Az étrend okozta zsírosodás növekedés, de nem a plazma lipidek, elősegítik a makrofágok beszivárgását a fehér zsírszövetbe

Absztrakt

ATM, zsírszövetben rezidens makrofág
LDLR, LDL receptor
MCP-1, monocita kemoattraktáns protein-1
MIP-1α, makrofág gyulladásos fehérje-1α
NEFA, nem észterezett zsírsav
NMR, magmágneses rezonancia
RIA, radioimmunassay
SAA, szérum amiloid A
TBO, toluolidin kék O
TNF-α, tumor nekrózis faktor-α
VDDRC, Vanderbilt emésztőrendszeri kutatóközpont
WAT, fehér zsírszövet

Az elhízás az egészségügyi ellátás egyik fő problémája, mivel összefügg a metabolikus szindrómához kapcsolódó egyéb kóros állapotokkal. Az elhízással járó kockázati tényezők között szerepel a dyslipidaemia, a gyulladáscsökkentő állapot, a magas vérnyomás és az inzulinrezisztencia (1,2). Az elhízásban észlelt diszlipidémiát a nem észterezett zsírsavak (NEFA-k), a trigliceridek és a kis sűrű LDL-részecskék emelkedett szintje, valamint a csökkent HDL-szint (1-3) jellemzi. A metabolikus szindróma egyes komponensei független kockázati tényezők a cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek szempontjából; ha azonban ezek az elemek párhuzamosak, additív vagy akár szinergikus hatásuk is van (2). Valójában a családi kombinált hiperlipidémiában szenvedő személyek inzulinrezisztensebbek a normolipidémiás rokonokhoz képest, még a BMI korrigálása után is (4). Sőt, az inzulinérzékenység lényegesen alacsonyabb az elhízott hiperlipidémiás alanyoknál, mint a nem elhízott hiperlipidémiás egyéneknél (5). Ezért mind az elhízás, mind a hiperlipidémia additív hatást gyakorolhat az inzulinrezisztenciára.

A legújabb vizsgálatok az elhízás különféle formáit tárták fel, és az elhízott rágcsálók és az emberek fehér zsírszövetében (WAT) megnövekedett makrofágszinteket találtak a sovány kontrollokhoz képest (6–13). Ezenkívül több tanulmány megállapította, hogy a zsírszövetben rezidens makrofágok (ATM) az elhízott állapotban felelősek a WAT gyulladásos citokintermeléséért (8,10,14,15). Továbbá bebizonyosodott, hogy a makrofágok WAT-ba való beszivárgása megelőzi az elhízott egerek inzulinrezisztenciáját vagy egybeesik azzal (10). Kimutatták, hogy a súlycsökkenés csökkenti az ATM felhalmozódását és javítja az emberek gyulladásos állapotát, megszilárdítva az elhízás és a WAT makrofágok beszivárgásának összefüggését (6,12,16). Ezenkívül az inzulinrezisztens emberek kezelése az inzulinérzékenységet fokozó peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor γ agonistával, a pioglitazonnal az inzulinérzékenység javítása érdekében csökkentette az ATM felhalmozódását is (13). Úgy tűnik tehát, hogy az ATM-ek kulcsszerepet játszanak az elhízással és a metabolikus szindrómával járó kórélettani állapotokban.

Bár a makrofágok WAT-ba való beszivárgásának kutatása jelenleg kiemelkedő, a metabolikus szindróma egyéb komponenseinek, például a hiperlipidémiának az elhízott állapot ATM-tartalmára gyakorolt lehetséges hatásai még tisztázatlanok. Az éhomi hipertrigliceridémia gyakran társul a visceralis adipozitás megnövekedésével, összekapcsolva a hiperlipidémiát az adipozitással kapcsolatos rendellenességekkel (17,18). A plazma triglicerid szintje függetlenül kapcsolódik a gyulladáshoz, és növelhető akut fertőzés során vagy több gyulladásos citokin kitettségének hatására (19). Ezenkívül a plazma lipidszintjeinek statinokkal történő gyógyszeres csökkentése kimutatta, hogy csökkenti a plazma gyulladásos citokinszintjét (20). Végül Cancello és munkatársai nemrégiben készített jelentése. (7) erős pozitív korrelációt mutatott az ATM-szám és a plazma trigliceridszint között, valamint negatív korrelációt a HDL-koleszterinnel elhízott embereknél. Ezek a megfigyelések arra a hipotézisre vezettek bennünket, hogy a hiperlipidémia elősegítheti a makrofágok WAT-ba történő beszivárgását elhízott állapotban, és hogy a gyulladás és a hiperlipidémia kapcsolatának egy része a megnövekedett ATM felhalmozódásnak tulajdonítható.

Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez egérmodellek sorozatát alkalmaztuk növekvő elhízással és hiperlipidémiával, hogy meghatározzuk a hiperlipidémia hozzájárulását az ATM felhalmozódásához. Ezeknek az egereknek az elemzése feltárta, hogy a makrofágok beszivárgása összefügg az adipozitás mértékével; ezek a hatások azonban függetlenek voltak a hiperlipidémia mértékétől. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a hiperlipidémia nem növeli a makrofágok WAT-ba történő toborzását az elhízásban ebben a modellrendszerben. Ezenkívül adataink rávilágítanak arra a tényre, hogy a túlzott étkezési zsírbevitel elősegítheti a zsírszövet diszfunkcióját, helyi és szisztémás gyulladáshoz, valamint hiperinsulinémiához és csökkenő adiponektinszinthez vezethet, a plazma lipidszintjétől függetlenül.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Egerek és diéták.

Az ezekben a vizsgálatokban használt egereket a Jackson Laboratories-tól (Bar Harbor, ME) szereztük be, és C57BL/6 háttérrel rendelkeznek. A vad típusú egerekhez hasonlóan az LDL receptor (LDLR) -/- egerek hajlamosak az étrend okozta elhízásra és inzulinrezisztenciára. Emellett hiperlipidémiát is kialakítanak (21,22), ami hasznos modellt jelent számukra az együttes elhízás és a hiperlipidémia fiziológiai következményeinek tanulmányozásához. Az A y/a; LDLR -/- egereket úgy állítottuk elő, hogy elhízásra hajlamos agouti sárga egereket (A y/a) kereszteztünk LDLR -/- egerekkel. Az egereket ad libitum etették és szabad hozzáférést kaptak a vízhez. A nyugati étrendet a Harlan-Teklad cégtől vásárolták (TD88137), és 4,8 kcal/g kalóriasűrűségűre állították. A kalória 42% -a vízmentes tejzsír zsírforrásából és 0,15% hozzáadott koleszterinből áll. Minden állatgondozási és kísérleti eljárást a Vanderbilt Egyetem Intézményi Állatgondozási és Használati Bizottságának jóváhagyásával és az előírások szerint hajtottak végre.

Test felépítés.

A teljes sovány szövet tömegét, a zsírt és a szabad folyadékot magmágneses rezonanciával (NMR) határoztuk meg a Minispec (Bruker, The Woodlands, TX) alkalmazásával, a Vanderbilt Egyetem Egér Metabolikus Fenotipizáló Központjában.

Plazma gyűjtés és mérések.

Az egereket 5 órán át éheztettük minden vérvétel előtt és leölésük után. Az egereket heparinizált kapilláris gyűjtőcsövek segítségével elvettük a retro orbitális vénás plexusból. A plazmát centrifugálással elválasztottuk, alikvotizáltuk és -80 ° C-on tároltuk. Az összes mintán elvégeztük a lipid- és glükózanalízist (1. és 2. táblázat). A teljes plazma koleszterin- és trigliceridszintet Raichem (San Diego, Kalifornia) enzimkészleteivel mértük a gyártó utasításainak megfelelően. A NEFA méréseket a Wako NEFA-C készletével végeztük (Neuss, Németország). A glükózszinteket Lifescan OneTouch glükométerével (Johnson és Johnson, Northridge, Kalifornia) határoztuk meg. Az inzulin és a leptin mérését megfelelő térfogatú mintákon végeztük radioimmun assay (RIA) alkalmazásával. A szérum amiloid A (SAA) elemzéseket enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal végeztük, az R&D Systems (Minneapolis, MN) poliklonális antitestjét használva rekombináns egér SAA1 ellen (1: 2 000 hígítás). Másodlagos kecskeellenes antitestet alkalmaztunk 1: 4000 hígításban (23).

Adiponektin mérés.

A plazmamintákat nem denaturált, nem redukált 4–12% SDS géleken végeztük elektroforézissel. A fehérjét nitrocellulóz membránokra vittük, és nyúl anti-egér adiponektinnel (ABCAM, Cambridge, MA) próbáltuk 1: 2 000 hígítás mellett. Másodlagos antitestet használtunk 1: 5 000 hígításban, és a jelet ECL reagensek segítségével detektáltuk (Amersham, Egyesült Királyság). A sávokat a Quantity One szoftver (Bio-Rad) segítségével számszerűsítettük.

A zsírszövet hisztokémiája.

A kivágott hasi WAT-ot 10% formalinban tároltuk, majd paraffinba ágyazottuk. A paraffin szakaszokat rögzítettük és Toluidine Blue O-val (TBO) festettük a gyártó utasításainak megfelelően (Newcomer Supply, Middleton, WI). Az F4/80 immunhisztokémiai festését Serotec (Raleigh, NC) antitesttel végeztük 1: 100 hígítás mellett. Másodlagos antitestet (Dako, Glostrup, Dánia) használtunk 1: 100 hígításban.

Gén expresszió.

Az RNS-t a zsigeri WAT-ból izoláltuk az RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) segítségével a gyártó utasításainak megfelelően. Valós idejű, kvantitatív RT-PCR-t az ABI Prism7700 szekvencia detektáló rendszer (Applied Biosystems, Foster City, CA) alkalmazásával hajtottunk végre. Az alapozó szondákat (Assays-on-Demand) az Applied Biosystems-től vásároltuk. A gének expresszióját összehasonlítottuk a 18S kontrollokkal a korábban leírt ΔΔCT módszerrel (24). Az interplátum variábilitás lehetőségének kiküszöbölése érdekében mind a hat csoportot egy lemezen amplifikáltuk minden gén esetében (korlátozva az egyes csoportokból származó minták számát).

Statisztika.

A statisztikai elemzéseket GraphPad Prism 4 szoftverrel (San Diego, Kalifornia) és a SMP (Cary, NC) JMP szoftverével végeztük. Az adatokat átlag ± SE-ként fejezzük ki, és szignifikánsnak tekintettük P -/- egereknél.

Genetikai és diétás manipulációkat használtak annak meghatározására, hogy a hiperlipidémia hozzájárul-e a makrofágok WAT-ba való beszivárgásához az elhízás során. Az elhízásra hajlamos egereket, amelyek mindenütt és ektopikusan expresszálják az agouti fehérjét (A y/a), kereszteztük hiperlipidémiára hajlamos LDLR-hiányos (LDLR -/-) egerekkel. 4 hónapos korban hím A y/a; LDLR -/- egereket és kontroll (a/a) alomtársakat, a/a; LDLR -/-, vagy chow étrenden tartottak, vagy magas zsírtartalmú, Western diéta 12 hétig. Az eredményül kapott négy kísérleti csoport a következő volt: 1) a/a; LDLR -/- egerek chow étrenden, 2) A y/a; LDLR -/- egerek chow étrenden, 3) a/a; LDLR -/- egerek nyugati étrenden és 4) A y/a; LDLR -/- egerek nyugati étrenden.

A táplálkozás végén a testtömeget, az összes testzsírt, az összes plazma koleszterinszintet, a plazma triglicerideket és a NEFA-kat mértük (1. táblázat). Minden esetben az A y/a egerek nehezebbek voltak, mint az a/a kontrolljuk, és a nyugati étrenddel táplált egerek nehezebbek voltak, mint a chow diétával táplált kontrollok. Ez a testtömeg fokozatos növekedését eredményezte az a/a; LDLR -/- chow étrend egerekből az A y/a; LDLR -/- nyugati diéta egerekbe. A súlygyarapodás növekedését a teljes testzsír növekedésének tulajdonították, ami az adipozitás mértéke, NMR-analízissel meghatározva.

A makrofág markerek kvalitatív és kvantitatív elemzése WAT-ban.

A TBO képek alapján kiderült, hogy az A y/a; LDLR -/- nyugati étrend-csoport szignifikánsan nagyobb ATM-tartalommal rendelkezik, mint a többi csoport, ami arra utal, hogy a hiperlipidémia fokozhatja a makrofágok WAT-ba történő beszivárgását. Ezek az egerek azonban elhízottabbak is voltak, mint a többi csoport. Így további két csoportot adtunk hozzá: 1) a/a, LDLR +/+ egerek, amelyek nyugati étrendet tápláltak; és 2) egy y/a; LDLR +/+ egerek táplálták nyugati étrendet. A testtömeg és az összes testzsír valamivel magasabb volt a nyugati étrenddel táplált LDLR +/+ csoportokban, mint a nyugati étrenddel táplált LDLR -/- csoportokban; azonban a nyugati étrendi táplálék nem növelte a plazma lipidszintet az LDLR-k jelenléte miatt (2. táblázat).

A kezdeti négy csoportból származó WAT TBO festése után mind a hat csoportból a hasi WAT specifikusabb immunhisztokémiai jellemzését végeztük az F4/80 makrofág felszíni marker antitestjeivel (2A – L ábra). Hasonló morfológiai különbségeket és a makrofágok beszivárgásának mértékét detektáltuk az A y/a; LDLR +/+ Western diéta egerekben, mint azt az A y/a; LDLR -/- Western étrendben észleltük (2. ábra, hasonlítsuk össze F és L E és K).

Az F4/80 és CD68 makrofág markerek génexpressziójának kiértékeléséhez mind a hat csoportból hasi WAT-ot is gyűjtöttünk kvantitatív RT-PCR alkalmazásával. A testtömeg és az összes testzsír fokozatos növekedését tükrözve (1. és 2. táblázat) az F4/80 és a CD68 expressziója növekményes növekedést mutatott (2M és N ábra).

A nyugati étrenddel táplált LDLR +/+ egerek kissé nagyobb testtömege és zsírossága miatt az LDLR -/- egerekhez képest az egerek alcsoportjait a teljes testzsír-tömeg alapján választottuk ki, így nem volt szignifikáns különbség a az egyes részhalmazok közötti átlagos testzsírtömeg. A közepesen elhízott hiperlipidémiás a/a; az LDLR -/- nyugati étrend-csoport átlagos testzsír-tömegét a normolipidémiás a/a; LDLR +/+ nyugati étrend-csoporthoz illesztettük. Hasonlóképpen, a súlyosan elhízott hiperlipidémiás A y/a; LDLR -/- nyugati étrend-csoport átlagos testzsír-tömegét a normolipidémiás A y/a; LDLR +/+ nyugati étrend-csoporthoz illesztettük (3A. És B. Ábra; a/a; LDLR -/- chow étrend és A y/a; LDLR -/- chow étrend referenciaként szerepel. Az adipozitás szabályozásával meghatározható a hyperlipidaemia specifikus hozzájárulása az ATM felhalmozódásához közepes és súlyos elhízás esetén. Az F4/80 és CD68 expresszió értékelése az adipozitással egyező csoportokban azt mutatta, hogy a hiperlipidémia nem növelte az ATM felhalmozódást az LDLR -/- egerekben normolipidémiás LDLR +/+ kontrolljukhoz képest (3C. És D ábra). Valójában az F4/80 expresszió megemelkedett a normolipidémiás A y/a; LDLR +/+ Western diétás csoportban, összehasonlítva a hiperlipidémiás A y/a; LDLR -/- Western diéta csoporttal (3C. Ábra).

Az ATM-tartalom korrelációja a plazma lipidszintjével.

VITA

Ebben a modellrendszerben a súlyosan elhízott egerek WAT-jában egyértelműen több makrofág volt, mint a közepesen elhízott egerekben, de a közepes elhízásban tapasztalt erős összefüggés az adipozitás és az ATM felhalmozódás között nem volt jelen. Ezek az adatok arra utalnak, hogy nincs felső határ abban, hogy a makrofágok milyen mértékben halmozódhatnak fel a WAT-ban; felhalmozásukhoz hozzájáruló tényezők azonban az elhízás mértékétől függően eltérőek lehetnek. Valószínű, hogy a közepes elhízásban megfigyelhető korai makrofág-toborzást az adipociták vezérlik, ezért szoros összefüggés van az ATM és az elhízás között. Valójában laboratóriumunk publikálatlan adatai azt mutatják, hogy az adipokin-leptin erős monocita kemoattraktáns. Ezzel szemben az erősen elhízott egerekben az ATM-ek eltúlzott növekedése az adipozitás növekedéséhez képest azt sugallja, hogy maguk a makrofágok lesznek a diktáló tényezők további makrofágok toborzásának terjesztésében.

Megfigyeltük azt is, hogy a lokális és szisztémás gyulladás mintázata jobban tükrözte a makrofágok WAT-ba történő beszivárgásának mértékét, mint a plazma lipidszintje. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az ATM-ek a WAT-ban található gyulladásos citokinek többségét választják ki (8,10,14,36). Nyugati étrendünkkel táplált A y/a; LDLR -/- és A y/a; LDLR +/+ állatokban drámai növekedést észleltünk a TNF-α, MCP-1, MIP-1α és SAA3 expresszióban. Valójában az MCP-1 és MIP-1α kemokinek mRNS-expressziója legalább 11-szer, illetve 18-szorosan emelkedett a WAT-ban ezekből a csoportokból, összehasonlítva a sovány a/a; LDLR -/- chow étrenddel. Az akut fázisú SAA3 reagens génexpressziós szintje legalább 64-szeres volt a súlyosan elhízott egerekben. Ezek az adatok összhangban állnak azzal az elképzeléssel, hogy az ATM-ek vészjeleket küldenek, ezáltal felerősítve a makrofágok toborzását a WAT-ba. A gyulladással kapcsolatos TLR4 receptor expressziója szintén megnőtt a WAT-ban a nyugati diétával táplált egereknél. Ezek az adatok együttesen azt bizonyítják, hogy a nyugati táplálékkal táplált egerek fokozott gyulladásos állapotban voltak, mind a gyulladásos ingerek felszabadításával, mind észlelésével. A WAT gyulladásos állapotának jelentősége a downstream különböző hatásainak függvénye, például az inzulinrezisztencia.

A WAT-ban a makrofágok felhalmozódása szorosan összefügg az inzulinrezisztenciával, és felveti a kérdést, hogy a WAT-ba történő makrofág-infiltráció megelőzi-e az inzulinrezisztenciát, vagy az inzulinrezisztencia megelőzi-e az ATM felhalmozódását. Xu és mtsai. (10) kimutatták, hogy a makrofágok jelenléte a WAT-ban idő előtt megelőzte a hiperinsulinémia kialakulását egerekben. Ezzel szemben Di Gregorio és mtsai. (13) kimutatták, hogy az inzulinrezisztencia tiazolidinedion-kezelése embereknél a makrofágok csökkent behatolását eredményezi a WAT-ba. Így a makrofágok WAT-ban történő felhalmozódása elősegítheti az inzulinrezisztenciát, az inzulinrezisztencia pedig súlyosbíthatja a makrofágok beszivárgását, ami ördögi kört hoz létre. Vizsgálataink során az elhízott egerek az inzulinrezisztencia elleni védelem elvesztését mutatják, amit a csökkent adiponektinszint bizonyít (6.D ábra). Ezenkívül a plazma inzulinszintje (6B. Ábra) nőtt az ATM-tartalmat tükröző módon (2M és N ábra). Ezek az adatok együttesen alátámasztják az inzulinrezisztencia és a makrofágok WAT-ba való beszivárgása közötti kapcsolatot.

Az étrendi manipulációk hatását ebben az egérmodellben nem szabad figyelmen kívül hagyni. A nyugati étrend ebben a vizsgálatban használt zsírforrása 69% telített zsírsavból, 27% egyszeresen telítetlen zsírsavból és 4% többszörösen telítetlen zsírsavból áll. A telített zsírsavakról hagyományosan ismert, hogy káros hatással vannak az egészségre, de újabban kifejezetten szerepet játszanak a TLR4 aktiválásában, ami a gyulladásos géntermékek kifejeződéséhez vezet (38,39). A telített zsírsavak nemcsak a TLR4-et aktiválhatják, hanem a többszörösen telítetlen zsírsavak is gátolhatják a TLR4 aktiválódását (39,40). Érdekes módon a TLR4 expresszió szorosabban kapcsolódott a magas zsírtartalmú étrend táplálásához, mint az zsírosodáshoz (5.C ábra). A kézirat elkészítése során Flier és munkatársai (41) kulcsszerepet mutattak a TLR4 és az ATM felhalmozódása szempontjából a magas zsírtartalmú étrenddel táplált egerekben. Így lehetséges, hogy az ATM-eken jelen lévő TLR4 aktiválódik a telített zsírsav fluxus növekedésével a nyugati táplálékkal táplált egerekben.

Adataink összességében azt sugallják, hogy a hiperlipidémia nem járul hozzá az elhízás által vezérelt ATM felhalmozódáshoz és annak downstream patofiziológiai következményeihez, például gyulladáshoz és inzulinrezisztenciához. Ezeknek az adatoknak fontos következményei lehetnek a diéta okozta elhízás patogenezisében, még akkor is, ha a plazma lipid rendellenességei nincsenek jelen.