A diéta poszt-transzlációs módon módosítja a bél mikrobiális fehérjét a vesefunkció modulálásához

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: [email protected]

ABSZTRAKT

Egy új mechanizmust azonosítunk, amely összeköti az étrendet, a bél mikrobiális anyagcseréjét és a vesefunkciót. Megállapítottuk, hogy egy kénes aminosav alapú étrendi beavatkozás poszttranszlációs úton módosítja a mikrobiális enzimet, tompítja urémiás toxint termelő aktivitását és enyhíti a krónikus vesebetegséget (CKD) egy preklinikai modellben. Ezenkívül meghatározunk egy eddig ismeretlen szerepet a transzláció utáni S-szulfhidráció módosulásában a bél mikrobiomjában. Ez a tanulmány keretet nyújt annak megértéséhez, hogy az étrend miként állíthatja be a mikrobiota működését a fehérje transzláció utáni módosításával anélkül, hogy megváltoztatná a mikrobiális közösség összetételét, hogy támogassa a bélen túli egészséges gazdaszervezet fiziológiáját, és konkrétan azt, hogy egy étrendi módosítás miként gátolhatja a triptofanáz aktivitását a CKD progressziójának javítása érdekében.

Egy mondat összefoglaló Megállapítottuk, hogy az étrend poszttranszlációs úton módosítja a bél mikrobiota proteomját a veseműködés módosítása érdekében.

Fő szöveg

A krónikus vesebetegség (CKD) világszerte csaknem 850 millió embert érint (1). Bár az étrend módosítása a CKD-kezelés sarokköve, az étrend-mikrobiota kölcsönhatások mechanisztikus szerepét a CKD patogenezisében és kezelésében még nem vizsgálták. Míg számos étrend-mikrobiómás tanulmány az élelmi rost, a zsír és a szénhidrát hatására összpontosított (2), az étkezési fehérje és aminosavak specifikus hatásairól kevesebbet tudni, bár az étrendi aminosavak 5-10% -a a vastagbélbe jut, ahol a legtöbb bélbaktériumok metabolizmusa következik be (3). Emberben az étkezési fehérje növelése növeli a bélben lévő baktériumok hidrogén-szulfid (H2S), indol és indoxil-szulfát termelését (4, 5). Az indol és az indoxil-szulfát urémiás toxinok; és a H2S-nek különböző fiziológiai funkciói vannak, némelyiket a poszttranszlációs módosítás S-szulfhidráció közvetíti (6, 7). Míg emlős rendszerekben nagyszámú vizsgálatot végeztek, a H2S fiziológiás szerepe a bélbaktériumok működésének szabályozásában egy gazdaszervezeten belül nem megfelelő. Továbbá, hogy jóhiszemű lehetőségek vannak-e a CKD javítására az étrend-mikrobiota kölcsönhatások manipulálásával.

A. Alfa-sokféleség mérések. B. Béta-változatosság, súlyozott UniFrac elemzés. C. A bakteriális phyla relatív bősége. D. A top 10 baktérium nemzetség relatív bősége. E. Ugyanaz az elemzés, mint a D, minden X-tengelyű kullancs egy ketrecet képvisel, lehetővé téve a ketrecbe helyezés hatásainak megfigyelését. n = 19 egér alacsony Saa étrenden és 24 egér magas Saa étrenden.

A felső spektrum +32 Da hozzáadását mutatja a C363-on, a vörös sorozatú ionok a natív cisztein maradék (R-SH) peptidet, a kék sorozatú ionok pedig az R-SO2/R-S-SH cisztein módosulatot jelentik. Az alsó spektrum +64 Da hozzáadását jelzi a C363-on, a vörös sorozatú ionok a natív cisztinmaradékot (R-SH), a kék sorozatú ionok pedig az oxidált S-szulfhidrált (R-S-SO2) vagy a poliszulfhidrált (R-S-S-S) cisztein maradékot képviselik.

Az E. coli TnaA 15 legközelebbi ortológusának többszörös szekvenciájú összehangolása (MSA) a bélbaktériumok fajtáiban, amelyet az E. coli TnaA-val végzett BLAST-kereséssel kaptunk, összehasonlítva a mikrobiom referenciaszekvencia-adatbázisával. Az azonos aminosavakat kék színnel emelik ki. A felső logó szekvencia az MSA konszenzus szekvenciáját képviseli a vörös színnel jelölt cisztein maradékokkal. Az MSA-t a Clustal Omega algoritmus segítségével hajtottuk végre.

Kiegészítő anyagok és módszerek Egerek és diétás beavatkozások

Baktériumtörzsek és táptalajok

E. coli K-12 BW25113 törzset használtunk minden kísérletben (H2S termelés, indol termelés és in vivo kísérletek). Technikai okokból az E. coli K-12 MG1655-et alkalmazták a klónozási folyamatban ΔdecR és tnaA-his előállítására, az E. coli K-12 W3110-et pedig a TnaA-His expressziójára és tisztítására. A baktériumokat LB táptalajban (Merck) növesztettük 37 ° C hőmérsékleten rázással (250 fordulat/perc) aerob módon vagy anaerob rázás nélkül, és ahol említettük, az LB-t kiegészítettük L-ciszteinnel (Sigma-Aldrich), nátrium-hidroszulfiddal (Sigma-Aldrich) és/vagy L-triptofán (Sigma-Aldrich). Az LB + klóramfenikol (Cm) agar lemezeken történő szelekcióhoz 10 ug/ml Cm koncentrációt alkalmaztunk. Az E. coli tnaA739: kan törzset a Yale University Coli Genetic Stock Center-től (CGSC) kaptuk a Keio gyűjtemény részeként (29).

Genetikai manipulációk és az E. coli klónozása

Fehérje kivonás

S-szulfhidrált fehérjék lehúzása

FASP oszlopos és TMT címkézés

Metabolit extrakciók az indol és az indoxil-szulfát LC-MS/MS elemzéséhez

Tömegspektrometriás elemzés

Tömegspektrometriás adatok számítási elemzése

Western blot elemzések

Ugyanolyan mennyiségű lehúzható vagy átfolyó mintát inkubáltunk 70 ° C-on 15 percig töltőpufferrel. A mintákat 10% -os Mini-PROTEAN® TGX ™ előre elkészített fehérjegéleken (Bio-Rad) futtattuk Chameleon® Duo előre festett fehérjehétrákkal (LiCOr) Tris-Glicin-SDS futtató pufferben. A fehérjéket ezután Tris-glicin transzfer pufferben, 1 órán át 20 V-on, szobahőmérsékleten, Amersham Protran 0,45 um nitrocellulóz membránra vittük át. A membránokat blokkoltuk Odyssey Blocking PBS puffer (LiCOr) 1: 2 hígításával PBS-ben 1 órán át szobahőmérsékleten. A membránokat ezután primer antitestekkel inkubáltuk blokkoló pufferben + 0,2% Tween-20 egész éjjel. Öt PBS + 0,2% Tween-20 mosást követően (mindegyik 5 perc) a membránokat 1 órán át inkubáltuk blokkoló pufferben + 0,2% Tween-20 pufferben fluoroforhoz (LiCOr) konjugált másodlagos antitestekkel. A membránokat ismét ötször mostuk PBS-sel + 0,2% Tween-20-tal, majd további 2-szer PBS-sel, majd LiCOr Odyssey CLx gépen készítettük őket. A képeket ImageJ2 szoftver segítségével elemeztük és számszerűsítettük (41).

Kolorimetriás indolmérés Kovac reagensével

In vitro triptofanázvizsgálatok

Az E. coli apo-triptofanázt (Sigma-Aldrich) 1 ml 100 mM kálium-foszfát (pH 8) pufferben szuszpendáltuk, alikvotizáltuk és -20 ° C-on tartottuk. 5 µl apo-triptofanázt adunk 12 µl 100 mM kálium-foszfát pH 8 pufferhez, 1 mM pirodxal-5-foszfáttal (PLP) és különféle kezelésekkel (NaCl, NaHS, L-cisztein, DTT vagy Na2S4), és 45 percig inkubáljuk 37 ° C-on. . Ezután 12 ul 100 mM kálium-foszfátot és 5 mM L-triptofánt adunk hozzá, és a mintákat 1 órán át 37 ° C-on inkubáljuk. Ezután 250 μl 20% -os TCA-t adunk a mintákhoz, majd 15 percig jégen inkubáljuk a TnaA kicsapásához. A mintákat 10 percig maximális sebességgel centrifugáltuk, a felülúszót új 1,5 ml-es csőbe helyeztük, és 500 µl Kovac-reagenst adtunk hozzá, majd vortexet és 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, mielőtt a felső réteg abszorbanciáját megmérettük volna OD530 nm-en.

Szérum kreatinin mérések

Az egér szérumot a fent említettek szerint extraháltuk, és a kreatininszintet a szérum kreatinin-kolorimetrikus vizsgálati készlet (Cayman Chemical) segítségével két példányban, standard görbével mértük, a gyártó protokolljának megfelelően.

A vakbél DNS kivonása és RT-qPCR elemzése

Baktérium 16S rDNS amplikon könyvtár létrehozása és szekvenálása

Bakteriális 16S rRNS gén amplikon szekvenciák elemzése

A 16S rRNS-gén amplikonszekvencia-elemzésünk Langille és munkatársai (43) által javasolt mikrobiom-segítő burkoló által javasolt szabványos működési protokollon alapult. Röviden, minden könyvtárhoz kaptunk fastq fájlokat, átlagosan 73 905 250 bp páros végű olvasással, és az olvasások minőségét a FastQC (v0.11.5) segítségével ellenőriztük. A minőségi jelentés szerint az olvasásokat a fastx-toolkit segítségével vágták le, hogy csak a nagy bizalommal bíró alaphívásokat tartsák meg. Az olvasásokat a PEAR (44) alkalmazásával varrtuk össze, fasta formátumra konvertáltuk, és a kiméra olvasmányokat kiszűrtük a VSEARCH (45) alkalmazásával. Az operatív taxonómiai egységeket (OTU-kat) a QIIME V1.9 (46) alkalmazásával választottuk ki a sortmerna program (47) felhasználásával, és az OTU-kat, amelyek kevesebb, mint 0,1% -a olvashatóak, kizárták, mint alacsony megbízhatóságú OTU-kat. Végül az egyes könyvtárakban az olvasások számát ritkították a legkisebb könyvtárméretig. Az α-diverzitás és a β-diverzitás (súlyozott Unifrac PCOA) elemzéseket a phyloseq R v1.30 (48) Rstudio v1.25 csomaggal, valamint a taxonómiai kompozíciók vizualizálásával végeztük. A két étrend közötti specifikus OTU-különbségeket a phyloseq R csomag, a LefSe (49) és a MaAsLin (50) algoritmusok segítségével elemeztük, ketrecbe helyezve zavaró változóként. A STAMP python programot az adatok vizualizálására és elemzésére is használták (51).

A CKD-s betegek metaanalízise a széklet mikrobióm adatait

A CKD-s betegek székletmintáinak 16S rRNS-gén amplikon szekvenálásának szekvenciaadatait (Xu és mtsai., 2017 és publikálatlan) az NCBI-ből töltöttük le (PRJEB9365 és PRJEB5761 hozzáférések). A 16S rRNS gén amplikon adatait a fent leírtak szerint dolgoztuk fel. A publikálatlan CKD beteg székletminták metagenomikus adatait az NCBI-től (belépés PRJNA449784) töltöttük le, és a FastQC (v0.11.5) elemezte, majd a gyenge minőségű leolvasásokat és leolvasásokat követte az emberi genomhoz tartozó KneadData (v0.7.2) segítségével. Ezután a szűrt leolvasásokat használtuk a HUManN2 program (v2.8.1) (52) bemeneteként, így 3 mátrixot kaptunk a géncsaládokról, az anyagcsere-utak lefedettségéről és az anyagcsere-utak bőségéről, baktériumfajok szerint rétegezve. Az E. coli bőség analíziséhez kiszámoltuk az E. coli génhez leképezett leolvasások átlagösszeg-normalizált előzetes százalékát, és az E. coli leképezett olvasás nélküli betegeket eltávolítottuk az elemzésből, majd négyzetgyök transzformációt használtunk az adatok normalizálására. A PhyloChip adatokat (12) Dr. Vaziri kérte, és az R és az EnhancedVolcano csomag használatával elemezték (v1.4.0).

H2S mérések

Szövettan

Feláldozás után a veséket műtéti úton eltávolítottuk az egerekből, és 4% paraformaldehidben (PFA) rögzítettük, paraffinba ágyazva, 5 μm-re szétválasztva, majd H&E vagy Masson trichroma reagensekkel festettük. A szövettani elemzést vakon végezte a JNG. A kóros parenchyma a következők közül egy vagy több jelenlétét ismerte fel: tubuláris gyulladás (tubulitis), tubuláris dilatáció vagy lemorzsolódás, interstitialis gyulladás és/vagy fibrózis. Megjegyeztük a kristálylerakódás mértékét is. A kvantitatív pontozást az alábbiak szerint hajtottuk végre: A kóros (gyulladt) vese parenchyma mértékét vizuálisan becsültük a teljes kérgi terület százalékában, jól orientált szakaszokban, amelyek mind a vesekéreget, mind a medullát magukban foglalták.

statisztikai elemzések

Az összes statisztikai elemzést R (v3.4-3.6) alkalmazásával hajtottuk végre az RStudio-n (v1.25). A felhasznált csomagok listáját az S5. Táblázat tartalmazza. Alapértelmezett statisztikai tesztként Mann-Whitney-t és Kruskal-Wallist végeztük el, hacsak az ábrákban nem szerepel másképp.