Az étrendi kitozán-kiegészítés növeli a mikrobiális sokféleséget és gyengíti a Citrobacter rodentium Fertőzés egerekben

1 Biológiai és Biotechnológiai Főiskola, Hunan Mezőgazdasági Egyetem, Changsha, Hunan 410128, Kína

2 Agroökológiai folyamatok kulcsfontosságú laboratóriuma a szubtrópusi régióban, a Kínai Tudományos Akadémia Szubtrópusi Mezőgazdasági Intézete, az egészséges állattenyésztés Hunan tartományi mérnöki kutatóközpontja, az állat-táplálkozás és takarmányozás tudományos megfigyelő és kísérleti állomása Dél-Középen, Mezőgazdasági Minisztérium, Hunan Állattenyésztés-biztonsági Co-Innovációs Központ, Hunan 410125, Kína

3 Hunan Állat- és Állatorvos-tudományi Intézet, Changsha, Changsha 410131, Kína

4 Botanikai és Mikrobiológiai Tanszék, Addiriyah Környezettudományi Tanszék, Tudományos Főiskola, King Saud University, P.O. Doboz. 2455, Rijád 11451, Szaúd-Arábia

Absztrakt

A C57BL/6 egereket megvizsgáltuk az étrendi kitozán (COS) kiegészítők bél mikroflóra és a Citrobacter rodentium fertőzés. Az eredmények azt mutatják, hogy a 300 mg/kg COS étrend 14 napos fogyasztása után a mikroflóra változatosabbá vált a kiegészítés eredményeként. A COS-t kapó egereknél nőtt a Bacteroidetes és a Firmicutes családok aránya. Után Citrobacter rodentium fertőzés, a hisztopatológiai pontszámok azt mutatták, hogy a COS táplálás kevésbé súlyos vastagbélgyulladást eredményezett. IL-6 és TNF-α szignifikánsan alacsonyabb volt a vastagbélben a COS-t tápláló egerekben, mint a kontroll csoportban. Továbbá a COS csoportba tartozó egereknél tapasztalható volt a nukleáris faktor-kappa B (NF-κB) a vastagbél szövetében. Összességében a megállapítások azt mutatták, hogy 300 mg/kg COS hozzáadása az étrendhez megváltoztatta az egerek bél mikroflórájának összetételét, ami az NF elnyomását eredményezte.-κB aktiváció és kevesebb TNF termelés-α és IL-6; és ezek a változások a gyulladás jobb szabályozásához és a C. rodentium.

1. Bemutatkozás

Citrobacter rodentium, egerekben talált nyálkahártya kórokozó és enteropatogén Escherichia coli (EPEC) és enterohaemorrhagiás E. coli (EHEC), az emberben talált enterális kórokozók, kötődő és kiürítő (A/E) elváltozásokat hoznak létre, amelyek a nyálkahártya kolonizációját eredményezik a bélrendszerben [1, 2]. A bélhám baktériumkötésekkel beszűrődik, az ecset határán lévő mikrovillusok kimerülnek, és a talapzat alakú szerkezetek kezdenek kialakulni a tapadó baktérium alatt [3]. Az EHEC és EPEC fertőzéssel összehasonlítható vastagbélszöveti változásokat, valamint a gyulladásos citokin és leukocita infiltráció termelésének növekedését az A/E kórokozók a vastagbélhám megtelepedését követően ösztönzik [4]. C. rodentium az egérpopulációk között sok kutató használta a bélképet E. coli mivel a bél EPEC vagy EHEC nem fertőzi meg az egereket.

Az emberekben talált számos jelentős bél rendellenességet szintén gyakran modellezik C. rodentium egerekben, például vastagbél tumorgenezis, fekélyes vastagbélgyulladás és Crohn-kór [5]. A vastagbélgyulladás fertőzött egerekben alakul ki C. rodentium, ami azt eredményezi, hogy a baktériumok túlgazdagodnak, és az egerek természetes mikrobiotája sokféleségben és mennyiségben csökken [6]. Fertőzéskor az egerek bélmikrobiotájának 1-3% -a válik C. rodentium [7], míg a vastagbelet 10 9 kolóniaképző egység (CFU)/g támadja meg [8]. Az egér genetikai felépítése hatással van az C. rodentium-indukált vastagbélgyulladás, az olyan egereknél, mint a C3H/HeJ és az FVB/N, a fertőzés következtében hajlamosak a vastagbélgyulladás kialakulására, és az olyan egerekre, mint a CD-1 és a C57BL/6, azok közé tartoznak, amelyek nem hajlamosak vastagbélgyulladás kialakulására, és csak hajlamos a szubklinikai tünetekre [9]. A szerződéskötés sebezhetősége C. rodentium, valamint a bizonyos immunválaszra való hajlamról kiderült, hogy erősen összefügg a bél mikrobiota összetételével [10].

Az emberi bélrendszerben 500–1000 mikrobiotafaj található, összesen csaknem 100 billió mennyiségben [11]. Különböző tényezők, beleértve a helyet és az étrendet, jelentős hatást gyakorolnak a metagenómára, bár ezek a tényezők nem ugyanazon hatással vannak egyetlen szervezet genomjára. A kórokozók elmozdulása, az energia, például az SCFA-k kivonása az emészthetetlen táplálkozási szubsztrátokból, és az immunrendszer fejlődése a bél mikrobiotájától függ. A természetes mikrobiota homeosztázisban bekövetkezett jelentős változásokat az emberek különböző betegségei hozzák összefüggésbe [12].

A COS a rovarokban, gombákban, tintahalban, osztrigában, krillben, kagylóban és kagylóban található legtöbb poliszacharid között található. A kitin természetes N-dezacetilezett származéka [13]. Sok kutató feltárta, hogy a COS hogyan befolyásolja a Th1 és Th2 citokinek expresszióját [14]. Sertésekben [14], egerekben [15], patkányokban [16] és halakban [17] a COS az immunválasz szabályozója. Arról azonban keveset tudunk, hogy az étrendi COS hogyan befolyásolja a bél mikrobiotáját annak ellenére, hogy kevés tanulmány próbálta ezt sertéseken és csirkéknél tanulmányozni [18]. Hasznos lenne betekintést nyerni abba, hogy a COS a bél mikrobiotáján keresztül képes-e ellátni előnyös biológiai funkcióit, mivel már ismert, hogy számos biológiai funkcióra hatással van a bél mikrobiota [19, 20]. Ennek ellenére jelenleg kevés megállapítás létezik a C. rodentium, a bél mikrobiota és a COS-kiegészítők rájuk gyakorolt hatása. Így ennek a tanulmánynak az a célja, hogy értékelje a COS-kiegészítés mikrobiális flóra összetételének változásaira, a gyulladás előtti molekula redukciójára (és/vagy gyulladáscsökkentő molekula növekedésére) gyakorolt hatásait, és C. rodentium fertőzés.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Egerek és diéta

2.2. C. rodentium Fertőzés és monitorozás

2.3. Vastagbélszövet: szövettani elemzés

Minden egér vastagbélét eltávolítottuk és 10% -os formalinban rögzítettük. A paraffinba ágyazott metszetek festésére és előkészítésére hematoxilint és eozint használtunk. Hat kritériumot (ödéma, fekélyek, erózió, gyulladás, serlegsejtek hiperpláziája és kriptitisz) vázoltak fel a vastagbélgyulladás szövettani besorolása érdekében. 0–4 skálát alkalmaztunk az elváltozások pontozásához az alábbiak szerint: nincs hámvastagodás/vastagbélgyulladás (0); kisebb hámsejt-hiperplázia/nagyobb mennyiségű nyálkahártya-leukocita (1); gyulladás számos lókuszon, submucosán és nyálkahártyán, amelyet leukociták és/vagy jelentős hámsejt-hiperplázia szivárog be (a kripták 2-3-szoros emelkedésével) (2); nagyobb hámsejtek hiperpláziája (3–10-szer nagyobb kriptaszám), mucin szekréciós serlegsejtek csökkenése, fekélyképződés és/vagy a submucosa és a nyálkahártya jelentős leukocita infiltrációja (3); rendkívül magas hámsejtek hiperpláziája (10 vagy többször nagyobb kripta szám), kripta tályogok és/vagy a transzmurális leukociták súlyos beszivárgása (4).

2.4. 16S rDNS és Illumina MiSeq szekvenálás

Az alap- vagy a COS-étrend 14 napos időtartama után az ürüléket összegyűjtöttük, és mindegyik csoportban 10 egeret leöltünk a vastagbéltartalom összegyűjtése céljából. Ezután székletet és vastagbél tartalmat használtunk a 16S rDNS szekvenálásához. A DNS-izolálás irányelveinek megfelelően a QiagenQIAamp DNS Stool Mini Kit-et használtuk a DNS kinyerésére luminalis vastagbél- és ürüléktartalomból. Annak érdekében, hogy minden mintatípushoz alapmintát hozzunk létre, hat egérből azonos mennyiségű DNS-t gyűjtöttünk. Az 515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3 ’és a 907R 5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’ primereket (a vonalkód nyolc bázisú szekvencia egyed minden egyes mintához) a 16S baktérium riboszomális RNS génjének V4-V5 régiójának amplifikálására használtuk. PCR. A Sanghajban székhellyel rendelkező Biotree kereskedelmi cég elvégezte az általános adatelemzéseket és az Illumina MiSeq szekvenálást. Korábbi megállapításokat használtak a MiSeq PE könyvtárak, a MiSeq szekvenálás és a további elemzés irányításához [22]. A megfelelő szerzőkkel kapcsolatba lehet lépni a referenciákkal, a nyers adatokkal és a szekvenálási futtatással kapcsolatos további információkért.

2.5. A vastagbél mRNS elemzése

IL-6 és TNF-a expressziót beépítettük az elemzésekbe, amelyek a proximális vastagbél összegyűjtése és lemérése után következtek be. Az mRNS extrakciójához TRIZOL regentet (Invitrogen, USA) használtunk. A cDNS reverz transzkripcióját hajtottuk végre, és egy valós idejű PCR elvégzéséhez egy ABI 7500 Fast RT-PCR gépet (Applied Biosystems), Superscript II reverz transzkriptázt (Invitrogen) és oligo (dT) 20-at használtunk.

2.6. Citokin mérés

50 mM Tris-HCl 10-gyel

g/ml proteáz inhibitor oldatot (Sigma-Aldrich Co., USA) használtunk a vastagbélminták jégen történő homogenizálására. 20 percig végzett centrifugálást alkalmaztunk a homogenizátumokon 30 000-nél

g (4 ° C). Centrifugálást követően Sandwich ELISA Kit-et (ELISA Ready-SET-GO, eBioscience, CA, USA) alkalmaztunk a felülúszók TNF-tesztelésére-α és IL-6. A citokin normalizálását a vastagbélminták fehérje szintjének megfelelésére hajtottuk végre.

2.7. NF-κB (p65) Immunblot

Az NF-κB (p65) transzkripciós faktor vizsgálati készletet (Cayman Chemical Company, MI, USA) használtunk az NF mérésére-κB (p65) kötési aktivitás a nukleáris kivonatokban. A nukleáris vagy citoplazmatikus frakciókból kivont fehérjéket egyenlő mennyiségben vettük, majd (1) SDS-PAGE alkalmazásával elosztottuk, (2) PVDF membránokra helyeztük át (Millipore, MA, USA), és 5% zsírmentes tej használatával elzártuk Trisz Tween-pufferolt sóoldat-puffer (20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) 3 óra alatt. Az Alpha Imager 2200 (Alpha Innotech Corporation, CA, USA) elemzésének elvégzése előtt egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on az elsődleges antitestekkel, míg 60 perces szobahőmérsékleten inkubáltunk HRP-vel konjugált másodlagos antitesttel. antitestek. Végül elektronikus mennyiségi meghatározást és a jelintenzitás normalizálását végeztük a B-vitamin fehérje-bőséghez.

2.8. Statisztikai adatok elemzése

Az összes statisztikai elemzés elvégzéséhez az SPSS 22.0-t (Chicago, IL, USA) használtuk. Az ebben a szakaszban bemutatott adatok az átlag ± az átlag standard hibája (SEM). Hallgatói

-tesztet használtunk az adatok elemzéséhez két csoport között. Ebben a tanulmányban a statisztikai szignifikancia a

3. Eredmények

A súlymérések szerint a két csoport egyikében sem történt utófertőzéses változás az egerek súlyában. Ezenkívül, amint az 1. ábrán látható, a fertőzés után a D7-nél nem észleltünk változást a mennyiségben C. rodentium az egyes csoportok székletében vagy vastagbéltartalmában. Azonban, amint az a 2. ábrán látható, a colitis súlyosságának szignifikáns növekedését figyelték meg D7-nél a fertőzés után a kontroll egerek csoportjában a COS-szal ellátott egerekhez képest.