Az étrendi genistein befolyásolja az acetilkolin-receptorok számát a női cukorbeteg jejunumban

1 Élettani Tanszék, Midwestern Egyetem, 19555 N. 59th Avenue, Glendale, AZ 85308, USA

2 Anatómiai Tanszék, Arizona Osteopátiás Orvostudományi Főiskola, Midwestern Egyetem, 19555 N. 59th Avenue, Glendale, AZ 85308, USA

Absztrakt

1.Háttér

A cukorbetegséggel és az elhízással járó ismert klinikai szövődmények a lassú gyomor-béltranzit és a késleltetett gyomorürítési idő (gasztroparézis); valójában a gasztroparézis látható

A cukorbetegek 30% -a [1–4]. A ob/ob A leptinhiányos egér a cukorbetegség és az elhízás egér általánosan használt modellje, amely szorosan utánozza a klinikailag látható gyomor-bélrendszeri diszfunkciókat, beleértve a lassabb gyomor-bélrendszeri tranzitot és a késleltetett gyomorürítési időt [2, 5].

A diszfunkcionális gasztrointesztinális tranzit közvetítésében szerepet játszó mechanizmusok diabéteszes egérmodellekben összetettek és kevésbé érthetőek. Ebben a tanulmányban egy genistein diéta hatását értékeljük a jejunum motilitására és kontraktilitására, a jejunum falvastagságára, valamint az acetilkolin receptorok (AChR) mennyiségi meghatározását ob/ob egér jejunum. Feltételeztük, hogy a diabétesz elhízott ob/ob az egérnek diszfunkcionális jejunum motilitása van, az AChR downregulációjával együtt, és hogy ezeket a hiányosságokat 4 hétig tartó genistein diéta alkalmazásával lehet enyhíteni.

2. Módszerek

5 hetes nőstény ob/ob és sovány alomtárs C57BL/6J egereket a Jackson Laboratóriumtól (Bar Harbor, ME) vásároltunk, és 12: 12 órás világos-sötét ciklusú állatgondozó létesítményekben helyeztük el őket. Az egereket véletlenszerűen a két étrend-csoport egyikébe soroltuk: standard rágcsáló-chow-t (std) vagy genisteint tartalmazó étrendet (Gen) etettek. A genisteintartalmú étrendet (Gen) a Dyets Inc.-től (Bethlehem, PA) vásároltuk, és 600 mg genisteint/kg étrendet tartalmazott. A genistein diéta összetételét korábban publikálták [9, 13, 14]. Az ételt és a vizet ad libitum szolgáltatták. A testsúlyt és az általános egészségi állapotot hetente ellenőriztük a 4 hetes diétás vizsgálati időtartam alatt. Nál nél

10.-12 hetes korban az egereket (ob/ob és sovány) 100% CO2-os légkörben elfojtották, majd műtéti pneumothorax következett be. Az állatgondozást a megállapított irányelvek szerint hajtották végre, és az összes protokollt a Midwestern University Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyta jóvá.

2.1. Szövettan és morfológia: H&E festés

A jejunum frissen izolált darabjait fagyasztva fagyasztva felvillantuk az optimális vágási hőmérsékletű vegyületbe (OCT, Tissue-Tek, Torrance, CA). Hematoxilin és eozin (H&E) festéshez a jejunum fagyasztott szeletelt szakaszai (10 μm) standard protokoll szerint festettük, mielőtt elvégeztük a morfometriai elemzéseket az alapszövettani mérések értékelése céljából. Röviden, a szakaszokat a következő mosási protokolloknak tették ki: hematoxilin 30 s, vízöblítés 10 s, Scott oldat 5 s, vízöblítés 10 s, 95% etanol 5 s, eozin 15 s, öblítés 95% etanollal 10 s és majd 100% etanol 10 s, majd 15 s xilol. A belső kör alakú simaizom falvastagságát (és a magok számát ezen a régión belül), a külső hosszanti falvastagságot (és a magok számát ezen a régión belül) és a teljes falvastagságot Axiovision (Carl Zeiss) alkalmazásával mértük H és E- foltos jejunum szakaszok. Az összes kép tízszeres nagyítással készült. A mérések átlagát 5 külön szeletből vettük a jejunum fagyasztott szakaszainként (azaz egérenként), és az adatokat csoportonként több egér átlagaként adtuk meg.

2.2. Acetilkolin-receptor (AChR) immunfluoreszcencia

Az AChR-eket a korábban leírtak szerint vizualizáltuk [15], fluoreszcens mikroszkóppal a megkötésével α-tung-metil-rodaminhoz konjugált bungarotoxin. A jejunum szakaszai (10 μm) a toxintartalmú táptalajban 30 percig 37 ° C-on inkubáltuk az AChR-ek jelölésére. A metszeteket kétszer öblítettük szobahőmérsékletű foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), 10 percig fixáltuk szobahőmérsékleten 2% paraformaldehiddel PBS-ben, kétszer öblítettük szobahőmérsékletű PBS-sel, 5 percig hideg metanolban -20 ° C-on dehidratáltuk, és parafenilén-diamint tartalmazó pufferolt glicerinbe szerelve. Az AChR-k fényes csoportjait figyeltük meg, és egy látómezőnkénti átlagos klasztereket meghatároztunk állatonként 3-4 véletlenszerűen kiválasztott mezőre. A fluoreszcencia és a fáziskontraszt képeket az Olympus fluoreszcens mikroszkóppal rögzítettük a Magnafire digitális fényképezőgéppel, 20-szoros objektívvel.

2.3. Kontraktilitási intézkedések

Az egerek egy részében frissen izolált jejunum gyűrűket készítettek az izometrikus feszültség mérésére. Minden egérből 2 gyűrű jejunum szövet jött létre. A jejunum minden szegmensét ugyanazon eljárásoknak vetették alá, az adatokat átlagolták, és reprezentatívnak tekintették az állatra, figyelembe véve

. Az izometrikus feszültséget standard izolált szöveti eljárásokkal mértük. Röviden, a jejunum gyűrűket két rozsdamentes acél huzal közé szerelték, amelyek az egyes jejunum gyűrűk lumenén keresztül haladtak át, erőkóddal összekötött huzalokkal (159901A, Radnoti, Monrovia, CA). A jejunum gyűrűket 15 ml-es fürdőbe merítettük, amely Krebs-hidrogén-karbonát-gyűrűt tartalmazott, mM: 115 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1,2 MgCl2 és 1,2 CaCl2 (pH 7,4) elegyben, és 37 ° C-on 95% oxigén/5% szén-dioxid gázkeverék. A jejunum gyűrűket kinyújtották és fenntartották

0,275 g nyugalmi feszültséget és kiegyensúlyozott

40 perc gyakori fürdőváltással. A növekvő kálium-klorid-koncentrációk kumulatív hozzáadásával keletkező feszültség dózis-válasz görbéit kaptuk (az egyes dózisoknál 0–100 mM egyensúlyi állapotú kontraktilis válaszokat kaptunk). A feszültségfejlődést a PowerLab folyamatosan rögzítette és gyűjtötte a ChartPro számítógépes adatgyűjtő rendszer szoftverrel (AD Instruments Inc., Colorado Springs, CO).

2.4. Gasztrointesztinális motilitási intézkedések

2.5. Vegyszerek

A tetrametil-rodaminhoz konjugált AChR-bungarotoxin antitesteket a Molecular Probes (Life Technologies, Carlsbad, CA) cégtől szereztük be. Az összes többi vegyszert a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO) szereztük be.

2.6. Statisztika

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A zárójelben lévő számok a különálló egerekből felhasznált szövetek számát jelentik. Párosítatlan t-a teszteket GraphPad (San Diego, Kalifornia) és

statisztikailag szignifikánsnak tekintették.

3. Eredmények

A ob/ob normál étrenddel etetett nőstény egerek (51,50 ± 1,55 g,

) 2,2-szer nehezebbek voltak, mint a sovány társaik (23,67 ± 0,43 g,), és a genistein diéta 12% -os ob/ob nőstények (45,57 ± 0,93 g,).

3.1. Kontraktilitás

A egér minden egyes csoportjára mértük a jejunum frissen izolált szegmenseiben keletkező feszültséget (1. ábra). A kontraktilitás minden nőcsoportban megnőtt annak függvényében, hogy a jejunumban fokozatosan növelte a kálium-klorid (10–100 mM) dózisát (1. ábra). A 100 mM KCl-tal előállított maximális feszültség összehasonlítható volt ob/ob standard táplált egerek (0,60 ± 0,05 g,

) összehasonlítva a sovány kontrollokkal (0,75 ± 0,07 g,). A genistein-étrendnek nem volt hatása a keletkező maximális feszültségre (0,60 ± 0,11 g,

). A nyugalmi feszültségek a nők egyik csoportjában sem különböztek (1. ábra: sovány standard táplálás = 0,28 ± 0,03 g; ob/ob standard adagolás = 0,27 ± 0,02 g; és ob/ob táplált genistein = 0,26 ± 0,02 g,). Az egyes jejunum szegmensek nedves súlya nem különbözött a csoportok között; sovány standard táplálás = 41,16 ± 2,75 mg (), ob/ob standard táplált = 49,23 ± 3,44 mg (), és ob/ob etetett genistein = 49,79 ± 3,36 m ().

3.2. Jejunum morfológia

Annak megállapításához, hogy a jejunum morfológiáját módosítja-e a cukorbetegség, és annak megállapítására, hogy a genistein-diéta módosíthatja-e a falvastagságot, a szövettani metszeteket H&E alkalmazásával festettük, és elemeztük a teljes falvastagságot, a kör simaizom vastagságát, a hosszanti simaizom vastagságát és a magok számát simán izomréteg (2. ábra). A mért paraméterek egyikében sem történt változás.

. Belső kör alakú simaizom vastagság.

. A belső kör alakú simaizomrétegen belüli magok száma.

. A külső hosszanti simaizom falvastagsága.

. A külső hosszanti simaizomrétegen belüli magok száma.

. Az értékek átlag ± SEM.

3.3. Acetilkolin-receptorok

Az AChR-ket vizualizáltuk és mennyiségileg meghatároztuk az összes egércsoportban (3. ábra). Az AChR-értékek jelentősen, 48% -kal csökkentek a ob/ob nőstény egerek (43,75 ± 4,76,) a sovány társaikhoz képest (84,10 ± 7,19, 3. ábra). Érdekes módon, ob/ob a genistein-diétával táplált egerek 1,48-szor szignifikánsan (64,82 ± 7,21,) növekedtek az AChR-k ob/ob női kontroll kollégák standard étrendet tápláltak (43,75 ± 4,76,); vagyis a genistein-diéta részben, de jelentősen megmentette az AChR-ek számát (3. ábra). Ezenkívül számszerűsítettük az AChR-ek számát 100-ra μm villi hossza a csoportok közötti villi hosszúság változásának normalizálására: Az AChR-ek szignifikánsan csökkentek a ob/ob egerek (0,84 ± 0,18,) a soványhoz képest (2,31 ± 0,31, 3. ábra), és a genistein diéta az AChR-klaszterek jelentős megmentését váltotta ki (2,26 ± 0,39, 3. ábra).

). ∗ Jelentős különbség a soványtól,

. # Jelentős genistein-közvetített hatás,

3.4. Mozgékonyság

A motilitási jellemzőket a GIMM videó rögzítő rendszer segítségével határoztuk meg. A rendszer segítségével a motilitás értékeléséhez rögzített nyomra mutat példát a 4. ábra.

Nem találtunk a cukorbetegség (vagy genistein) hatását a jejunum elszigetelt szegmenseinek sebességére, távolságára, idejére vagy eseményeinek számára (5. ábra). Megjegyezzük azonban, hogy a diabéteszes jejunumban az események közötti távolság jelentősen megnőtt (7,33 ± 0,99,) a sovány kontrollokhoz képest (3,95 ± 1,04, 5. ábra), genisteinhatás nélkül (6,32 ± 0,42,).

Jelentős különbség a soványtól,

4. Megbeszélés

A cukorbeteg ob/ob az egér modell leptinhiányos és hiperfág, elhízott és inzulinrezisztens [16]. A cukorbetegség e modelljének előnye az a megfigyelés, hogy a bélrendszeri nehézségeket, amelyek hasonlítanak a cukorbetegségben klinikailag észleltekhez (azaz a gyomor-bélrendszer tranzitjának lassulását [2] és a késleltetett gyomorürítést [3]), szintén fel kell tüntetni. ob/ob modell. A ob/ob ebben a jelenlegi vizsgálatban használt egerek (12-13 hét) összehasonlíthatók a korábbi vizsgálatokkal, amelyek kimutatták a megváltozott bélműködést, valamint a cukorbetegség tipikus tüneteit ebben az életkorban. Férfiban ob/ob egerek (6–15 hetesek) vagy hím C57Bl/6J egerek, akik 14 héten át tápláltak magas zsírtartalmú étrendet, kimutatták, hogy a gasztroparézis a plazma glükózszintjének kétszeres emelkedésével jár [6, 17]. Megjegyzendő, 15 hetes férfi ob/ob az egerekről kimutatták, hogy a gyomor-bél tranzitjának lassulása korrelál a megnövekedett nyombélszekretin-tartalommal és a vastagbél vazoaktív bélpeptidtartalmának csökkenésével [2, 18]. Ezenkívül Kiely és mtsai. [19] kimutatták, hogy a 13-14 hetes kan ob/ob az egerek lelassítják a gyomor-bélrendszer tranzitidejét.

A késleltetett diabéteszes gasztrointesztinális tranzit patogenezise nem jól ismert, és a jelenlegi bizonyítékok ezen a területen összetett etiológiára utalnak. Diabéteszes db/db egerekben a gasztrointesztinális gyomor-bél motilitását a Cajal intersticiális sejtek csökkent területeinek tulajdonítják [20]. Az elhízott diabéteszes egerekben a késleltetett gyomor-béltranzit a duodenális szekretin és a vastagbél szerotonin sejtjeinek elvesztésével jár [2]. A vékonybél, különösen a jejunum, továbbra is alulvizsgált régió marad a cukorbetegség és az elhízás modelljeiben. Eredményeink jelentős változásokat mutatnak a nőknél ob/ob egér jejunum, amelyek összhangban vannak a diszfunkcionális béltranszttal: (1) csökkent AChR-klaszterek és (2) nagyobb távolság az egymást követő kontraktilis események között. Ezek az adatok együttesen azt sugallják, hogy a fehérje expressziójának strukturális változásai és/vagy változásai valószínűleg hozzájárulnak a megnövekedett gyomor-bél tranzitidőhöz, és így hozzájárulnak a modell diabéteszes fenotípusához.

Adataink arra utalnak, hogy bár a teljes falvastagság nem változott cukorbetegséggel, sem a belső kör alakú simaizom, sem a külső hosszanti simaizom vastagsága nem változott (2. ábra). Ezenkívül a genistein-diéta nem változtatta meg az atommagszámot, ami a gyomor-bél traktus falainak simaizomsejtjeinek hiper- vagy hipotrófiájának hiányára utal. Így a ob/ob nőstény egér üreg, a simaizom fizikai módosításai nem tudták megmagyarázni sem ennek a diabéteszes modellnek a lelassult béltranszportját, sem pedig a genistein diéta jótékony hatásait. Érdekes, hogy a jejunum izolált gyűrűiben generált maximális összehúzódás összehasonlítható volt ob/ob nőstények és sovány társaik (1. ábra). A receptor-függő kontraktilitási intézkedések hiányában azonban olyan agonistákkal, mint az acetilkolin, átfogó és mechanisztikus következtetések jelenleg nem tehetők.

A gasztrointesztinális motilitást ellenőrző rendszer (GIMM) lehetővé teszi számunkra, hogy meghatározzuk a jejunum izolált szegmenseinek belső kontraktilis jellegével kapcsolatos különböző paramétereket. A kísérletek ezen alcsoportjában folyamatosan elemeztük a mozgékonyságot legalább egy percnyi felvételkor, és kiértékeltük a következőket (4. és 5. ábra): sebesség, távolság, idő, az események száma és az események közötti távolság. Eddig a pontig a GIMM rendszert hatékonyan alkalmazták a vastagbélszöveten keresztüli propulziós mozgékonyság elemzésére [25, 26]. Nincs tudomásunk más módszerekről, amelyek a vékonybél motilitásának értékelésére rágcsálómodellekben alkalmazzák. Úgy gondoljuk, hogy ennek a technikának az alkalmazása a bél patológiájának egérmodelljein fényt derít mind a kontrakciós, mind a relaxáló szerek bevonására, amelyek bél dysmotilitást eredményeznek. Jövőbeli tanulmányaink a farmakológiai eszközök értékelésére irányulnak az egymást követő kontraktilis események közötti távolság csökkentésére ob/ob egér belek (azaz visszatérve a sovány szintek felé).

A bélen való átjutási idő a teljes bélben lévő hatékony tápanyag felszívódással jár. Logikusnak tűnik az a feltételezés, hogy a hosszabb tranzitidő közvetlenül összefügg a megnövekedett felszívódással és a nagyobb súlygyarapodással, de valószínűleg bonyolultabb. Valóban kimutatták, hogy az elhízott betegeknél magasabb a felszívódás a vékonybélben, rövidebb tranzitidővel együtt [27]. Ezt tovább igazolták izolált reszektált vékonybélben végzett vizsgálatok során, ahol a karbachol által kiváltott simaizom-kontraktilitás növekedett és a gyorsabb tranzitidőhöz kapcsolódott [28]. Így valószínűleg sok diszregulált útvonal vesz részt a bélműködési zavar bemutatásában a diabéteszes egér modellben és a betegeknél.

5. Következtetések

Összefoglalva, ez a tanulmány két olyan mechanizmust mutat be, amelyek felelősek lehetnek a késői gyomor-bélrendszeri tranzitért ob/ob egér jejunum. Javasoljuk, hogy ez a diszfunkció a béltranzitban a csökkent AChR-k és az egymást követő kontraktilis események közötti nagyobb távolság kombinációjának tulajdonítható. Ez az inkongruitások duója valószínűleg hozzájárul a gyomor-bélrendszeri tranzitidő lassulásához, amely jellemző a ob/ob egér, és magyarázhatja az emberi diabéteszes bél szindrómát is. Továbbá bebizonyítottuk, hogy a genistein-diéta jelentősen helyreállítja az AChR-k számát, közelebb hozva őket a sovány kontrollok szintjéhez, és bár a genistein-étrend nem csökkenti jelentősen az egymást követő kontraktilis események közötti távolságot, bizonyára van erre tendencia. A jövőbeni tanulmányok célja annak jobb megértése, hogy az AChR és/vagy más neuromodulátorok sejtes szabályozói is megváltoznak-e ob/ob egerek. Előre jelezzük, hogy ezen bélműködési zavarok javulása módszert nyújthat a diabéteszes fenotípusban észlelt gyomor-bélrendszeri szövődmények terápiás enyhítésére.

Rövidítések

AChR:	Acetilkolin receptor
PBS:	Foszfáttal pufferolt sóoldat
OKTÓBER:	Optimális vágási hőmérsékletű vegyület
Ő:	Hematoxilin és eozin
GIMM:	Gasztrointesztinális motilitás monitorozó rendszer.

Adat hozzáférés

A jelenlegi vizsgálat során felhasznált és/vagy elemzett adatkészletek ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől elérhetőek.

Etikai jóváhagyás

Az állatgondozást a megállapított irányelvek szerint hajtották végre, és az összes protokollt a Midwestern University Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyta jóvá.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő érdekeik.

A szerzők közreműködése

Valamennyi szerző jelentősen hozzájárult a tanulmány kialakításához és megtervezéséhez, a kísérleti eljárásokhoz, az elemzéshez, az adatok értelmezéséhez, a kéziratok írásához és szerkesztéséhez, valamint a benyújtott változat jóváhagyásához.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak Kelly Ezell asszonynak az AChR számszerűsítésével kapcsolatos technikai segítségért és Lana Leung asszonynak az AChR festéssel kapcsolatos technikai segítségért. Robert Dolant és Shawn Catmullt a Midwestern University DO nyári ösztöndíjas programja támogatta. Ezt a munkát a Midwestern University Intramural alapjai (Layla Al-Nakkash számára), a Szója Egészségügyi Kutatási Program (Layla Al-Nakkash számára) és a Diabetes Action and Research Education Alapítvány (Layla Al-Nakkash támogatásával) támogatták.