Az izotópos nitrogénforgalom aránya, amely hosszú távon értékelheti a növekvő kérődzők fehérjeforgalmát

Absztrakt

Bevezetés

Így a tanulmány célja a szöveti izotóp-forgalom megközelítésének (MacAvoy et al., 2005; Abimorad et al., 2014) adaptálása volt a kérődzők vizeletéhez, és hosszú távon nem invazív, kevésbé zavaró proxy-ként tesztelték. WBPT viszonylag sok növekvő-hizlaló húsmarhánál. Ezenkívül megmértük a plazmafehérjék izotópforgalmát is, mint a frakcionált fehérjeszintézis sebességét (FSR) plazmafehérjék. Mivel a WBPT hosszú távú (több hónapos) mérésére jelenleg nem áll rendelkezésre arany standard módszer, ezért ezt a proxyt úgy értékeltük, hogy felmérjük annak képességét, hogy észlelje a két táplálkozási tényező közötti különbségeket, amelyekről ismert, hogy különböző mértékben befolyásolják az egész test fehérjeforgalmát: ) a fehérjetartalom és a bevitel, mint erős és jól ismert hatás (Waterlow, 2006), és ii) az étrendi aminosav-profil, mint a szarvasmarhák fehérjeforgalmi sebességének kevésbé fontos modulátora (Wessels et al., 1997). Ebből a célból megmértük a nitrogén izotóp (δ 15 N) kimerülésének kinetikáját a vizeletekben és a plazmafehérjékben 5 hónapos időtartam alatt, miután 36 hízó fiatal bika táplálékában etetett étrend δ 15 N kismértékű csökkenését követtük. különböző fehérje- és metionintartalom. Az előzetes eredmények absztraktként jelentek meg (Cantalapiedra-Hijar et al., 2017).

Anyag és módszerek

A kísérletet Herbipôle-ben (Inra, UE 1414, Theix, Franciaország) hajtották végre az állatgondozásra vonatkozó nemzeti jogszabályok betartásával. A C2EA-02 állatkísérleti etikai bizottság (Auvergne, Franciaország) előreláthatólag jóváhagyta ezt a kutatást, majd a Mezőgazdasági Minisztérium (Franciaország) jóváhagyta a jóváhagyási számmal # 7180-2016101016361277v4.

Állatok, étrend és teljesítményteszt

Harminchat növekvő-hízó Charolais-bikát (320 ± 33kg és 266 ± 22d) rendeltünk a négy kísérleti étrend egyikéhez (n = 9/kezelés), amely egy faktoriális 2 × 2 kialakítás eredményeként jött létre: két étrendben metabolizálható fehérje szint (100% [Normál] vs 120% [magas] követelmények; INRA, 2018) két diétás metionintartalommal (kiegyensúlyozatlan étrend [2,0 g Met/100 g metabolizálható fehérje] vs kiegyensúlyozott étrend [2,6 g Met/100 g metabolizálható fehérje]). Az összes étrend izo-NE/kg DM volt, és körülbelül 54% fűszilázsból, 6% búzaszalmából és 40% koncentrátumból állt, és napi mennyiséget módosítottak az elutasítások legalább 10% -ának biztosítására.

Diétás izotópos N-kapcsoló

Mintavétel és 15 N elemzés

Izotóp forgalmi sebesség modellezése és statisztikai elemzés

Az egyes medencékben mért étrend utáni kapcsolási δ 15 N kinetikát (plazmafehérje és vizelet) Martinez del Rio és Carleton (2012) szerint gondosan elemeztük, tesztelve, hogy engedelmeskednek-e az 1. vagy magasabb rendű (2. rend ) kinetikája a következő mono-, illetve bi-exponenciális modellek szerint: ahol t (d) a 15 N-os étrend-váltás óta eltelt idő, δ 15 N (t) (‰) a medence δ 15 N-értéke t, δ 15 N0 (‰) a medence kezdeti δ 15 N értéke, és δ 15 N∞ (‰) a medence aszimptotikus értéke, miután az állat eléri az izotóp egyensúlyi állapotát az alapvető étrenddel (15 N-karbamid nélkül). adminisztráció). A mono-exponenciális modellben k (d −1) a készlet frakcionált izotóp-forgalmi sebessége, míg a bi-exponenciális modellben k1 és k2 (d −1) két elkülönült frakcionált izotóp-forgalmi sebesség és p és ( 1-p) t a teljes izotópforgalomhoz való hozzájárulásuk.

Annak diagnosztizálásához, hogy egy mono-exponenciális modell elegendő-e a δ 15 N kinetika megfelelő illesztéséhez, a reakció előrehaladásának változó megközelítését alkalmaztuk ((Martinez del Rio és Carleton, 2012; Cerling et al., 2007), hogy az átrendeződésen alapul. Az [1] egyenlet eredményei: ahol (1-F) megméri a fennmaradó δ 15 N távolságot az új egyensúlyhoz képest a kiindulási és az aszimptotikus δ 15 N közötti egyensúlyban elért teljes izotópos távolság arányában. Függelékben eldöntöttük, hogy milyen modellre van szükség az ln (1-F) diagramjának vizuális vizsgálata alapján az idő függvényében, attól függően, hogy ln (1-F) az idő csökkenő lineáris függvénye volt-e egyenlő lejtéssel (mono-exponenciális modell) vagy az egyre sekélyebb lejtők 2 sorának sorozata, amely egyenlő –k1 és –k2 (bi-exponenciális modell). Ezt a grafikus elemzést az Akaike Information kritérium is alátámasztotta, ahol az alacsonyabb értékek az egyik fölényét jelzik. modell egy másik felett.

A vizelet izotóp-forgalmának sebessége

A vizeletek δ 15 N kinetikája szempontjából a reakció előrehaladásának megközelítése egyértelműen két független lejtőt azonosított, d4 és d7 közötti határral (beillesztések az 1. és 2. ábrán). Ez igazolta a vizelet δ 15 N kimerülésének két különféle, gyors és lassú mértékű kimerülését az étrend-váltás után, és igazolta egy bi-exponenciális modell szükségességét ezeknek az adatoknak a megfelelő kielégítésére. Az egyéni δ 15 N kinetikát bi-exponenciális modell alkalmazásával valóban helyesen illesztették szinte minden állatra (r2 ≥ 0,96; n = 34), kivéve 2 olyan állatot, amelyek rosszul voltak felszerelve, nyilvánvaló magyarázat nélkül, és ezért kizárták őket az elemzésekből . Amikor az összes adatot összesítették és vegyes hatású bi-exponenciális modellen keresztül elemezték, az étkezési fehérjetartalom csak a vizeletek 15 N-kimerülésének frakcionális arányára figyeltek meg, ahol a magas fehérjetartalmú étrenddel etetett állatok magasabb értékeket mutattak mind az első gyors (89,9 vs. 70,0%/d; P = 0,008), mind a második lassú (10,3 vs. 8,01%/d; P 15 N-forgalom a normál fehérjetartalmú étrendet fogyasztó állatokhoz képest (1. ábra). A metioninnak nincs hatása bármely modellparaméteren megfigyelték a tartalmat (P> 0,10; 2. ábra).

A normál fehérjetartalmú táplálékkal (n = 17) összehasonlítva a magas fehérjetartalmú táplálékkal (n = 17) etetett állatoknál magasabb volt a vizelet 15 N-kimerülésének arányos aránya mind az első gyors (89,9 vs. 70,0%/d; P = 0,008) ) és a második lassú (10,3 vs. 8,01%/d; P 15 N-kimerülés vizeletben kinetikája) bi-exponenciális modellt igényelt, két sebességgel két - gyors és lassú - fázisban (Martinez del Rio és Carleton, 2012). A modellparaméterek közötti különbségeket a kezelések között csillagok ábrázolják (** P 15 N-kimerülés kinetikája vizeletekben 15 N-os étrend-váltás után (lásd: Anyag és módszerek) kiegyensúlyozottan (vékony vonal) vagy kiegyensúlyozatlanul (vastag) táplált Charolais hízó bikákban. A metionin-tartalom szempontjából kiegyensúlyozatlan étrenddel etetett állatokkal összehasonlítva (n = 17) a metioninban kiegyensúlyozott étrenddel etetett állatok (n = 17) hasonló vizelet 15 N-kimerülési arányt mutattak mindkét első gyors ( 80,0%/d; P = 0,92) és a második lassú (9,10%/d; P = 0,80) fázis. cselekvés-haladás változó megközelítés [ln (1-F); lásd: Anyagok és módszerek] diagnosztizálásához, hogy a vizeletben a 15 N kimerülési kinetika megfelelő legyen, két exponenciális modellre volt szükség, két sebességgel két - gyors és lassú - fázisban (Martinez del Rio és Carleton, 2012).

A metioninban kiegyensúlyozatlan étrenddel etetett állatokkal (n = 17) összehasonlítva, a metioninban kiegyensúlyozott étrenddel etetett állatok (n = 17) hasonló vizelet 15 N-kimerülési arányt mutattak az első gyorsnál (80,0%/d; P = 0,92) a második lassú (9,10%/d; P = 0,80) fázis. Az Inset a reakció-haladás változó megközelítést jelenti [ln (1-F); lásd: Anyagok és módszerek] diagnosztizálásához, hogy a vizeletben a 15 N kimerülési kinetika megfelelő legyen, két exponenciális modellre volt szükség, két sebességgel két - gyors és lassú - fázisban (Martinez del Rio és Carleton, 2012).

A plazma izotópforgalmi sebessége

A plazmafehérjék δ 15 N kinetikája esetében a reakció előrehaladásának megközelítése egyetlen meredekséget mutatott (a 3. és 4. ábrán látható betétek). Ez bebizonyította, hogy a diéta-váltás után a plazmafehérjékben egyetlen, homogén 8 δ 15 N kimerülés mutatkozik, és igazolta, hogy a mono-exponenciális modell elegendő ahhoz, hogy megfeleljen ezeknek az adatoknak. Az egyedi δ 15 N kinetika a plazmafehérjékben valóban helyesen illeszkedett (r2 ≥ 0,98; n = 36) egy mono-exponenciális aszimptotikus modellen keresztül. Amikor az összes adatot összevontuk és vegyes hatású aszimptotikus modellen keresztül elemeztük, alacsonyabb plazmafehérje δ 15 N értékeket figyeltünk meg a magasan táplált állatokban a normál fehérjetartalmú étrendhez képest (3. ábra) az első napon (d0; P = 0,04) és egyensúlyi állapotban. (d142; P = 0,09). Ezzel szemben a kiegyensúlyozó étrendnek a metionintartalomra gyakorolt hatása (P = 0,09) a plazmafehérjék d0-jánál magasabb δ 15 N értéket mutatott (4. ábra), de nem egyensúlyi helyzetben (P = 0,47). A 15 N-kimerülés aránya a plazmafehérjékben magasabb volt a magas táplálékkal rendelkező állatoknál a normál fehérjetartalmú étrendhez képest (4,42 vs 4,08%/nap; P = 0,02), és a táplált étrendben kiegyensúlyozott volt a metionin egyensúlyhiányához képest (4,38 vs 4,10%/d; P = 0,05).

A metioninban kiegyensúlyozatlan étrenddel etetett állatokkal összehasonlítva (n = 18) a metioninban kiegyensúlyozott étrenddel etetett állatok (n = 18) magasabb plazmafehérje δ 15 N értékeket mutattak a 0. időpontban (15,9 vs. 15,0 ‰; P = 0,05) és magasabb frakcionált a plazmafehérje 15 N-kimerülésének aránya (4,38 vs. 4,10%/nap; P = 0,05). Az Inset a reakció-haladás változó megközelítést jelenti [ln (1-F); lásd: Anyagok és módszerek], diagnosztizálva, hogy egy mono-exponenciális modell elegendő ahhoz, hogy a plazmafehérjékben a 15 N kimerülési kinetika megfelelően illeszkedjen (Martinez del Rio és Carleton, 2012). A modellparaméterek közötti jelentős különbségeket a kezelések szimbólumokkal ábrázolják († P 15 N-kimerült egy izotópos étrend-váltás után a hosszú távú WBPT és az FSR plazmafehérje nem invazív (vagy kevésbé invazív) proxykat képviselnek. nagyon hasznos lehet a takarmány-hatékonyság (a fehérjeforgalom, mint energiafogyasztó folyamat), az állati robusztusság (a fehérjeforgalom mint karbantartó szolgáltatás) és a húsminőség (a post mortem proteolízis sebességéhez és így a húshoz kapcsolódó in vivo fehérjeforgalom) jövőbeni tanulmányaihoz gyengédség) számos állatnál.

Az izotóp-forgalom sebességének biológiai jelentése

Az itt leírt módszer egyszerűsége ellentétben áll azzal, hogy az eredmények értelmezéséhez néhány módszertani megfontolást kell kezelni. Úgy tűnik, hogy az állat szöveteinek sebessége az új étrend izotópos aláírását magában foglalja, sok korábbi jelentés szerint főleg a fehérjeforgalmi arányuk vezérli (Carleton és Martinez del Rio, 2005; MacAvoy és mtsai, 2005; Braun és mtsai., 2013). Sőt, ezt mechanisztikus modellek is megerősítették (Martinez del Rio és Carleton, 2012; Poupin és mtsai, 2012), demonstrálva, hogy az új étrendi δ 15 N érték diétát követő szövetbe történő asszimilációjának sebességét meghatározó fő mozgatórugó -kapcsoló annak a szövetnek a fehérje FSR-je. Így az izotóp-forgalom sebessége, amelyet a plazmafehérje-készletben találtunk (azaz a k modellparaméter; 3. és 4. ábra) a saját FSR-jét képviselte (azaz a frakcionális lebomlási sebesség és a frakcionált növekedési sebesség összegét), és javasolható a plazmafehérjék máj FSR-jének közvetett értékelésének módja. Ezzel szemben a legjobb tudomásunk szerint a vizelet izotóp-forgalmának sebességét soha nem elemezték mechanikusan, és amint azt tovább tárgyaljuk, biológiai jelentését többnyire a WBPT-nek tulajdonítják. Néhány szempontot és feltételezést azonban meg kell vitatni, hogy támogassuk biológiai értelmezésünket.

Az AA vizes oxidációval nem összefüggő és kérődző eredetű vizelet-nitrogén-vegyületek (főleg purinszármazékok [allantoin és húgysav], hippurinsav és bendő-ammónia többnyire karbamiddá alakultak), amint azt korábban említettük, vitatható, hogy valószínűleg hatással van a vizelet 15 N kimerülési sebességének (k1) első gyors fázisára, de amíg az ilyen vegyületek plazmafelszívódása idővel viszonylag állandó marad, addig ezek nem lesznek hatással e kimerülés második lassú fázisára (k2). Mindezeket összevetve azt gondolhatjuk, hogy még ha a k2 nem is felel meg szigorúan csak a WBPT-nek, kvantitatívan tükrözheti ezt a fluxust, és fel lehet javasolni mint proxy annak értékelésére.

Végül felismerjük, hogy az izotóp bomlási arányokon alapuló javasolt megközelítés problematikus lehet a WBPT valós és pontos becsléséhez az aminosavak újrafelhasználásának jelensége miatt (azaz a fehérje lebomlása során felszabaduló jelölt aminosavak reinkorporációja a fehérje újrafelhasználása során). szintézis). Valójában, mivel a fehérjeforgalom általános sebessége jelentősen meghaladja az étkezési fehérjebevitel sebességét, a fehérjeszintézis aminosav-szubsztrátjainak nagy része a fehérje lebomlásából származik (Lobley, 2000). Még akkor is, ha az AA újrafelhasználása befolyásolhatja a 15N értékeket az izotópos bomlás minden egyes pontján, feltételezzük, hogy a magasabb fehérjeforgalom (amely magasabb AA-újrafelhasználással is jár) mindig magasabb k2-vel rendelkezik, mint egy alacsony fehérjetermék-forgalom. Így a kezelések (vagy akár az egyének) összehasonlítása a WBPT szempontjából ez a megközelítés továbbra is meghatalmazottként szolgálhat.

A fent említett biológiai értelmezések értékeléséhez teszteltük módszerünk azon képességét, hogy két étrendi tényező, a fehérjetartalom (normális vs magas) és az AA-profil (étrend kiegyensúlyozott és metioninban kiegyensúlyozatlan) között észlelje a különbségeket. forgalmi ráta eltérő mértékben.

Az izotóp-forgalom aránya a fehérje anyagcserét befolyásoló étrendi tényezők között

Megállapítottuk azt is, hogy a plazmafehérje 15 N-kimerülésének sebessége (k) az étkezési fehérjetartalommal együtt növekedett, támogatva a nagyobb fehérje-anyagcsere gondolatát a test minden szintjén, amint az a vizeletek elemzésével kiderült. Hasonlóképpen, Tsahar et al. (2008) a madaraknál azt is megállapította, hogy a 15 N-os forgalom aránya a plazmában megduplázódott (körülbelül 11-ről 20% -ra/nap), amikor az étkezési fehérje 7-ről 16% -ra változott. Az étkezési fehérjetartalom hatását a plazmafehérjék fehérjeforgalmi sebességére az 50-es években mutatták be Steinbock és Tarver (1954) elegáns tanulmányával, akik donor patkányok plazmáját injektálták patkányokba, amelyekben a fehérjéket korábban [35S] -nel jelölték. metionin. Ezt a hatást azonban kérődzőknél nem figyelték meg standard izotópos módszerekkel, ahol az FSR plazmafehérjék változatlanok maradtak a tejelő teheneknél, amelyek táplálékkal különböző metabolizálható fehérjetartalommal voltak ellátva (Raggio et al., 2007), vagy olyan juhoknál, akiknél az éhgyomorra táplált állapot változott (Connell et al., 1997).

Másrészt a vizeletek izotópos diétaváltást követően 15 N-ban történő fokozatos kimerülésének sebességében nem tapasztaltak változásokat a kiegyensúlyozatlan és kiegyensúlyozott étrend között a metionin-tartalom tekintetében. Ezzel szemben a plazmafehérje 15 N-kimerülési aránya kissé megnőtt, ami azt jelzi, hogy a fehérje FSR megnövekedett a plazmafehérjék esetében, és valószínűleg más testszinteken is. Eredményeink arra utalhatnak, hogy a Met kiegyensúlyozott étrend megfigyelt tendenciája a húsmarhák teljesítményének javítása érdekében, amelyet ebben a kísérletben (Cantalapiedra-Hijar et al., 2017) és mások (Wessels et al., 1997) megfigyeltek, az egész test megnövekedett fehérjéből eredhet. szintézis helyett az egész test fehérjebontásának csökkenése.

Következtetések

Úgy gondoljuk, hogy az állat vizeleteinek 15 N-ban történő kimerülése az étrendben a 15 N-vel jelölt karbamid beadásának abbahagyása után (azaz az izotóp-forgalom sebessége az étrend váltása után) nem invazív és egyszerű proxyként javasolható, hogy értékelje hosszú távon az egész test fehérjeforgalmának mértéke nagyszámú állatnál. További vizsgálatok szükségesek ennek az új ígéretes izotópos megközelítésnek a lehetőségeinek és korlátainak feltárására a fehérjeforgalom értékelésére. A jövőbeni munkáknak ki kell értékelniük az AA újrafelhasználásának és a karbamid-N újrafeldolgozásnak a vizeletben és a szövetekben lévő N izotóp dinamikára gyakorolt hatását egy étrend-váltás után.

Segítő információ

A) Mono-exponenciális modell (hasonlóan a plazmafehérjékhez), ahol a δ 15 N kinetika megfelelően illeszkedik a δ 15 N (t) = δ 15 N∞ + (δ 15 N0 - δ 15 N∞) × e − k × t és egyetlen meredekséget észlelünk, amikor a reakció előrehaladásának változójának logaritmusa (1-F = (5 15 N (t) - 8 15 N∞)/(8 15 N0 - 8 15 N∞)) időben visszafejlődik. B) Bi-exponenciális modell (mint a vizeletben), ahol a δ 15 N kinetika megfelelően illeszkedik a δ 15 N (t) = δ 15 N∞ + (δ 15 N0 - δ 15 N∞) × [p × e-k1 × t + (1-p) × e-k2 × t] és két különböző meredekséget észlelünk, amikor a reakció előrehaladásának változóinak logaritmusát időben visszafejlesztjük. A két különböző lejtés az első tranziens (k1) és egy második tartós (k2) fázisban a frakcionális forgalmi arányokat képviseli.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak Vincent Largeau-nak és a Herbipôle cuccainak a kísérlet során nyújtott nagy technikai segítségükért. Az INRA fázisosztályát elismerték, hogy támogatja az itt bemutatott kísérlet körülményeinek megalapozását szolgáló kísérleti tanulmányt.