Az étrend által kiváltott elhízott patkányok mint elhízási modell értékelése összehasonlító funkcionális genomikával

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Elhízáskutatás, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Elhízáskutatás, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Discovery Informatics, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Discovery Informatics, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Discovery Informatics, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Elhízáskutatás, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Elhízáskutatás, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Elhízáskutatás, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Discovery Informatics, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Integratív biológia, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Discovery Informatics, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Discovery Informatics, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Elhízáskutatás, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Absztrakt

Célkitűzés: Összehasonlító funkcionális genomikai megközelítést alkalmaztunk annak értékelésére, hogy az étrend okozta elhízott (DIO) patkányok hatékony elhízási modellként szolgálnak-e.

Módszerek és eljárások: A DIO-ból és a sovány patkányokból származó epididymális zsír gén-expressziós profilját mikro-sugarak segítségével állítottuk elő, és hasonlítottuk össze az elhízott és nem elhízott humán szubkután adipociták közzétett tömb adataival.

Eredmények: A kalóriabevitel és az üzemanyag-hatékonyság szignifikánsan magasabb volt a DIO patkányokban, ami megnövekedett testtömeget és zsírosságot eredményezett. A keringő glükóz, koleszterin, triglicerid, inzulin és leptin szintje a DIO patkányokban szignifikánsan magasabb volt, mint a lean kontrollokban. A DIO patkányok szintén csökkent inzulinérzékenységet mutattak. A DIO és a sovány patkányok, valamint az elhízott és nem elhízott emberek gén-expressziós profiljának közvetlen összehasonlítása azt mutatta, hogy a DIO patkány zsír globális génexpressziós mintázata hasonlít az elhízott emberi adipocytákhoz. Az elhízott és a nem elhízott alanyok között differenciáltan expresszált géneket mind humán, mind patkányos vizsgálatokban azonosítottak és társítottak a biológiai útvonalakhoz a gének Gene Ontology (GO) kategóriákhoz való hozzárendelésével. Az immunválaszhoz kapcsolódó gének és az angiogenezissel összefüggő gének szignifikáns upregulációt mutattak ki mind az elhízott emberekben, mind a DIO patkányokban, összehasonlítva a nem elhízott kontrollokkal. A zsírsav-anyagcsere és az oxidáció génjei azonban csak az elhízott emberi adipocytákban mutattak széles szabályozási rendszert, a DIO patkány epididymális zsírban azonban nem.

Vita: A gén-expresszió profilozásán alapuló vizsgálatunk azt sugallta, hogy a DIO patkányok általában megfelelő elhízási modellt képviselnek. A DIO patkányok és az elhízott emberek közötti gén-expressziós változások eltérései, különösen a metabolikus utakban, megmagyarázhatják a DIO rágcsáló modellek alkalmazásának korlátait az elhízás kutatásában és a gyógyszer felfedezésében.

Bevezetés

Jól felismerték, hogy az elhízás az inzulinrezisztencia magas kockázatával jár, amely anyagcsere-betegségekhez, például 2-es típusú cukorbetegséghez, valamint szív- és érrendszeri betegségekhez vezet ((10), (11)). A zsírszövetek nemcsak az elhízás etiológiájában, hanem annak patofiziológiai következményeiben is kritikus szerepet játszanak ((12)). Ebben a tanulmányban beszámolunk a DIO patkány epididymális zsír gén-expressziós változásainak vizsgálatáról, valamint az elhízott és nem elhízott pima-indiánoktól származó, korábban jelentett zsír-gén-expressziós profilokkal készített gén-expresszió-profil-adatok közvetlen összehasonlításáról ((13)), az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség magas prevalenciájú populációja. A tanulmány célja a DIO patkányok elhízási modellként történő értékelése a gén-expressziós profilok alapján. Ezenkívül a globális génexpressziós profilalkotási adatok fényt deríthetnek a génszabályozásra a betegség kialakulásában, és segíthetnek az új, elhízásra fogékony gének azonosításában.

Módszerek és eljárások

Állatok

Hím Long – Evans patkányok magántelepét Harlanban (Harlan-Sprague Dawley, Indianapolis, IN) hozták létre. Az állatok elválasztás óta magas zsírtartalmú/magas szacharóztartalmú étrenden (TD95217, Harlan Takled, Madison, WI) vagy rendes chow-n (Purina 5008; Ralston-Purina, St. Louis, MO) voltak. A patkányokat 14 hetes korukban szállítottuk a létesítményünkbe, és 12: 12-órás világos – sötét fényperiódus alatt tartottuk (fény 22: 00-kor). A vizsgálat során külön-külön szobahőmérsékleten helyezték el őket, és szabadon hozzáférhettek étrendjükhöz és vízükhöz. A létesítményhez való 2 hetes hozzáállás után a patkányok testtömegét és az előző 7 napban elfogyasztott táplálék tömegét hetente egyszer mértük. A testzsír tömegét magmágneses rezonanciával elemeztük egy Echo Medical System (Houston, TX) műszerrel a vizsgálat során háromszor. A zsírmentes tömeg a testtömeg és a zsírtömeg különbsége. Valamennyi állatkísérletet a jóváhagyott intézményi állatgondozásnak és az Országos Egészségügyi Intézet irányelveinek (NIH 86–23. Kiadvány, 1985) összhangban használt protokollokkal összhangban végezték.

Orális glükóz tolerancia teszt

Az orális glükóz-tolerancia tesztet egy éjszakai böjt után végeztük, amikor az állatok 21 hetesek voltak. A kiindulási vérvétel után (0. idő) az állatoknak orálisan adagoltuk 1,5 g/kg glükózt. Az ezt követő vérmintákat a glükóz-provokáció után 30, 60 és 120 perccel vettük a plazma glükóz- és inzulinszintjének meghatározására.

Az anyagcsere keringő mutatói

25 hetes korban a vért egy éjszakai böjt után farokvérzéssel vették fel. A patkányokat egy héttel később, 9: 00-kor megölték gyors lefejezéssel. A törzsvért összegyűjtötték, és a mellékhártya zsírszövetét kivágták. Különböző keringő anyagcsere paramétereket mértünk éhomi (25. hét) és táplált körülmények között (26. hét).

Microarray

A patkány epididimális zsírból származó teljes RNS-t RNS STAT-60 (Tel-Test) módszerrel izoláltuk a gyártó protokollja szerint. Öt mikrogramm teljes RNS-t jelöltünk és hibridizáltunk az Affymetrix RAE230_2 tömbökhöz az Affymetrix protokoll szerint. Minden mintát hibridizáltunk egyetlen mikrorajellel. Valamennyi mintát RNS-minőség, például mikroarray-skálázási tényezők, háttérszintek, jelenlévő hívások százalékos aránya, β-aktin és glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz 3 '/ 5' arányok alapján értékeltük. Azokat a mintákat, amelyek 3 ′/5 ′ aránya meghaladja a 3. küszöbértéket, kizártuk a további elemzésből. A nyers génexpressziós adatokat az NCBI Gene Expression Omnibus-ban rakták le (http: www.ncbi.nlm.nih.govgeoqueryacc.cgiaccGSE8700).

A metabolikus adatok statisztikai elemzése

Minden értéket átlag ± s.e.m.-ban fejezünk ki. A statisztikai elemzéseket egyirányú ANOVA-val, majd Tukey-val végeztük t-teszt.

Microarray adatok elemzése

Az integratív hierarchikus klaszterelemzést a Pearson-korreláció segítségével végeztük el, a távolságmetrikus és az átlagos összekapcsolási klaszterezés segítségével a Spotfire Decision Suite szoftverben. Az osztályozást Fisher diszkrimináns függvényével és az R statisztikai nyelven megvalósított támogató vektor gép algoritmussal végeztük. A hierarchikus klaszterezés és osztályozás elemzése előtt a tömbadatokat 0 és sd átlagértékre standardizálták. 1 minden próbapéldányra az összes mintában. Az adatok standardizálását külön végeztük az emberi és a patkány adatkészletekre. A génkészlet-dúsítási elemzést (GSEA) a Gsea szoftver (16) felhasználásával végeztük el. A statisztikai szignifikancia meghatározásához küszöbértékként hamis 0,1-es felfedezési arányt használtak.

Gén expresszió TaqMan valós idejű PCR-rel

Eredmények

Testtömeg és élelmiszer-fogyasztás

Három hetes korban a hím Long – Evans patkányokat 26 hetes korukig magas zsírtartalmú étrendbe (DIO patkányok) vagy egy szokásos alacsony zsírtartalmú csecsemőbe (sovány patkányok) rendelték. Azokat az állatokat választottuk ki, akiknek a DIO csoportban a legjelentősebb a súlygyarapodása, a két csoport közötti különbségek maximalizálása érdekében. 16 hetes korban a sovány patkányok súlya 443,2 ± 5,0 g, a DIO patkányoké pedig 588,1 ± 4,9 g (P

kiváltott

: (a) Testsúly, (b) kalóriabevitel, és (c) az üzemanyag-hatékonyság sovány és diétával indukált elhízott (DIO) patkányokban. Az értékeket átlag ± s.e.m.-ban fejezzük ki. A testtömeg minden időpontban jelentősen eltér (P

Test felépítés

A teljes testösszetétel-elemzések azt mutatták, hogy a DIO patkányok körülbelül kétszeresei voltak a sovány csoportban levők testtömegének (P

: (a) Zsírtömeg, (b) zsírszázalék, (c) zsírmentes tömeg, és (d) zsírmentes tömegszázalék sovány és diétával indukált elhízott (DIO) patkányokban. Az értékeket átlag ± s.e.m.-ban fejezzük ki. A megfelelő paraméter értékei minden időpontban jelentősen eltérnek (P

Metabolikus mutatók és inzulinérzékenység

Az éhomi plazma glükóz, az összes koleszterin, a triglicerid, az inzulin és a leptin szintje szignifikánsan megemelkedett a DIO patkányokban, összehasonlítva a sovány állatok 25 hetes életkorával. A táplált állatokban az összes koleszterin, triglicerid, inzulin és leptin szintje szignifikánsan magasabb volt a DIO patkányokban (P (13).

Csoportok Glükóz (mg/dl) Chol (mg/dl) Trig (mg/dl) Inzulin (ng/dl) Leptin (ng/ml) Gluca (pg/ml) Adip (μg/ml) FFA (μEq/l) GH (ng/ml)
Böjtölt
Sovány 134,6 ± 4,1 76,2 ± 2,4 112,6 ± 6,1 0,6 ± 0,2 5,0 ± 0,5 52,4 ± 3,5 3,3 ± 0,2 860,2 ± 49,4 2,8 ± 0,9
DIO 162,9 ± 3,6 102,9 ± 3,7 * 223,0 ± 29,5 * 3,3 ± 0,3 * 19,2 ± 1,5 * 50,4 ± 4,2 4,7 ± 0,3 * 821,8 ± 38,4 3,4 ± 0,9
Fed
Sovány 156,9 ± 3,6 75,4 ± 2,0 263,3 ± 25,2 2,9 ± 0,3 10,9 ± 1,9 81,6 ± 8,2 1,7 ± 0,2 257,2 ± 12,2 3,2 ± 1,8
DIO 153,4 ± 3,5 103,8 ± 1,8 * 470,5 ± 61,2 * 4,2 ± 0,6 * 29,4 ± 1,2 * 81,4 ± 5,6 3,0 ± 0,3 * 510,0 ± 29,2 * 6,0 ± 3,1
  • Adip, adiponektin; Kol, koleszterin; FFA, szabad zsírsav; GH, növekedési hormon; Glükó, glükagon; Trig, triglicerid.
  • * P

: (a) Plazma glükóz és (b) inzulin az orális glükóz tolerancia teszt során sovány és diétával indukált elhízott (DIO) patkányokban. Az értékeket átlag ± s.e.m.-ban fejezzük ki. A glükóz és az inzulin szintje minden időpontban jelentősen eltér (P

DIO patkányok és emberi elhízás gén-expressziós profilalkotása

: Integratív klaszterelemzés. (a) 39 humán minta és 15 patkány minta hierarchikus csoportosítása. Az adatokat mátrix formátumban mutatjuk be, ahol az oszlopok az egyes mintákat, a sorok pedig a tömbök szondáit ábrázolják. A piros és a zöld szín magas, illetve alacsony kifejezést jelez. Az adatokat 0 és SD átlagértékre standardizáltuk. az 1-ből, ahogy azt a módszerek és eljárások leírják. (b) A klaszterelemzés oszlopdendrogramja. Összesen 54 mintát választottak két fő klaszterre. Az egyes minták azonosítását felcímkézzük és színkóddal látjuk el. DIO, diéta okozta elhízott.

Bár az elhízott, differenciálisan expresszált gének átfedései az emberi és a patkány adatkészletek nem elhízott összehasonlításaihoz képest minimálisak, lényeges átfedés van a GO kategóriák között, amelyekhez a differenciálisan expresszált géneket feltérképezték. Az immunválaszhoz kapcsolódó GO kifejezések felülreprezentáltak voltak a szabályozott génekben mind DIO patkányokban, mind elhízott emberekben (2. táblázat). Az angiogenezisben és a morfogenezisben szerepet játszó GO biológiai folyamatok azonban felülreprezentált génekben csak az emberi elhízásnál voltak felülreprezentáltak, a DIO patkányoknál azonban nem (2. táblázat). Ezenkívül a lipid anyagcseréhez kapcsolódó GO kategóriák, mint például a zsírsavcsere és az oxidáció, csak azokban a génekben voltak felülreprezentáltak, amelyeket elhízott emberi adipocitákban szabályoztak (3. táblázat).

Alulszabályozás étrend által kiváltott elhízott patkányokban Alulszabályozás elhízott emberben
Egyik sem Az anyagcserével kapcsolatos
Szerves sav anyagcsere
Zsírsav anyagcsere
Karbonsav anyagcsere
Lipid anyagcsere
Zsírsav oxidáció

: Angiogenezissel összefüggő gének expressziója étrend által kiváltott elhízott (DIO) és sovány patkány zsírszövetekben. Az összes gén (szürke) és az angiogenezissel kapcsolatos gének (piros) átlagos expresszióját ábrázoljuk DIO patkányok és sovány patkányok esetében. Minden pont egyetlen gént jelent. x-Tengely és y-Tengelyek képviselik az egyes gének átlagos expressziós értékeit a lean, illetve a DIO csoportokban. Az átlós vonalon lévő gének azonos szinten expresszálódtak a DIO és a lean csoportokban.

A mikroarray gén-expressziós adatok validálása reverz transzkripció-PCR segítségével

: A mikroarray gén-expressziós adatok validálása valós idejű PCR-analízissel. A génexpressziós szinteket a célgén és a 60S savas riboszomális foszfoprotein (ARBP) arányában képviseljük. A célgén expressziós szintjét sovány patkányokban önkényesen 1 értéknek adták. Statisztikai szignifikancia (P

Vita

Míg tanulmányunk a DIO patkányok génexpressziójára összpontosított, áttekintettük a DIO egerek zsírszövetének mikroarray expressziós profilozására vonatkozó irodalmat. A gyulladásos gének megemelkedett expressziójáról több publikáció számolt be ((4), (5), (22)), összhangban a DIO patkányokban és elhízott emberekben tapasztaltakkal. Noha a lipid anyagcsere génjei, mint például a leptin és a lipoprotein lipáz, fokozott expressziót mutattak a magas zsírtartalmú étrenddel etetett egerekben ((8)), egy másik tanulmány azt mutatta, hogy az adipozitáshoz és az adipogén markerekhez kapcsolódó transzkripciós faktorok alig mutattak változást az expresszióban ((6) ). A mikroarray adatokra azonban különböző elemzési módszereket és statisztikai szűrési kritériumokat alkalmaztak. Ezenkívül az állatokat különböző ideig magas zsírtartalmú étrenddel etették. Ezért nehéz határozott következtetéseket levonni, ha összehasonlítjuk a DIO patkány adatainkat a jelentett DIO egér vizsgálatokkal. Jelenleg tervezünk egy mikroarray kísérletet végezni DIO egerek zsírszövetén, ugyanazon kísérleti terv alapján, és szisztematikus összehasonlító funkcionális genomikai elemzést alkalmazunk a gén-expresszió változásainak hasonlóságának értékelésére DIO patkányokban, DIO egerekben és elhízott emberekben.

Összefoglalva, molekuláris kapcsolatot hoztunk létre a DIO patkány modell és az emberi elhízás között. Vizsgálatunk nemcsak azt sugallja, hogy a DIO patkányok nagymértékben képviselik a megfelelő elhízási modellt, hanem útmutatást nyújtanak a kísérleti modellrendszerek összehasonlító funkcionális genomikai megközelítéssel történő értékelésének jövőbeli erőfeszítéseihez is.

KIEGÉSZÍTŐ ANYAG

A kiegészítő anyag a cikk online változatához kapcsolódik a http: www.nature.comoby címen.

KÖZZÉTÉTEL

A szerzők nem jelentettek összeférhetetlenséget.