1. példa

Az oligouronátok hatása a Matrigel tulajdonságaira

A gyártó által kapott Matrigelt (BD Biosciences) használtuk. A tesztelt G-blokkot (dp10, szénszűrt) 10 mg/ml koncentrációban fiziológiás sóoldatban (150 mM NaCl) oldjuk. A G-blokk-oldatot és a fiziológiás sóoldatot jégen, az Ependorf-állvány és a pipetta hegyét lehűtjük. A Matrigelt (4 × Ependorf 100 μl tartalommal) jégen felolvasztottuk.

Kontrollként 100 μl fiziológiás sóoldatot adunk a 2 Matrigel Ependorf mindegyikéhez, és a teljes keverés érdekében fel és le pipettázzuk. A 2 cső tartalmát összekeverték és jégen tárolták.

A G-blokk teszteléséhez 100 μl G-blokk-oldatot adunk a 2 Matrigel Ependorf mindegyikéhez, és pipettázzuk fel és le a teljes keverés elérése érdekében. A 2 cső tartalmát összekevertük és jégen tároltuk.

300 μl kontroll vagy Matrigel-oldatot vittünk reometrikus lemezekre 10 ° C-on (C 40/1 geometriával) a reológiai méréshez. A komplex modulust (G * Pa-ban) 10-37 ° C-os hőmérsékleti sweep-en mértük., ½ ° perc −1. A G * a vizsgált anyag mechanikai tulajdonságait jelzi. Az eredményeket a 2. ábra mutatja. 1.

A kísérletet megismételtük más oligouronátokkal: kontroll (mint fent), G-blokk10 (Dp 10, 94% G: 5 mg/ml), G-blokk20 (Dp 20, 90% G; 5 mg/mi), M- blokk (Dp 20, 100% M; 5 mg/ml) és galakturonát oligomer (nincs teljesen elemezve, de feltételezhetően Dp értéke 10-20 és több mint 80% galakturonát (GaIU); 5 mg/ml). Az eredményeket a 2. ábra mutatja. 2.

A kísérletben csak a gélképződés kinetikáját vizsgálták, az egyensúlyi tulajdonságokat nem. Mindazonáltal ezekből az ábrákból látható, hogy az oligouronátok, különösen az alginát oligomerek és különösen a G-blokk oligomerek (oligoguluronátok) hatással voltak a matrigel ECM készítmény reológiájára, és különösen hatékonyak a G * redukciójában. Ez egyértelműen jelzi, hogy a struktúrát befolyásolják (megszakítják), és az ECM szilárd jellegű viselkedése csökken. Más szavakkal, az oligoruronátok csökkentik az ECM gélesedését vagy gélszerű viselkedését.

A G-blokk hatása önmagában vagy gemcitabinnal kombinálva a Capan-2 humán hasnyálmirigy tumor Xenograft modelljében

Ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy a Cap-2 humán hasnyálmirigy-tumor xenograft modelljében gemcitabinnal kombinálva a G-Block mint enhancer tumorellenes aktivitását értékelje. A gemcitabint olyan szinten adagolták, amely nem lenne gyógyító és lehetővé tenné a koncepció értékelésének bizonyítását ebben a modellben. A hatékonyságot a kezelt csoportok tumor tömegének összehasonlításával a vivőanyag kontroll csoporttal a 11. és 74. napon, valamint a kombinációs csoportok és a megfelelő egyes szerek között a 11. és 74. napon értékeltük.

Anyagok és metódusok

A G-blokkot (Lot #PolyG 230712-Dp10, 95% G) fehér higroszkópos amorf por formájában kaptuk az NTNU Technology Transfer AS-től (Trondheim, Norvégia), és szárításig szobahőmérsékleten tároltuk felhasználásig. Az NTNU G-blokkját MilliQ vízben 70 mg/ml koncentrációban oldjuk, hogy törzsoldatként használjuk. Ezt az oldatot kb. 560 mg/kg dózis beadására használták 200 μl rögzített dózisban. A 70 mg/ml oldatot ezután 0,9% 150 mM NaCl-ban (B. Braun Medical; Irvine, Kalifornia) hígítottuk, hogy hozzávetőlegesen 200 mg/kg, 75 mg/kg, 25 mg/kg és 5 mg/ml dózist adjunk be. kg 200 μl rögzített dózis térfogatban. Az összes adagolási számítás 25 g-os állatot feltételez. Az NTNU G-Block 70 mg/ml törzsoldatát a vizsgálat kezdetén elkészítettük, és az egyes dózisok előtt hígításokra használtuk, sterilen szűrtük és 4 ° C-on tároltuk az adagok között. A fel nem használt adagolókeveréket a vizsgálat befejezése után a TD2-nél megfelelően elhelyeztük.

A gemcitabint (tétel: A892259C) oldatként kaptuk az Eli Lilly and Co.-tól (Indianapolis, India), és felhasználásig szobahőmérsékleten tároltuk. A gemcitabint sóoldattal hígítottuk (B. Braun Medical; Irvine, Kalifornia) 0,5 mg/ml koncentrációra, így 5,0 mg/kg dózist kaptunk 10 ml/kg dózistérfogatban. A gemcitabint minden adag beadása előtt frissen készítették. Az összes fel nem használt adagolókeveréket minden adag után TD2-vel helyesen adtuk el.

A vivőanyag-kontrollhoz 0,9% 150 mM NaCl oldatot adagoltunk 10 ml/kg dózis térfogatban. A vivőanyag-kontrollt szobahőmérsékleten tároltuk.

A Capan-2 humán hasnyálmirigy tumor xenograft sejtvonalat az ATCC-től kaptuk (Manassas, Va.). A tenyészeteket McCoy 5A táptalajában (Hyclone, Logan, Utah) tartottuk fenn, 10% szarvasmarha-magzati szérummal kiegészítve (Omega Scientific; Tarzana, Kalifornia), és 5% CO2-atmoszférában tartottuk őket. A tenyészetet szövettenyésztő lombikokban 1: 5 arányú osztási arányban addig bővítettük, amíg elegendő mennyiségű sejtet nem gyűjtöttünk be.

A nőstény Athymic Nude egereket (Hsd: Athymic Nude-Foxn1 nu) Harlan (Germantown, N.Y.) szállította. Az egereket 4 hetes korban fogadták. Az összes egeret a kezelés előtt hozzáfogták. Az egereket mikroizolátor ketrecekben (Lab Products, Seaford, Del.) Helyeztük el, és specifikus kórokozóktól mentes körülmények között tartottuk fenn. Az egereket a Tekland Global Diet® 2920 × besugárzott laboratóriumi állati táplálékkal etették (Harlan, Indianapolis, Ind.), És autoklávos víz szabadon elérhető volt. Minden eljárást a TGen Gyógyszerfejlesztő Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának intézményi irányelvei szerint hajtottak végre (13046. jegyzőkönyv).

A nőstény egereket szubkután oltottuk be a jobb szárba 0,1 ml 50% RPMI/50% Matrigel ™ (BD Biosciences, Bedford, Mass.) Keverékkel, amely Capan-2 tumorsejtek szuszpenzióját tartalmazta (kb. 5,0 × 106 sejt/egér). ). Az oltást követő hét napon a daganatokat féknyergekkel mértük, és a daganat tömegét az állatkísérlet-kezelő szoftverrel, a V.2.1.1. Tanulmányi igazgató (Tanulmányi napló) 1 segítségével számoltuk ki. Nyolcvan, 101-194 mg daganatméretű egeret véletlenszerű egyensúlyozással, egyenként tíz egérből álló csoportba randomizáltunk, körülbelül 140 mg átlaggal, a Study Director segítségével (1. nap). A testtömegeket akkor rögzítettük, amikor az egereket randomizáltuk, majd ezt követően hetente kétszer vettük fel a tumor mérésével együtt. Az adagolást az alábbiakban, az 1. táblázatban leírtak szerint hajtottuk végre.

Az összes csoportot a 74. napon szüntettük meg. Az egereket leöltük a vizsgálat vége előtt, ha a tumor tömege meghaladta az 1500 mg-ot. Boncoláskor a daganatokat kivágtuk az összes állatból, minden csoportban, és felére osztottuk, formalinos fiolákba helyeztük (Azer Scientific/VWR; Franklin Lakes, N. J.), majd körülbelül 24 órán át rögzítettük, majd etanolra helyeztük. A formalinnal rögzített szöveteket paraffinba ágyazták, feldolgozták, és H & E-t festettek.

Valamennyi kezelõcsoport testtömege növekszik a vizsgálat elsõ napja után, ami azt jelzi, hogy a kezelési rend jól tolerálható. Kisebb tumor nekrózist észleltek egyes egereknél. Egy egérnek (2. csoport, 10. egér) nem tipikus klinikai megfigyelések voltak, amelyeken diszkoid papulák és tömegek voltak a bőrön. Ezt a megfigyelést nem határozták meg a kezeléssel kapcsolatosan.

Az eredményeket az 1. és 2. ábra foglalja össze. 3 (A és B) és 4. Amint az az ábrákon látható, meglepő módon, mivel egyetlen szerként a G-blokk alacsonyabb átlagos daganatsúlyt eredményezett a vivőanyag-kontrollhoz képest az adagolási fázis végén. A G-blokk és a gemcitabin kombinációval végzett összes kombinált kezelés szignifikánsan csökkentette az átlagos tumor tömegét, összehasonlítva a vivőanyag kontrolljával az adagolási fázis végén. Az átlagos daganat tömegének csökkenése látható az egyes szerekkel, különösen a gemcitabinnal önmagában.

Az alábbiakban a tumor tömegének statisztikai elemzésére vonatkozunk a 2. példában közölt tanulmányban. Ez egy preklinikai vizsgálat volt, amelyben 10 egeret osztottak nyolc különböző kezelésre vehikulummal (placebo), G-Block 560 mg-mal (enhancer), Gemcitabine 5-tel. mg (onkológiai gyógyszer) vagy az 5 mg gemcitabin és 5 mg, 25 mg, 75 mg, 200 mg vagy 560 mg G-blokk kombinációja. A daganat súlyát és testtömegét az 1. napon értékeltük, majd hetente kétszer, a 74. napon végzett utolsó értékelésig.

Tumor súlya - elemzés naponta

Az AUC elemzése

Ahhoz, hogy idővel kombinált mérést kapjunk, kiszámoltuk a görbe alatti területet (AUC) a tumor súlyára vonatkozóan. Különböző AUC-értékeket számoltunk 0-60 napos, 0-50 napos, 0-39 napos és 0-29 napos időintervallumokban. Az értékeket az átlagos daganatsúlyban (Eav) fejezzük ki intervallumonként az AUC és az intervallum hosszának elosztásával.

A 3. táblázat összefoglalja az egyes kiszámított Eav paraméterek alapszintű ANOVA elemzésének eredményeit. Statisztikailag szignifikáns hatások mutathatók ki a vivőanyaghoz viszonyítva a kombinációk (az összes G-blokk dózis) esetében minden intervallumban 60 napig, az 5 mg gemcitabin esetében 50 napos intervallumokban és a G-blokkon 39 napos intervallumokban. Amint azt az egyes napok elemzésénél láttuk, a maradék szórás növekszik a napi intervallum növekedésével.

Idővel a tumor súlya növekszik, és az ANOVA modellekben a maradék variabilitás is növekszik. A 4. táblázat összefoglalja a megfelelő ANOVA modellek eredményeit a naplózott tumor tömegadatok alapján a variancia stabilizálása érdekében. Ezek a multiplikatív modellek geometriai átlagokat adnak, mivel a becslések és a kezelési csoportok közötti különbségek az ilyen geometriai átlagok arányaként lesznek kifejezve. A 95% konfidencia intervallummal rendelkező járműhöz viszonyított becsült arányokat a 3. ábra szemlélteti. 8. A CV-ben kifejezett változékonyság továbbra is növekvő tendenciát mutat, ezért az átalakulás (log-arithmation) nem tudta teljes mértékben stabilizálni. A statisztikailag szignifikáns hatásokat (szemben a járművekkel) az eredmények nagyon hasonlóak a megfelelő additív elemzési eredményekhez.

Modell alapú megközelítés

Az átlagos értékgörbék tanulmányozása a 2. ábrán. Az exponenciális függvényekkel történő közelítés úgy tűnik, hogy jól illeszkedik az átlagérték adatokhoz. Így egy modell,

ahol a C állandó (a közös kezdő daganatsúly), a tumor növekedésének ütemével az i és t kezelés során a vizsgálati időt (-1-es számú nap) illesztettük az adatokhoz. A modellezés során csak 60 napos adatokat használtak fel.

A kapott exponenciális görbéket a 3. ábra mutatja. 9 (fekete görbék) az egyes görbékkel (vékony piros görbék) és a megfigyelt átlagérték görbékkel (kék görbék) együtt. Valamennyi aktív kezelés esetében a két görbetípus nagyon hasonló. A jármű kezelése azonban némi eltérést mutat, mivel a daganat súlya itt átlagosan több mint exponenciális az elején, majd lelassul. Ezt az a három egér hajtja, amelyeknél a daganat nagyon gyorsan növekszik. 9. Másrészről, néhány, a vivőanyagot kapott egérnél a tumor súlya szinte egyáltalán nem növekszik, így az exponenciális növekedések elfogadhatóak ahhoz, hogy a csoport átlagos viselkedését tükrözzék.

ÁBRA. A 10. ábra a 8 illesztett exponenciális görbét mutatja. Felépítésükből adódóan az arányok leírják a kezelések közötti különbségeket, és ennek eredményeként az eltérések az idő múlásával monoton növekedni fognak. Az aktív kezelések és a vivőanyag arányainak különbségeit az 5. táblázat tartalmazza. Valamennyi aktív kezelés aránya statisztikailag szignifikánsan kisebb volt, mint a vivőanyag aránya. A 6. táblázat hasonlóan mutatja az aktív kezelések arányainak különbségeit. Az arányok statisztikailag szignifikánsan alacsonyabbak voltak a G-blokk és a gemcitabin minden kombinációjánál, összehasonlítva mind az 560 mg G-blokk, mind az 5 mg gemcitabin monoterápiás kezelésével.

5. TÁBLÁZAT

Becsült különbségek a járművel szemben a növekedési ütemben
Kontraszt	Becslés	95% C.	p-érték

G-Block 560 vs jármű	−0.0027	(−0.0046–0.0007)	0,007
Gemcitabine 5 vs jármű	−0.0042	(−0.0062–0.0022)

6. TÁBLÁZAT

Becsült különbségek az aktív kezelések között a növekedési ütemben
Kontraszt	Becslés	95% C.I.	p-érték

Gemcitabin 5 vs G-B 560	−0.0015	(−0.0037-0.0006)	0,166
G-B 5 + drágakő. 5 vs G-B 560	−0.0061	(−0.0085–0.0037)

A G-blokk egyedüli hatásának további vizsgálata a Capan-2 humán hasnyálmirigy tumor Xenograft modellben

Ennek a kísérletnek a célja a dózis-válasz vizsgálata és a különböző adagolási rendek összehasonlítása volt. Az anyagokat és a módszereket a 2. példában ismertettük, kizárólag a G-blokkok vonatkozásában. A G-Block két különböző adagolási rendjét teszteltük. Az első, Q3x4, G-blokk injekciót jelentett minden harmadik napon, összesen négy injekcióval, azaz a 2. példában leírtak szerint. A második Q3x10 séma szerint a G-Block injekcióit minden harmadik napon beadták, összesen tíz injekció. Az eredményeket a 2. ábra szemlélteti. 11. Minden kísérletben 5 állatcsoportot (n = 10) iv. vivőanyaggal vagy G-blokkkal három koncentrációban injektálva, ami 0,5 mg/ttkg, 25 mg/ttkg adagnak felel meg. vagy 560 mg/ttkg.

A G-blokk hatása az ECM szerkezetére

A 2. példa daganatait szövettani analízissel elemeztük a vizsgálat befejezése után. Boncoláskor a daganatokat kivágtuk az összes állatból, minden csoportban, és felére osztottuk, formalinos fiolákba helyeztük (Azer Scientific/VWR; Franklin Lakes, N. J.), majd körülbelül 24 órán át rögzítettük, majd etanolra helyeztük. A formalinnal rögzített szöveteket paraffinba ágyazták, feldolgozták, és H & E-t festettek. A szövettan a 3. ábrát eredményezi. A 12. ábra azt mutatja, hogy a G-blokkokkal kezelt állatok kevésbé sűrű extracelluláris mátrixot mutattak, amint azt az eozinnal festett területeken a fehér területek nagyobb százaléka mutatja.

A G-blokk egyetlen hatóanyagként és Herceptinnel kombinálva a tumorellenes aktivitás értékelése az SK-OV-3 humán petefészek tumor Xenograft modellben

A vizsgálat célja a G-blokk, mint fokozó anti-tumor aktivitásának értékelése Herceptinnel kombinálva az SK-OV-3 humán petefészek tumor xenograft modellben.

A G-blokkot (Lot #PolyG 230712- (Dp10, 95% G)) fehér higroszkópos amorf porként az NTNU Technology Transfer AS (Trondheim, Norvégia) szállítja, és felhasználásig szobahőmérsékleten szárítva tárolja. Az NTNU G-blokkját MilliQ vízben 70 mg/ml koncentrációban oldjuk, hogy törzsoldatként felhasználjuk. Ezt az oldatot körülbelül 25 g/testtömeg-kg adagolására használják 60 μl-es fix dózisban. A 70 mg/ml oldatot 0,9% 150 mM NaCl-dal hígítjuk, hogy más, 25 mg/kg vagy 0,5 mg/kg adagolási oldatokat készítsünk 60 μl rögzített dózisú térfogatban. Az összes adagolási számítás 25 g-os állatot feltételez. Az NTNU G-Block 70 mg/ml törzsoldatát a vizsgálat kezdetén készítjük el, és az egyes adagok előtt hígításokra használjuk, sterilen szűrjük, és az adagok között 4 ° C-on tároljuk. A fel nem használt adagolókeveréket a vizsgálat befejezése után a TD2-n megfelelően megsemmisítik.

A trasztuzumabot (Herceptin) felhasználásig szobahőmérsékleten tárolják. A trasztuzumabot 10 mg/kg dózisban, 10 ml/kg térfogatban adják be.

A vivőanyag-kontrollt 0,9% 150 mM NaCl oldattal adagoljuk 60 μl rögzített dózis térfogattal. A jármű vezérlését szobahőmérsékleten tárolják.

Az SK-OV-3 humán petefészek tumor xenograft sejtvonalat az ATCC-től (Manassas, Va.) Szereztük be. A tenyészetet 10% marhahús magzati szérummal kiegészített táptalajban tartjuk és 5% CO2 atmoszférában tartjuk. A tenyészeteket szövettenyésztő lombikokban addig bővítettük, amíg elegendő mennyiségű sejtet nem gyűjtöttünk be.

A nőstény Athymic Nude egereket Harlan (Germantown, N.Y.) szállítja. Az egereket 5 és 8 hét között fogadják. Az egereket meghatározott kórokozóktól mentes körülmények között tartjuk fenn. Az egereket a Tekland Global Diet® 2920 × besugárzott laboratóriumi állati táplálékkal etetik (Harlan, Indianapolis, India), és autoklávozott víz szabadon hozzáférhető.

SK-OV-3 humán petefészek tumor Xenograft modell

A nőstény egereket szubkután inokuláljuk a jobb szárba 0,1 ml 50% -os tápközeg/50% Matrigel ™ (BD Biosciences, Bedford, Mass.) Keverékkel, amely SK-OB-3 tumorsejtek szuszpenzióját tartalmazza (kb. 5,0 × 106 sejt /egér).

A kezelést az 1. napon kezdjük, az alábbi 7. táblázat szerint. A daganat térfogatát és testtömegét hetente kétszer mérjük. Az adagolást az alábbiakban, az alábbi 7. táblázatban leírtak szerint végezzük.

Az egereket a vizsgálat vége előtt feláldozzuk, ha a tumor térfogata meghaladja a 3000 mm 3 -et. Boncoláskor a daganatokat minden csoportban levő összes állatból kivágják, és felére osztják, formalin injekciós üvegekbe teszik (Azer Scientific/VWR; Franklin Lakes, N. J.), és körülbelül 24 órán át rögzítik, mielőtt etanolba helyeznék. A formalinnal rögzített szöveteket paraffinba ágyazzák, feldolgozzák, és H & E-t festenek.

A diákok t-tesztjét és a% T/C számításokat elvégezzük. Növekedési görbéket és az egér tömegének százalékos változását ábrázoló grafikonokat készítünk a terápiák dózis-toleranciájának értékelésére.

A tumorszövet limfocita infiltrációja

A 2. példa szerint kapott tumorszövet mintákat eltávolítottuk az egerekből post mortem-ből, beágyazott paraffint készítettünk és fénymikroszkópiára készítettük H&E festéssel.

Különbségeket figyeltünk meg a limfociták megfigyelésében a szöveti szakaszokon belül a kontroll és a G-blokkkal kezelt csoport egereitől (lásd a 13A. És B. Ábrát). A G-blokk-kezelést kapott egerek tumorszövetében nagyobb mértékű limfocita-infiltráció volt tapasztalható, mint a kontrollcsoportba tartozó egerek tumorszövetében, amelyek nem részesültek G-blokk-kezelésben. Infiltrálódó limfociták csoportjai (piros nyilak). Az egerek sportos meztelen egerek, amelyekből hiányoznak a T-limfociták (gyilkos T-sejtek), de természetes gyilkos sejtekkel (NK sejtek) rendelkeznek.

Az extracelluláris mátrix géleket felolvasztott Matrigelből (BD Biosciences) készítettük hidegen, a kapott koncentráció 75% -ában, 2 μg/ml ALEXA488IgG-t (kecske anti-humán, Life technológiák) és vagy 5 ml/ml G-blokkot (DPn 12, 93%). Vagy ionerősségnek megfelelő sóoldat-kontroll). 200 μl mintát pipettáztunk fedőüveg kamrákba, lezártuk és 37 ° C-on 30 percig melegítettük a gélesedés kiváltására. Nagy intenzitású lézerfényt (az argon lézer 488 vonala) használtak a fluorofor jelzett IgG fehérítésére egy érdekes régióban és a fluoreszcencia helyreállításához ebben a régióban (a fehérítetlen jelölt IgG diffundálásának eredményeként az érdeklődési területre kívülről). fehérítő régiót) figyeltük.