyek potenciálisan szerepet játszhatnak a rákban (8–11). Például az IGF-1, amelynek szisztémás szintje megnő az elhízásban, elegendő a tumor növekedésének felgyorsításához a rákos modellekben (12).

A WAT szerepe a rák progressziójában a mai napig nem bizonyított. Tanulmányok, amelyek azt mutatják, hogy a daganat növekedését felgyorsítja az étrend által kiváltott elhízás (DIO), nem sikerült sikeresen leválasztani az étrend hatásait a WAT hatásairól (11, 31). Itt megmutatjuk, hogy a felesleges WAT elősegíti a tumor növekedését, az egerek étrendjétől függetlenül. A sejtek WAT-ból történő migrációjának vizsgálatához a rák progressziója során egy versenyképes újratelepítési modellt használtunk, amely nem támaszkodik invazív sejtinjekciókra. Megmutatjuk, hogy az endogén ASC-k toborzása az elhízásban fokozott vaszkularizációval és adipogenezissel jár együtt, rosszindulatú sejtek szaporodása kíséretében.

Anyagok és metódusok

Állatkísérletek

Az egérvizsgálatokat a Texasi Egyetem Állatjóléti Bizottsága (Houston, TX) keretében végezték. A C57BL/6, C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J (GFP egereknek), B6.Cg-Tg (ACTB-mRFP1) 1F1Hadj/J (RFP egereknek) és B6.129S7-Rag1tm1Mom törzsek/J (úgynevezett RAG-1 egerek) Jackson-ból származnak. A DIO indukciójához (32) magas zsírtartalmú étrendet (HFD) D12492 (60 kcal% zsír) és alacsony zsírtartalmú étrendet LFD (LFD) D12450B (10 kcal% zsír) használtunk a Research Diets-től. A testösszetételt az EchoMRI-100T (Echo Medical Systems) módszerrel mértük a leírás szerint (33). A daganat beültetéséhez 106 sejtet injektáltak egy 21-es méretű tűvel a hát felső részére (LLC és ID8) vagy az emlőzsír-párnára (E0771 és MDA-231). A daganat méretét féknyereggel mértük; a térfogatot a hosszúság × szélesség 2 × 0,52 értékkel számoltuk. A szöveteket kinyertük Avertinnel altatott egerekből. A sejteket a leírtak szerint izoláltuk a szövetekből (7, 14).

Sejtvonalak és primer sejttenyészet

Az E0771-et (az F. M. Sirotnaktól), az ID8-at (az F. C. Marinitől) és más rákos vonalakat (az American Type Culture Collection-től) Dulbecco 10% FBS-t tartalmazó Modified Eagle táptalajában tenyésztettük, és az állatok átültetésével és az azt követő tumor szövettanával hitelesítettük. A vért szívperfúzióval nyertük fel 10 ml PBS/EDTA-val, és a perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) izoláltuk a leírtak szerint (7, 30). A szövetszuszpenziókat a (7, 14) leírás szerint állítottuk elő. Az adipogenezis indukcióját és az olajvörös O festést a leírás szerint hajtották végre (14).

Áramlási citometria

A fluoreszcenciával aktivált sejtek szortírozásához (FACS) a sejteket előminősítették, hogy kizárják a törmeléket, a sejtcsomókat, a szennyező polimorfonukleáris sejteket, a vörösvérsejteket, valamint a 7-aminoaktinomicin D (7-AAD) festésen alapuló elhalt sejteket. A szövetsejt-szuszpenziókat, a WAT sztromális/vaszkuláris frakciót (SVF) eltávolított adipocitákkal (14) vagy a PBMC-ket FACSAria/FACSDiva szoftverrel (BD Biosciences) populációkba rendeztük vörös fluoreszcens fehérje (RFP) fluoreszcencia (Texas Red channel), GFP alapján. fluoreszcencia [fluoreszcein-izotiocianát (FITC) csatorna] és a következő IgG klónok: APC-anti-CD34 (RAM34), PE-Cy7-anti-CD31 vagy PE-anti-CD31 (MEC 13.3), APC-Cy7-CD45 (30) -F11), és a megfelelő izotípus kontrollok (BD Biosciences). Izotípusokat és a korábban jellemzett hematopoietikus és endotheliális populációk helyzetét a parcellákon (7, 14) használtuk a kapu levágásának beállítására.

Szövetelemzés

A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott szöveteket metszettük és immunfluoreszcenciával elemeztük a leírtak szerint (14). Elsődleges antitestként kecske anti-GFP-t használtunk (GeneTex, 1: 100); nyúl anti-RFP (Abcam, 1: 100); nyúl anti-Ki-67 (Thermo Scientific, 1: 100); kecske vagy nyúl anti-CD31 (Santa Cruz Biotechnology, 1: 100); nyúl anti-desmin (Abcam, 1: 200); és nyúl anti-perilipin (Cell Signaling Technology, 1: 100). Másodlagos szamár Alexa 488-konjugált (1: 150) IgG az Invitrogen és a Cy3-konjugált (1: 300) IgG a Jackson ImmunoResearch cégtől származik. Az atommagokat Hoechst 33258-mal vagy TO-PRO-3-mal (Invitrogen) festettük. A képeket konfokális Leica TCS SP5 mikroszkóp/LAS AF szoftverrel vagy az Olympus IX70 invertált fluoreszcens mikroszkóp/MagnaFire szoftverrel szereztük be. A számszerűsítéshez legalább 10 véletlenszerű × 100 nagyítási mezőt vakon pontoztak és/vagy mértek mikroszkóp rács segítségével.

A statisztikai elemzést egyfarkú homoszkedasztikus Student t teszt alkalmazásával végeztük.

Eredmények

Az elhízás étrendfüggetlen hatása a tumor növekedésére

Elhízáshoz kapcsolódó sejtmobilizáció és tumor infiltráció

Annak tesztelésére, hogy az ASC-k forgalma a WAT-ból a szisztémás keringésen keresztül, összehasonlító elemzést készítettünk-e a sovány és elhízott, daganatot hordozó egerek PBMC-jéről. A PBMC-k elemzése (S3A és S3B kiegészítő ábra) kimutatta, hogy míg a keringő CD34 + CD45-sejtek ritkák voltak sovány állatoknál (0,06%), gyakoriságuk 6-szorosára nőtt (0,37% -ra) az elhízásban (1F ábra). Ezeknek a sejteknek a többsége CD34 + CD31 - CD45 - ASC fenotípussal rendelkezett: a CD31 endotheliális markert csak elhízott egerekben csak a CD34 + CD45 - sejtek 5,9% -a fejezte ki (S3A. Kiegészítő ábra). A FACS által izolált egyes CD34 + CD31 - CD45 - sejtek elemzése morfológiát mutatott, amely megkülönböztethetetlen a WAT-tól párhuzamosan rendezett ASC-kétől (1G ábra). Vérből származó CD34 + CD31 - CD45 - sejtek kolóniákat képeztek és lipidcseppeket halmoztak fel az adipogén indukció után (1H ábra). A CD34 + CD31 - CD45 - adipocita progenitorok elhízással összefüggő kijutása határozottan sugallja ASC azonosságukat. Annak bizonyítására, hogy az ASC-ket tumorok toborozhatják, a tumorsejt-szuszpenziót áramlási citometriás elemzésnek vetettük alá. A daganatok valóban CD34 + CD31 - CD45 - sejteket tartalmaztak (S2. Kiegészítő ábra), és az elhízással járó gyakoriságuk növekedése összhangban volt lehetséges WAT eredetükkel.

Csontvelő-transzplantációs modell a WAT-ból származó sejtek nyomon követésére

A hematopoietikus tumor stroma (17, 18, 35, 36) nyomon követésének lehetővé tételéhez az ASC-kkel párhuzamosan egy in vivo kompetitív repopulációs vizsgálatot terveztünk. Ez az elhízás/rák modell 2 szingenikus egér törzsön alapszik: a gazda mindenütt expresszálja a GFP-t és a donor expresszálja az RFP-t. A csontvelő-transzplantációval előállított kiméra GFP/RFP egerekben (2A. Ábra) meg lehet különböztetni a hematopoietikus (RFP +) és a gazda (GFP +) sejteket. Úgy véltük, hogy ha feltételezzük, hogy a rákban az ASC forgalom feltételezhető, akkor az elhízáshoz a tumorokban a GFP + sejtek megnövekedett gyakorisága társul. DIO indukció és RFP csontvelő transzplantáció, majd 1 hónapos LFD és HFD helyreállítás után a GFP/RFP kimérákat étrend normalizálásnak vetettük alá, majd ortotóp módon oltottuk be az emlőbetétbe E0771 sejtekkel, ami egy szingén emlő adenokarcinómából származó vonal.

A WAT és a medulláris sejtek párhuzamos követése. A, transzplantációs rendszer. Az RFP (vörös) egerek csontvelőjét letálisan besugárzott sovány vagy elhízott (DIO) GFP egerekbe ültetik át, amelyeket az étrend normalizálása után daganatokkal oltanak be. Elhízott egerekben fokozódik a GFP + ASC-k (zöld) WAT-ból (sárga) való kereskedelme. Az elhízott GFP/RFP kimérából izolált szövetek és sejtek B, GFP (zöld) és RFP (piros) fluoreszcenciája (1 nappal a lemezezés után). A gazdasejt (zöld) és a donor (vörös) leukocitái (nyilai) és a gazdaszervezet ASC-jei (nyílhegyek) vannak feltüntetve. C, a keringő GFP + (FITC csatorna) sejtek áramlási citometrikus számlálása életképes PBMC-k között reprezentatív sovány és elhízott E0771 daganattal átültetett egerekből (balra) és az elhízott egér PBMC-jéből származó GFP + sejtek kapuzása a CD34 + ASC-k felsorolásaként a GFP + sejtek százalékos aránya (jobbra). SSC-A, oldalsó szórás. A sovány és elhízott egér (C) D-sejtjeinek összes GFP + sejtjét tenyésztettük 1 napig. GFP-fluoreszcens (zöld) tapadó monociták (nyilak) és ASC-morfológiájú sejtek (nyílhegyek) vannak feltüntetve. E, elhízott egér PBMC-eredetű GFP + sejtek nagy nagyítása 4 nappal a szélesztés után. F, lipidcseppképződés (*) egy elhízott egér PBMC-eredetű GFP + sejt ASC-k által képzett kolóniában 7 nappal az adipogenezis indukciója után. Méretarány, 50 μm.

A várakozásoknak megfelelően az összes egérszövetben RFP + és GFP + sejteket figyeltünk meg (S4A és S4B kiegészítő ábra). Az RFP + sejteket CD45 + leukocitaként igazolták, és a csontvelő sejtek kevesebb mint 0,5% -a volt GFP + (S4A kiegészítő ábra). A combcsont szakaszok hematopoietikus RFP + sejteket tártak fel a GFP + vaszkuláris, csont, izom és WAT sejtekhez képest (2B. Ábra). A tapadó WAT-eredetű sejtek mikroszkópos elemzése megmutatta a GFP + sejtek tipikus ASC-morfológiáját és a tapadó leukociták RFP-fluoreszcenciáját (2B. Ábra). Ezzel szemben a perifériás vérben csak ritkán tapadó GFP + sejteket figyeltek meg az RFP + leukociták között (2B. Ábra). Az apró tapadó fibroblasztoid RFP + monociták többsége, amelyeket szintén színtelen egereknél figyeltek meg (1D. Ábra), makrofágok voltak, amint ez az indiai festékfestésből és az F4/80 expresszióból kitűnik (S3B kiegészítő ábra).

A szín nélküli egerek adataival összhangban (1F ábra) megfigyeltük, hogy a keringő GFP + sejtek gyakorisága nagyobb az elhízott egereknél (1,2%), mint a sovány egereknél (0,3%) áramlási citometriával (2C ábra). Elhízott egerek PBMC-jeiben a GFP + sejtek 0,3% -ának volt ASC CD34 + CD31 - CD45 - immunfenotípusa, míg a többség CD45 + leukocita volt (2C. Ábra). Adherens sejtanalízis megerősítette, hogy míg sovány egerekben gyakorlatilag az összes keringő GFP + sejt monocita megjelenésű volt, az elhízott egerek PBMC-jében nagyobb GFP + fibroblasztok voltak jelen (2D. Ábra). Tipikus ASC megjelenésük 4 napos tenyésztés után hangsúlyossá vált (2E. Ábra). Az ASC-k (7, 14, 23) által expresszált fehérje-kollagént, alfa-simaizom aktint (α-SMA) és dekorint, fehérjéket a GFP + CD34 + CD31 - CD45 - sejtek kolóniáiban fejeztük ki (S5. Kiegészítő ábra). A lipidcseppek felhalmozódása a kibővített GFP + CD34 + CD31 - CD45 - sejtek adipogenezis indukciója során adipocita progenitorként (2F. Ábra) megerősítette őket ASC-ként.

Hematopoietikus és WAT-eredetű sejtek beültetése daganatokban

Az ASC toborzásával összefüggő tumor vaszkularizáció és sejtproliferáció

Masson trichrom festése összehasonlítható kollagén lerakódást mutatott sovány és elhízott állatok daganataiban (S7A kiegészítő ábra). Ez az elemzés az elhízott egerek vérzésének és nekrózisának kevésbé kiterjedt területeit is feltárta. Az immunfluoreszcencia-elemzés összehasonlítható fibronektin-lerakódásokat mutatott ki tipikusan GFP + sejtektől mentesen a daganatokban az egyes csoportokban (S7B kiegészítő ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a belső tumormátrix dezmoplasztikus átszervezését az elhízás nem befolyásolja jelentősen az alkalmazott modellekben.

A vérerek elengedhetetlenek az oxigén és a tápanyagok szállításához, az érrendszeri átjárhatóság pedig meghatározza a daganat növekedését (35, 37). Ezért megvizsgáltuk, hogy az ASC toborzás összefügg-e az érrendszer átalakításával. Elhízott egerekben az endothelsejtek nagyobb hányada származik a gazdaszervezetből, amint azt a CD31 és a GFP luminalis ko-lokalizációja mutatja (4A és B ábra). A sovány egerekben az erek ritkák voltak bizonyos daganatos területeken, míg elhízott egerekben a daganat egész tömegében bőven voltak (4A. Ábra). A mennyiségi meghatározás kétszeresen nagyobb vaszkuláris sűrűséget mutatott elhízott egerek daganataiban (4C. Ábra). A sovány egerekben a daganatok összenyomódtak és karcsúak voltak, míg elhízott egerekben hiperdilatáltabbak voltak (4C. Ábra), és keringő vérsejtekkel voltak tele (4A és B ábra). A desmin + GFP + sejtekre pozitív erek számbavétele (4D. Ábra) elhízott egerek daganataiban az erek fokozott érésének tendenciáját jelezte (4C. Ábra). Ezenkívül az α-SMA, az ASC-ken expresszált perivaszkuláris marker (7, 14, 23) expressziója elhízott egerekben nagyobb volt a perivaszkuláris GFP + sejteken (4E. Ábra). Ezek az eredmények együttesen megerősítik azt a gondolatot, hogy az ASC-k elhízásfüggő módon járulnak hozzá a tumorokban a perivaszkuláris sejtek készletéhez.

Az elhízott állatokban növekvő daganatokra vonatkozóan következetesen megfigyelték, hogy a tumor kapszulák lényegesen vastagabbak voltak, mint a sovány egereknél (3B., 5A. És B. Ábra). A daganat kapszula összetétele elhízott állatoknál is különbözőnek tűnt (S8A kiegészítő ábra). A vizuálisan nyilvánvalóan megnövekedett adipozitást immunfluoreszcenciával igazoltuk, amely azonosította a perilipint, az érett lipidcseppek markerét (5A. Ábra). Számos nagy GFP + sejtet is megfigyeltek a tumor egészében diszpergálva, és egyoldalú perilipin-pozitív lipidcseppeket tartalmaztak, amelyek adipocitaként jelezték őket. Míg az adipociták jelenléte a tumor perifériáján potenciálisan megmagyarázható a környező kötőszövet benövésével, a tumor magban rengeteg különálló adipocita jelenléte jelzi a differenciálódást a progenitorok beültetésével. Érdekes módon az adipocyták átlagos mérete jelentősen nagyobb volt az elhízott állatokban nőtt daganatokban (3. és 5. ábra), annak ellenére, hogy a diéta változóként kizárt.

Vita

Eredményeink azt mutatják, hogy az elhízás felgyorsíthatja a tumor növekedését, függetlenül az egyidejű étrendtől. Noha számos olyan szisztémás hatás van, amelyen keresztül az elhízás elősegítheti a rák kialakulását (34), ebben a tanulmányban a túlzott WAT potenciális szerepére összpontosítottunk. Feltételeztük, hogy a WAT az adipokinek szisztémás szekréciója mellett a tumorok által toborzott sejtek forrásaként szolgál, és lokálisan szekretált parakrin faktorok révén stimulálja a rákot. Míg a csontvelő a hematopoietikus sejtek jóhiszemű forrása, amelyek hozzájárulnak a tumor mikrokörnyezetéhez (18, 35, 36), eredményeink azt mutatják, hogy a mesenchymalis progenitorok toborzódnak a daganatokhoz, legalábbis részben a WAT-ból. A jelenségre vonatkozó bizonyítékok más friss jelentésekben is felmerültek (7, 22–24, 38). Az előző vizsgálatok azonban invazív, nem fiziológiai modellek adatain alapultak. Itt bizonyítékokkal szolgálunk az endogén WAT-ból származó ASC-kereskedelemről in vivo.

Adataink azt sugallják, hogy a megnövekedett ASC elérhetőség és az emberkereskedelem jelzésének kombinációja az ASC toborzásának nettó növekedését eredményezi az elhízásban. Eredményeink összhangban vannak a korábban megfigyelt sejttumor mikrokörnyezet összetételének az elhízásban bekövetkezett változásával (9, 39). Az ASC-k megfigyelt, elhízással összefüggő mobilizációja, a tumor stromában/érrendszerben való felhalmozódásával egyidejűleg azt jelzi, hogy a WAT hozzájárul a mesenchymalis tumorsejtek készletéhez. Adataink vitatják annak lehetőségét, hogy az infiltrálódó ASC-k szaporodása jelentősen növeli a daganatok megnövekedett bőségét. Bár valószínű, hogy az ASC-k szilárd szöveteken keresztül vándorolva behatolhatnak a tumorba a szomszédos WAT-ból, a rákos betegek mesenchymalis progenitorainak mobilizálásáról szóló legújabb jelentések (29, 40) egymástól függetlenül jelzik a véráramlást járulékos útként. Legfrissebb adataink azt sugallják, hogy a tumorsejtek által kiválasztott CXCL1 és interleukin (IL) 8 és a CXCR1 vagy CXCR2 receptorokon keresztüli szignálozás szerepet játszik az emberi omentális ASC-k vándorlásában (24), és a jövőbeni tanulmányok további alapokat fognak megalapozni.

A rák elleni ASC-kereskedelemre javasolt működő modell. A csontvelőn kívül a WAT a tumorok által toborzott sejtek forrása. Míg a tumor leukocitákat főleg a csontvelőből toborozzák, a mesenchymalis tumor stroma, a periciták és az adipocyták a WAT-ból vándorló ASC-kből származhatnak.

Összefoglalva, ez a tanulmány a WAT-eredetű sejtek tumorok általi toborzását állapítja meg, amelyek potenciálisan hozzájárulhatnak az elhízás rák progressziójára gyakorolt stimuláló hatásaihoz. Javasoljuk, hogy számos különféle ASC funkció járuljon hozzá az elhízásban megfigyelt tumor növekedés indukciójához. A WAT-eredetű sejtek látszólagos aktivitása a daganatokban felveti a lipotranszfer-eljárások biztonságosságát rákos betegeknél (45). A legújabb tanulmányok azt sugallják, hogy a WAT-eredetű sztróma szerepet játszik a rák áttétében (22), és az ASC-k célzott inaktiválásának megközelítéseinek kidolgozása lehetővé teszi specifikus szerepeik azonosítását a rák progressziójának különféle szakaszaiban. Javasoljuk az ASC-ket, mint potenciális terápiás célt rákban.

A lehetséges összeférhetetlenség nyilvánosságra hozatala

Potenciális összeférhetetlenséget nem hoztak nyilvánosságra.

A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

A szerzők közreműködése

Koncepció és tervezés: M.G. Kolonin

Módszertan kidolgozása: Y. Zhang, A. C. Daquinag, M. G. Kolonin

Adatgyűjtés (biztosított állatok, megszerzett és kezelt betegek, biztosított létesítmények stb.): Y. Zhang, A. C. Daquinag, F. Amaya-Manzanares, O. Sirin, C. Tseng, M.G. Kolonin

Az adatok elemzése és értelmezése (pl. Statisztikai elemzés, biostatisztika, számítási elemzés): Y. Zhang, A. C. Daquinag, F. Amaya-Manzanares, O. Sirin, C. Tseng, M.G. Kolonin

A kézirat megírása, áttekintése és/vagy átdolgozása: Y. Zhang, A. C. Daquinag, F. Amaya-Manzanares, O. Sirin, C. Tseng, M.G. Kolonin

Adminisztratív, technikai vagy anyagi támogatás (azaz adatszolgáltatás vagy -rendezés, adatbázisok összeállítása): Y. Zhang, F. Amaya-Manzanares, O. Sirin, C. Tseng, M.G. Kolonin

Tanulmányi felügyelet: Y. Zhang, M.G. Kolonin

Támogatás

A munkát az American Cancer Society CNE-119003 támogatása, valamint a texasi Cancer Prevention and Research Institute (CPRIT) RP100400 és RP110776 támogatásával támogatták.