Kísérleti
és terápiás
Gyógyszer

  • Journal Home
  • Jelenlegi probléma
  • Közelgő kérdés
  • Legolvasottabb
  • Legtöbbször idézett (dimenziók)
    • Az elmúlt két év
    • Teljes
  • Legtöbbször idézett (CrossRef)
    • Az elmúlt év 0
    • Teljes
  • Közösségi média
    • Múlt hónap
    • Múlt év
    • Teljes
  • Archívum
  • Információ
  • Online benyújtás
  • Információ a szerzőknek
  • Nyelv szerkesztése
  • Információ a bírálók számára
  • Szerkesztési irányelvek
  • Szerkesztőbizottság
  • Célok és hatály
  • Kivonatolás és indexelés
  • Bibliográfiai információk
  • Információ a könyvtárosoknak
  • Információ a hirdetők számára
  • Újranyomtatások és engedélyek
  • Lépjen kapcsolatba a szerkesztővel
  • Általános információ
  • A Spandidosról
  • Konferenciák
  • Munkalehetőségek
  • Kapcsolatba lépni
  • Felhasználási feltételek
  • Szerzői:
    • Xin-Bang Mao
    • Yan-Hua Cheng
    • Yan-Ying Xu

  • Ezt a cikket a következők említik:

    Absztrakt

    Anti-miR-204-5p [adenovírus AAV-U6-rno-miR-204-5p-CAG-fokozott zöld fluoreszcens fehérje (EGFP); macska. nem. MICA2014002038], miR-204-5p utánzó (adenovírus AAV-U6-utánzó-rno-miR-204-5p-CAG-EGFP, 5′-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3 ′) és negatív kontroll miRNS (neg-miR, adenovírus AAV-U6 -imim-rno-negatív-miR-CAG-EGFP, 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ') a Shanghai GeneChem Co., Ltd.-től (Shanghai, Kína) szereztük be. A cukorbeteg patkányokat véletlenszerűen három csoportra osztották: Neg-miR, anti-miR-204-5p és utánzó csoportokra. Az anti-miR-204-5p csoportba tartozó cukorbeteg patkányokba (n = 15) anti-miR-204-5p adenovírust (4,1x1012 vírusgenom/ml) injektáltunk a farokvénán keresztül. A mimikai csoportba tartozó diabéteszes patkányok (n = 15) miR-204-5p utánzó adenovírust kaptak (4,1x1012 vírusgenom/ml). A neg-miR csoportba (n = 15) ugyanannyi neg-miR adenovírust injektáltunk. A 8. héten a retina szöveteit extraháltuk további vizsgálat céljából, az alábbiakban részletezett módon.

    elősegíti

    Patkányok retina hámsejtek (rREC) tenyészete

    Öt cukorbeteg patkányt altattunk pentobarbitál-nátrium (30 mg/kg) intraperitoneális injekciójával. Érzéstelenítés alatt a diabéteszes patkányok szemgolyóját izolálták a diabéteszes patkányoktól, és a következő patkányokat halálos adag pentobarbitál (100 mg/testtömeg-kg) alkalmazásával feláldozták. A retinát elválasztottuk a szemgolyótól, és Hanks kiegyensúlyozott sóoldattal (H1020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Peking, Kína) mostuk, és sebészeti ollóval apró darabokra (1 × 1 mm) daráltuk. 30 µm-es nejlonszitán történő szűrést követően a retinát 2,5% tripszinnel emésztettük 30 percig, 37 ° C-on. Szobahőmérsékleten végzett centrifugálást (1500 × g 5 percig) követően az rREC-ket izoláltuk és Dulbecco módosított Eagle-táptalajában (DMEM; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) tenyésztettük, amely 20% szarvasmarha-magzati szérumot (FBS) tartalmazott. Sigma-Aldrich; Merck KGaA) 37 ° C-on, 5% CO 2 -val. A táptalajt háromnaponta cserélték. Az rREC-ket az endoteliális homogenitás szempontjából a VII. faktor antigénnel szembeni immunreaktivitás vizsgálatával azonosítottuk. Az rREC-ket 4% paraformaldehiddel rögzítettük, 2% BSA-val blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, és egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk egér anti-VII faktor ellenanyaggal (kat. sz. ab97614; Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság). A sejteket mostuk és Alexa Fluor® 647-el konjugált szamár nyúl elleni immunglobulin G másodlagos antitestekkel (katalógusszám: ab150075; Abcam) inkubáltuk 37 ° C-on 2 órán át. Ezután a sejteket DAPI-val (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) festettük 10 percig szobahőmérsékleten. A jeleket fluoreszcens inverz mikroszkóppal detektáltuk, × 200-as nagyítással. A harmadik részt előkészítettük a későbbi kísérletekhez.

    Az rREC-eket 6 lyukú lemezekre oltottuk 1x106 sejt/lyuk arányban, és 10% FBS-sel kiegészített DMEM-ben tenyésztettük. 70-80% -os sűrűség mellett a sejteket 100 nM miR-204-5p utánzattal (az utánzó csoport), miR-204-5p inhibitorral (az anti-miR-204-5p csoport) vagy neg-miR-rel (a neg miR csoport) Lipofectamine 3000-vel (Roche Diagnostics, Bázel, Svájc). A transzfekció hatékonyságát RT-qPCR segítségével határoztuk meg. 48 óra múlva sejteket gyűjtöttünk az utánkövetési kísérletekhez.

    Transzmissziós elektronmikroszkópia

    Az 1 x 105 sejt/üreg sűrűségű rREC-eket 2,5% glutáraldehiddel rögzítettük 0,1 M foszfátpufferben (pH = 7,4) 2 órán át szobahőmérsékleten. 0,1 M foszfátpufferrel végzett mosás után a mintákat 1% -os ozmium-tetroxiddal 1 órán át szobahőmérsékleten festettük. Etanolgradienssel végzett dehidratálást követően a mintákat LX-112 gyantába ágyaztuk, és egy éjszakán át 70 ° C-on melegítettük. A metszeteket ultravékony metszetekre vágtuk (70 nm), és FEI Tecnai Spirit transzmissziós elektronmikroszkóppal (FEI; Thermo Fisher Scientific, Inc.) készítettük felvételeket × 1700 és × 5000 nagyítással.

    RT-qPCR elemzés
    Western blottolás

    A fehérjéket retina szövetekből és rREC-ekből izoláltuk radioimmunprecipitációs vizsgálati puffer (Sigma-Aldrich; Thermo Fisher Scientific, Inc.) alkalmazásával. A fehérjekoncentrációt bicinchonininsav-készlettel (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kína) határoztuk meg a gyártó protokollja szerint. Azonos mennyiségű fehérjét (60 ug) elválasztottuk SDS-PAGE alkalmazásával 12% -os géleken, majd polivinilidén-difluorid membránokra (Millipore; Merck KGaA) vittük át. Miután 5% zsírmentes tejjel 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk, a membránokat nyúl anti-LC3B antitesttel (katalógusszám: ab51520; 1: 3000; Abcam) vagy anti-β-aktinnal (kat. Szám: ab8226) vizsgáltuk. 1: 1 000; Abcam) egy éjszakán át 4 ° C-on. Ezután a membránokat TBS-sel és Tween-20-al (0,1%) mostuk, és torma-peroxidázzal konjugált kecske nyúlellenes szekunder antitestekkel inkubáltuk (katalógusszám: sc-516078; 1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, USA). TX, USA) 2 órán át 37 ° C-on. A célsávokat egy továbbfejlesztett kemilumineszcencia detektáló készlettel fejlesztettük ki (Amersham; GE Healthcare, Chicago, IL, USA). A sávsűrűségeket az 1. számú szoftver 4.5.1 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) verziójával számítottuk, és β-aktinná normalizáltuk.

    Immunhisztokémia

    A retina szöveteket az STZ injekciót követően 8 héttel izoláltuk a különböző csoportokból, 10% frissen készített jéghideg paraformaldehiddel rögzítettük 4 ° C-on egy éjszakán át, és 5 um-os metszetekre vágtuk. A metszeteket 5% szarvasmarha-szérum albuminnal (BSA; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) inkubáltuk 37 ° C-on 1 órán át, hogy blokkolják a nem specifikus helyeket. Ezután a metszeteket nyúl poliklonális anti-LC3B antitesttel (1: 1 000) inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. PBS-sel (3x) végzett mosás után a tárgylemezeket torma-peroxidázzal konjugált kecske nyúlellenes antitestekkel vizsgáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. Az immunoperoxidáz kötődését diaminobenzidin-H 2 O 2 oldattal reagáltattuk. Öt nem egymást átfedő mezőt véletlenszerűen rögzítettek egy invertált mikroszkóppal, × 400-as nagyítással. Az LC3B-pozitív sejteket barna vagy sötét sárga színnel festettük.

    Statisztikai analízis

    1.ábra.

    2. ábra.

    3. ábra.

    4. ábra.

    Az miR-204-5p in vitro szabályozza az LC3B-II expresszióját és az LC3B-II/LC3B-I arányát. Az rREC-ket izoláltuk cukorbeteg patkányokból, és anti-miR, imitáló ant neg-miR-rel transzfektáltuk. (A) Az rREC-k tisztaságát a VII-es faktor festéssel határoztuk meg; a VII-es faktor pozitív sejtjei vörös színnel, a sejtmagok pedig kék színnel jelennek meg. Méretarány, 100 µm. (B) Az autofág vakuuolák mennyiségét transzmissziós elektronmikroszkóppal határoztuk meg (nagyítás, × 1700 és × 5000). Skála fehér színben, 2 µm; skála piros színnel, 1 µm. (C) A miR-204-5p expressziós szintje transzfektált sejtekben. (D) Western blot képek és az LC3B-II fehérje expressziójának kvantitatív elemzése és (E) az LC3B-II/LC3B-I arány. (F) a VEGF mRNS expressziós szintje. A miR-204-5p relatív expresszióját U6-ra normalizáltuk, a VEGF-et pedig β-aktinná normalizáltuk. ** P 1

    Santos LL, Lima FJC, Sousa-Rodrigues CF és Barbosa FT: SGLT-2 inhibitorok alkalmazása a 2-es típusú diabetes mellitus kezelésében. Rev Bras Med Bras (1992). 63: 636–641. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Murchison AP, Hark L, Pizzi LT, Dai Y, Mayro EL, Storey PP, Leiby BE és Haller JA: A szemgondozás be nem tartása cukorbetegeknél. BMJ Open Diabetes Res Care. 5: e0003332017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Leasher JL, Bourne RR, Flaxman SR, Jonas JB, Keeffe J, Naidoo N, Pesudovs K, Price H, White RA, Wong TY és mtsai: Erratum. Globális becslések a diabéteszes retinopátia által vakok vagy látássérültek számáról: 1990–2010 közötti metaanalízis. Diabetes Care 2016; 39: 1643-1649. Cukorbetegség ellátása. 39: 20962016. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Arroba AI, Campos-Caro A, Aguilar-Diosdado M és Valverde AM: IGF-1, gyulladás és retina degeneráció: szoros hálózat. Első idősödő neurosci. 10: 2032018. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Hou L, Wei L, Zhu S, Wang J, Quan R, Li Z és Liu J: A madár metapneumovírus C alcsoport autofágiát indukál az ATF6 UPR útvonalon keresztül. Autofágia. 13: 1709–1721. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Wang L, Feng D, Liu Y, Li S, Jiang L, Long Z és Wu Y: Az autofágia védő szerepet játszik a motoros idegsejtek degenerációjában a gerincvelő iszkémiáját/reperfúzió okozta spasztikus bénulást követően. Am J Transl Res. 9: 4261–4270. 2017. PubMed/NCBI

    Gao N, Wang H, Yin H és Yang Z: Az angiotenzin II a reaktív oxigénfajok szintjének emelésén keresztül kalcium-közvetített autofágiát indukál a podocytákban. Chem Biol Interact. 277: 110–118. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Wang T, Zhang L, Hu J, Duan Y, Zhang M, Lin J, Man W, Pan X, Jiang Z, Zhang G és munkatársai: Az Mst1 részt vesz az érelmeszesedés előrehaladásában makrofág autofágia gátlás és makrofág apoptózis fokozás révén. J Mol Cell Cardiol. 98: 108–116. 2016. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Dehdashtian E, Mehrzadi S, Yousefi B, Hosseinzadeh A, Reiter RJ, Safa M, Ghaznavi H és Naseripour M: Diabetikus retinopátia patogenezise és a melatonin enyhítő hatásai; autofágia, gyulladás és oxidatív stressz érintettsége. Life Sci. 193: 20–33. 2018. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Lopes de Faria JM, Duarte DA, Montemurro C, Papadimitriou A, Consonni SR és Lopes de Faria JB: Defektív autofágia diabéteszes retinopathiában. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57: 4356–4366. 2016. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, Yamamoto A, Kirisako T, Noda T, Kominami E, Ohsumi Y és Yoshimori T: Az LC3, az Apg8p élesztő emlős homológja feldolgozás után autofagoszóma membránokban lokalizálódik. EMBO J. 19: 5720–5728. 2000. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Alizadeh S, Mazloom H, Sadeghi A, Emamgholipour S, Golestani A, Noorbakhsh F, Khoshniatnikoo M és Meshkani R: Bizonyíték a hibás autofágia és a gyulladás közötti kapcsolatra 2-es típusú diabéteszes betegek perifériás vér mononukleáris sejtjeiben. J Physiol Biochem. 74: 369–379. 2018. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Chandra S, Vimal D, Sharma D, Rai V, Gupta SC és Chowdhuri DK: A miRNS-ek szerepe a fejlődésben és a betegségben: Kis organizmusok tanulságai. Life Sci. 185: 8–14. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Nadeem A, Ashraf MR, Javed M, Hussain T, Tariq MS és Babar ME: Review-microRNAs: A paradigma a betegségek mechanisztikus betekintése felé. Pak J Pharm Sci. 31: 2017–2026. 2018. pubMed/NCBI

    Gong Q, Xie J, Liu Y, Li Y és Su G: Differenciálisan expresszált mikrorák a korai diabéteszes retinopathia kialakulásában. J Diabetes Res. 2017: 47279422017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Chen Q, Qiu F, Zhou K, Matlock HG, Takahashi Y, Rajala RVS, Yang Y, Moran E és Ma JX: A mikroRNS-21 kórokozó szerepe a diabéteszes retinopátiában a PPARα csökkentésével. Cukorbetegség. 66: 1671–1682. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Haque R, Iuvone PM, He L, Choi KSC, Ngo A, Gokhale S, Aseem M és Park D: A MicroRNA-21 jelátviteli út hiperglikémiás reakcióban vesz részt a prorenin receptor (PRR) által indukált VEGF expressziójában ARPE-19 sejtekben állapot. Mol Vis. 23: 251–262. 2017. PubMed/NCBI

    Gomaa AR, Elsayed ET és Moftah RF: MicroRNA-200b expresszió proliferatív diabéteszes retinopátiában szenvedő betegek üvegtestében. Szemészeti Res. 58: 168–175. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Wu JH, Gao Y, Ren AJ, Zhao SH, Zhong M, Peng YJ, Shen W, Jing M és Liu L: Megváltozott mikroRNS expressziós profilok a retinákban diabéteszes retinopathiában. Szemészeti Res. 47: 195–201. 2012. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Gao J, Wang Y, Zhao X, Chen P és Xie L: A SIRT1 MicroRNS-204-5p-mediált szabályozása hozzájárul a hámsejtciklus átjárásának késleltetéséhez a diabéteszes szaruhártyákban. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56: 1493–1504. 2015. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Nathan DM, Buse JB, Davidson MB, Heine RJ, Holman RR, Sherwin R és Zinman B: A hiperglikémia kezelése 2-es típusú cukorbetegségben: Konszenzusos algoritmus a terápia megkezdéséhez és beállításához. Az amerikai diabétesz szövetség és az európai szövetség konszenzusos nyilatkozata a cukorbetegség tanulmányozásáról. Diab Tologia. 49: 1711–1721. 2006. Cikk megtekintése: Google Scholar

    Livak KJ és Schmittgen TD: Relatív génexpressziós adatok elemzése valós idejű kvantitatív PCR és 2 (-Delta Delta C (T)) módszerrel. Mód. 25: 402–408. 2001. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Rubsam A, Parikh S és Fort PE: A gyulladás szerepe a diabéteszes retinopathiában. Int J Mol Sci. 19 (pii): E9422018. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Kaneko H és Terasaki H: A mikroRNS-ek biológiai szerepe a proliferatív vitreoretinopathiában. Transl Vis Sci Technol. 6: 52017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Wu D, Pan H, Zhou Y, Zhang Z, Qu P, Zhou J és Wang W: A mikroRNS-204 felülszabályozása gátolja a sejtszaporodást, a migrációt és az inváziót az emberi vesesejtes karcinóma sejtekben az SOX4 csökkentésével. Mol Med Rep. 12: 7059–7064. 2015. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Liu J és Li Y: A trichostatin A és a Tamoxifen gátolja az emlőrák sejtjeinek növekedését az miR-204 és az ERalpha redukáló AKT/mTOR útvonal révén. Biochem Biophys Res Commun. 467: 242–247. 2015. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Lorenzon L, Cippitelli C, Avantifiori R, Uccini S, French D, Torrisi MR, Ranieri D, Mercantini P, Canu V, Blandino G és Cavallini M: A lefelé szabályozott miR-ek kifejezetten korrelálnak a nem kardiális gyomorrákokkal és Lauren osztályozási rendszerével. J Surg Oncol. 116: 184–194. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Palkina N, Komina A, Aksenenko M, Moshev A, Savchenko A és Ruksha T: miR-204-5p és miR-3065-5p tumorellenes hatást fejt ki a melanoma sejtekre. Oncol Lett. 15: 8269–8280. 2018. pubMed/NCBI

    Gao W, Wu Y, He X, Zhang C, Zhu M, Chen B, Liu Q, Qu X, Li W, Wen S és Wang B: A MicroRNA-204-5p gátolja a villásfej elnyomásával a gége laphámsejtének invázióját és áttétjét. C1. rovat J Rák. 8: 2356–2368. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Li H, Wang J, Liu X és Cheng Q: A MicroRNS-204-5p az IL6R megcélzásával elnyomja az IL6 által közvetített gyulladásos választ és a kemokinképződést a HK-2 vese tubuláris hámsejtekben. Biochem Cell Biol. 2018. (Epub a nyomtatás előtt). Cikk megtekintése: Google Scholar

    Mizushima N, Levine B, Cuervo AM és Klionsky DJ: Az autophagy sejtes önemésztéssel küzd a betegség ellen. Természet. 451: 1069–1075. 2008. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Volpe CMO, Villar-Delfino PH, Dos Anjos PMF és Nogueira-Machado JA: Sejthalál, reaktív oxigénfajok (ROS) és diabéteszes szövődmények. Cell Death Dis. 9: 1192018. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Levine B és Kroemer G: Autofágia a betegség patogenezisében. Sejt. 132: 27–42. 2008. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Yoshii SR és Mizushima N: Az autofágia monitorozása és mérése. Int J Mol Sci. 18 (pii): E18652017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Li XC, Hu QK, Chen L, Liu SY, Su S, Tao H, Zhang LN, Sun T és He LJ: A HSPB8 elősegíti az autofagoszóma és a lizoszóma fúzióját az autofágia során a diabéteszes neuronokban. Int J Med Sci. 14: 1335–1341. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Cai X, Li J, Wang M, She M, Tang Y, Li H és Hui H: A GLP-1 kezelés javítja a diabéteszes retinopathiát azáltal, hogy a GLP-1R-ERK1/2-HDAC6 jelátviteli útján enyhíti az autofágia kialakulását. Int J Med Sci. 14: 1203–1212. 2017. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Kobayashi S, Xu X, Chen K és Liang Q: Az autofágia szuppressziója védelmet nyújt a magas glükóz által kiváltott kardiomiocita sérülés esetén. Autofágia. 8: 577–592. 2012. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Rodrigues M, Xin X, Jee K, Babapoor-Farrokhran S, Kashiwabuchi F, Ma T, Bhutto I, Hassan SJ, Daoud Y, Baranano D és mtsai: A hipoxiás muller sejtek által kiválasztott VEGF MMP-2 expressziót és aktivitást indukál az endothelben sejtek a retina neovaszkularizációjának elősegítésére proliferatív diabéteszes retinopathiában. Cukorbetegség. 62: 3863–3873. 2013. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Nishijima K, Ng YS, Zhong L, Bradley J, Schubert W, Jo N, Akita J, Samuelsson SJ, Robinson GS, Adamis AP és Shima DT: Az A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor a retina idegsejtjeinek túlélési tényezője és kritikus neuroprotektor az iszkémiás sérülésre adott adaptív válasz során. Am J Pathol. 171: 53–67. 2007. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    Gilbert RE, Vranes D, Berka JL, Kelly DJ, Cox A, Wu LL, Stacker SA és Cooper ME: Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor és receptorai a kontroll és a cukorbeteg patkány szemében. Lab Invest. 78: 1017–1027. 1998. PubMed/NCBI

    Bai Y, Ma JX, Guo J, Wang J, Zhu M, Chen Y és Le YZ: A Muller sejtből származó VEGF jelentősen hozzájárul a retina neovaszkularizációjához. J Pathol. 219: 446–454. 2009. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI

    kapcsolódó cikkek

    2019. április
    17. évfolyam 4. szám

    ISSN nyomtatvány: 1792-0981
    Online ISSN: 1792-1015