Az öregedéssel és az elhízással kapcsolatos peri-izmos zsírszövet felgyorsítja az izomsorvadást

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Shunshun Zhu, Zhe Tian

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Kumamoto Egyetem, Japán, Kumamoto Egyetem, Orvostudományi Doktori Iskola, Molekuláris Genetika Tanszék

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Shunshun Zhu, Zhe Tian

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, vizsgálat, módszertan, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Kumamoto Egyetem, Japán, Kumamoto Egyetem, Orvostudományi Doktori Iskola, Molekuláris Genetika Tanszék

Laboratóriumi állattudományi tagsági osztály, Kumamoto Egyetem, Kumamoto, Japán

Szerepek vizsgálata, módszertan

Sürgősségi Sebészeti Osztály, Harbin Orvostudományi Egyetem első társult kórháza, Harbin, Kína

Kumamoto Egyetem, Japán, Kumamoto Egyetem, Orvostudományi Doktori Iskola, Molekuláris Genetika Tanszék

Kumamoto Egyetem, Orvostudományi Doktori Iskola, Molekuláris Genetika Tanszék, Kumamoto, Japán, Immunológiai, Allergia és Érbiológiai Tanszék, Orvostudományi Doktori Iskola, Kumamoto Egyetem, Kumamoto, Japán

Kumamoto Egyetem, Orvosi Tudományok Doktori Iskola, Molekuláris Genetika Tanszék, Japán, Kumamoto, Japán, Egészséges öregedés metabolikus szabályozásának központja (CMHA), Kumamoto Egyetem, Kumamoto, Japán

Kumamoto Egyetem, Orvostudományi Doktori Iskola, Molekuláris Genetika Tanszék, Kumamoto, Japán, Kumamoto Egérklinika, Erőforrás-fejlesztési és Elemzési Intézet (IRDA), Kumamoto Egyetem, Kumamoto, Japán

Kumamoto Egyetem, Orvostudományi Doktori Iskola, Molekuláris Genetika Tanszék, Japán, Kumamoto, Japán, Egészséges öregedés metabolikus szabályozásának központja (CMHA), Kumamoto Egyetem, Kumamoto, Japán

Kumamoto Egyetem, Kumamoto Egyetem, Orvostudományi Doktori Iskola, Molekuláris Genetika Tanszék, Japán, Immunológiai, Allergia- és Érbiológiai Tanszék, Orvostudományi Doktori Iskola, Kumamoto Egyetem, Kumamoto, Japán, Az egészséges öregedés metabolikus szabályozásának központja ( CMHA), Kumamoto Egyetem, Kumamoto, Japán

Szerepek Pénzügyszerzés, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Shunshun Zhu,
Zhe Tian,
Torigoe százados,
Jiabin Zhao,
Peiyu Xie,
Taichi Sugizaki,
Michio Sato,
Haruki Horiguchi,
Kazutoyo Terada,
Tsuyoshi Kadomatsu

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Zhu S, Tian Z, Torigoe D, Zhao J, Xie P, Sugizaki T és mtsai. (2019) Az öregedéssel és az elhízással kapcsolatos peri-izmos zsírszövet felgyorsítja az izomsorvadást. PLoS ONE 14 (8): e0221366. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0221366

Szerkesztő: Ashok Kumar, Houstoni Egyetem, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2019. május 10 .; Elfogadott: 2019. augusztus 5 .; Közzétett: 2019. augusztus 23

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a munkát a Japán Tudományfejlesztési Társaság támogatta, a 17H05652 (YO-nek) támogatás, a Japán Tudományos és Technológiai Ügynökség (JST) 13417915 (YO-nek) támogatása, az Evolúciós Tudomány és Technológia Alapkutatásának programja (CREST), a Japán Orvosi Kutatási és Fejlesztési Ügynökség (AMED) CRest programjának 18gm0610007 támogatása (YO-nek), valamint az öregedés és a hosszú élettartam mechanizmusainak tisztázására és ellenőrzésére irányuló projekt az AMED 17gm5010002 támogatásból (YO-nek). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A szarkopénia, amelyet idős embereknél a csontváz izomtömegének és erejének csökkenése jellemez, a fizikai inaktivitás miatt az életminőség (QOL) romlásának fő okaként hívja fel a figyelmet [1, 2]. A szarkopéniában szenvedők száma gyorsan növekszik, mivel az idős emberek száma világszerte növekszik [3, 4]. Egyes szarkopéniás betegek túlsúlyosak és súlyos fizikai inaktivitást mutatnak, ezt a patológiát szarkopéniás elhízásnak (SOB) nevezik [5, 6]. Azt, hogy az elhízás és/vagy az öregedés miként váltja ki az izomsorvadást, nem határozták meg teljesen.

Az elhízással járó betegségek patológiájában az ektopiás lipid felhalmozódás a nem zsírszövetekben, például a májban vagy a szív- és érrendszerben, felgyorsítja az olyan állapotok kialakulását, mint az alkoholmentes steatohepatitis és az ateroszklerotikus kardiovaszkuláris betegség [7–9], ami arra utal, hogy a lipid felhalmozódik funkciók a betegség progressziójában. Egy nemrégiben megjelent cikk arról számolt be, hogy a zsírszövet a vázizomokat körülvevő térben peri-izmos zsírszövetként (PMAT) felhalmozódott néhány idős vagy elhízott beteg esetében (10). Ebben a tanulmányban a láb zsír- és izomszövetének ultrahangos ultrahang-visszhang intenzitásával becsült aránya fordítottan összefügg az idősödő egyének izomvastagságával [10], ami arra utal, hogy az öregedő vagy elhízott esetében az ektópiás zsír felhalmozódása pozitívan korrelál izomsorvadás és az azt követő sarcopenia kialakulása.

Itt, idős és elhízott egerek felhasználásával, megmutatjuk, hogy a PMAT, amely a vázizomokat körülvevő méhen kívüli zsír felhalmozódásának tekinthető, az izom atrófiájával párhuzamosan növekszik a csökkent II típusú miofiber sejtméret miatt. Az RT-PCR elemzések összehasonlítható gén expressziós mintákat tártak fel az öregedés és az elhízott zsírszövet szekretált tényezőivel összefüggésben, ami arra utal, hogy a PMAT az izom atrófiára gyakorol közös hatást. Arra a kérdésre, hogy a PMAT hogyan befolyásolja az egerek izomsorvadását, azt tapasztaltuk, hogy az elhízott zsírszövettel átültetett egereknél a denervation okozta izomsorvadás mértéke nagyobb, mint a nem elhízott zsírszövetbe transzplantált egereknél. Nevezetesen az in vivo transzplantált elhízott zsírszövet aktiválta a FoxO transzkripciós faktorokat, és fokozta az ubiquitin által közvetített proteolízissel és az izom sejtes öregedésével járó gének expresszióját. Ezzel szemben elhízott egerekben a PMAT eltávolítása gyengítette a denervation által kiváltott izomsorvadást és elnyomta a proteolízissel és az izom öregedésével járó gének expressziójának változását. Összességében ez a tanulmány azt mutatja, hogy a PMAT lerakódása felgyorsítja az életkor és az elhízás által kiváltott izomsorvadást azáltal, hogy aktiválja a FoxO faktorokat és célpontjaikat, közvetíti az izom proteolízisét és öregedését, valamint elősegíti a szarkopénia kialakulását.

Anyagok és metódusok

Állatkísérletek

Vad típusú hím egereket (C57BL/6) és db/db (kontroll + m/+ egerekkel) hím egereket (CLEA Japan Inc. Tokió, Japán) használtunk ebben a vizsgálatban. Valamennyi egeret kórokozóktól mentes létesítményben (az Állatforrások és Fejlesztés Központjában, a Kumamoto Egyetemen, Kumamoto, Japán) ellenőriztük ellenőrzött környezeti körülmények között, 12:12 órás megvilágítással: sötét ciklus, 23 ° C-os stabil hőmérsékleten. táplált vízzel és normál étrenddel (ND) (CE-2; CLEA Japan Inc., Tokió, Japán) ad libitum.

A fiatal és idős egereket ND-vel etették, és külön-külön értékelték őket 3-6 hónapos és 18-22 hónapos kortól. Az elhízott egereket magas zsírtartalmú étrendek (HFD-32; CLEA Japan Inc., Tokió, Japán) táplálásával hozták létre 12 vagy 24 héten át, 8 hetes koruktól kezdve. A kontroll egereket normál chow-val (ND) etettük (CE-2; CLEA Japan Inc., Tokió, Japán) 12 vagy 24 hétig. A db/db egereknek megfelelő, 8 hetes db/db hím egereknek és a megfelelő + m/+ m kontroll egereknek ND-t adtunk. Az állatkísérleteket a Kumamoto Egyetem Etikai Felülvizsgálati Bizottsága hagyta jóvá.

Egér denervációs modellje és zsírszövet-transzplantációs műtét

Egy egér denerváció által kiváltott izomsorvadási modellt hoztunk létre, amint arról korábban beszámoltunk [11]. Röviden, a tíz hetes hím C57BL/6 egereket pentobarbitállal altattuk intraperitoneális injekcióval, és a jobb alsó végtag ülőidegét reszektáltuk. HFD- vagy ND-vel táplált egerek inguinalis fehér zsírszövetét (iWAT) használó transzplantációs vizsgálatok során bemetszést végeztek a jobb láb gastrocnemius izomzatának felszínén, és 20 mg inguinalis zsírszövetet ND- vagy HFD-vel tápláltak az egereket átültették a gastrocnemius izom körüli térbe. Amikor elhízott zsírszövetként db/db egerekből származó iWAT-ot használtunk, követtük az azonos eljárást, de 20 mg inguinalis zsírszövetet transzplantáltunk + m/+ m egerekből vagy db/db egerekből. Két héttel később az egereket feláldoztuk elemzés céljából.

Számítógépes tomográfia (CT)

Az egereket pentobarbitál intraperitoneális injekciójával altattuk, és a gastrocnemius izomzatát és a környező zsírt röntgencsillapítással értékeltük számítógépes tomográfiai (CT) képeken (La Theta; Aloka Ltd., Tokió, Japán).

Közvetett kalorimetria

Az egér napi aktivitását és az O2-fogyasztás (VO2, L/min) és a CO2-termelés (VCO2, L/min) szintjét közvetett kalorimetriás rendszerrel (MK-5000RQ, Muromachi Kikai Co., Ltd., Tokió, Japán) mértük. A VO2-t és a VCO2-t használtuk az EE (kcal/nap) kiszámításához Weir egyenletének felhasználásával, amelyben EE = [(VO2 × 3,941) + (VCO2 × 1,11)] × 1,44, amint arról korábban beszámoltunk [12].

C2C12 tenyésztés és myocső kezelése

A C2C12 sejteket a másutt leírtak szerint tenyésztettük [11]. Röviden, a C2C12 sejteket olyan táptalajban növesztettük, amely Dulbecco módosított Eagle táptalaját (DMEM; WAKO 044–29765, Tokió, Japán) tartalmazta, 10% magzati szarvasmarha-szérummal, 100 U/ml penicillinnel és 100 μg/ml sztreptomicinnel kiegészítve 5% -ban. CO2 nedvesített légkör 37 ° C-on. Amikor a sejtek elérték a 60–80% -os összefolyást, a táptalajt differenciáló táptalajra cseréltük, amely antibiotikumokat és jellemzően 2% lószérumot tartalmazó DMEM-et tartalmazott.

A vetés után 96 órával. A táptalajt 48 óránként cseréltük. 24 órával később, amikor megerősítettük a miocita fúziót, a PAI-1 myotube atrophiára gyakorolt hatásainak értékeléséhez 100 nM dexametazont (DEX; Sigma-Aldrich D1756-25MG, St. Louis, MO, USA) adtunk hozzá 5 vagy anélküli járműben. μg/ml PAI-1 (ab93068, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) myotube-tenyészetekhez, amint máshol beszámoltunk róla [13].

Festési eljárások

A Gastrocnemius izommintákat boncoltuk és izopentánban rögzítettük folyékony nitrogénben, és 8 μm-es szeletekre szeleteltük. Hematoxilin- és eozinfestést (H&E; Wako, Osaka, Japán) végeztünk az alapvető izommorfológia értékelésére. A keresztmetszet területét BZ-X analizátor szoftverrel elemeztük (Keyence, Osaka, Japán).

A gasztroknemiuszban történő zsírfelhalmozódás felmérése érdekében az olajvörös O (Sigma-Aldrich Co. LLC, USA) festést hajtottuk végre a korábban publikált protokollunk szerint [14]. A tárgylemezeken festett mintákat mikroszkóppal készítettük (BZ-9000 modell; Keyence, Oszaka, Japán).

Az ATPáz-festést máshol leírtak szerint végeztük [15]. Röviden: először 8 ml 0,1 M nátrium-barbitált (Nakalai Tesque, Kiotó, Japán) és 8 ml 0,18 M CaCl2-t (WAKO, Tokió, Japán) keverünk össze 24 ml ionmentes vízzel 10,3 végső pH-ig (1. keverék). Ezután 8 ml 0,1 M nátrium-barbitál, 4 ml 0,18 M CaCl2 és 100 mg ATP-dinátrium-sót (Kohjin Co., Ltd., Tokió, Japán) összekevertünk 24 ml ionmentes vízzel 9,4-es végső pH-ra (2. keverék). A mintadarabokat az 1. keverékben 15 percig rázattuk, majd a 2. keverékbe helyeztük, és további 45 percig rázattuk. A mintákat ezután 1% CaCl2-ban ötször öblítettük 10 perc alatt, és 2% CoCl2 (Nakalai Tesque, Kyoto, Japán) oldattal kezeltük 3 percig rázással. A mintákat ötször öblítettük 0,01 M nátrium-barbitállal, majd ionmentesített vízzel 3 percig. Ezután 1% -os v/v ammónium-szulfid oldatot (Kanto Chemical Co., Inc., Tokió, Japán) (1 ml NH4SO2 törzs + 99 ml D.I.H2O) adtunk a festőedénybe 1 percig. Végül a mintákat leöblítették, dehidratálták és fedőlapokkal szerelték fel.

Kvantitatív valós idejű PCR

A teljes RNS-t TRIzol reagenssel extraháltuk az előző protokollunk szerint [14]. Röviden: 1,5 μg teljes RNS-t használtunk az első szálú szintézishez cDNS reverz transzkriptázzal és random primerekkel. A DNázzal kezelt RNS-t reverz átírással Prime Script RT reagenskészlettel (Takara Bio Inc, Shiga, Japán) használtuk. A relatív transzkript bőséget normalizáltuk az egér 18S rRNS szintjéhez. Az alapozó szekvenciákat az S1 táblázat mutatja.

Western blottolás

A Western blot-ot a másutt leírtak szerint hajtották végre [15]. Röviden, 10 μg citoplazmatikus vagy magfehérjét elválasztottunk SDS-PAGE-n és PVDF membránokra vittünk. A nukleáris fehérjével rendelkező membránokat anti-Fox03a-val (# 12829) vagy anti-Fox01-gyel (# 2880) inkubáltuk. A citoplazmatikus fehérjével ellátott membránokat inkubáltuk anti-p-FoxO3a (# 2599), anti-p-FoxO1 (Ser256) (# 9461), anti-p-AKT (Ser473) (# 9271), anti-p-AKT (Thr308) alkalmazásával. ) (# 4056) vagy anti-AKT (# 9272; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) antitestek éjszakán át 4 ° C-on 1: 1000 arányban hígítva az 1. oldatban (TOYOBO, Co., Ltd., Osaka, Japán). A TBST-mosások után a membránokat HRP-vel konjugált juh-nyúl anti-IgG-vel (GE Healthcare Life Science, Piscataway, NJ, USA) inkubáltuk 1: 2000 arányban 2-es oldatban szobahőmérsékleten 60 percig. A belső kontrollok egér anti-Hsc70 (sc-7298; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA) voltak a citoplazmatikus immunblotoláshoz és az egér anti-Hiszton H3 (# 4499) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) a nukleáris immunblotoláshoz. . A normalizáláshoz Hsc70-et és H3 hisztont használtunk.

statisztikai elemzések

Az eredményeket átlag ± standard hiba (SEM) formájában jelentik. Két csoport közötti statisztikai különbségeket a párosítatlan kétfarkú Student t-teszt segítségével határoztuk meg. A statisztikai szignifikanciát p-nek tekintettük. 1. ábra. A PMAT lerakódása pozitív összefüggésben van a szarkopéniával.

(A) Testtömeg (BW), izomtömeg (MW) és MW/BW arány fiatal és idős egerekben. (B) Reprezentatív CT-képek (bal oldali panelek) és a zsírelem arány a CT-elemzés alapján (jobb oldali panel) fiatal és idős egerek alsó végtagjaiban. (C) Reprezentatív HE festés (bal oldali panelek), számszerűsített eloszlás (középső panel) és átlagos izomrost keresztmetszeti terület (CSA) (jobb oldali panel) fiatal és idős egerek alsó végtagjaiban. (D) Reprezentatív ATPáz festés (bal oldali panelek), a II típusú izomrostok CSA eloszlása (középső panel) és az átlagos CSA I típusú (fehér sejtek a bal panelen) és a II típusú (fekete sejtek a bal panelen) izomrostok az alsó végtagokban fiatal és idős egerekben (jobb oldali panel) (n = 50–100, I. típus; n = 1200–1500, II. típus). (E, F) A vázizom miozin altípusait (Myh7, Myh2, Myh1 és Myh4) (E), a sejtek öregedését (p16, p19, p21 és p57) és a fehérjebontást (Atrogin1 és Murf1) (F) relatív szintjei fiatal és idős egerek gastrocnemiusában. A transzkriptumszinteket 18s mRNS-re normalizáltuk; A fiatal egerek értékeit 1-re állítottuk. A fiatal egerek 3-6 hónaposak voltak, az idősek pedig 18-22 hónaposak voltak. (Méretarány: 100μm c-ben, d-ben). (n = 6–8 csoportonként a, e, f). Minden adat átlag ± S.E. A statisztikai szignifikanciát Student t-tesztjével határoztuk meg. *, p 2. ábra. Az idős egereknél a PMAT növekedése súlyosbodó szarkopéniával jár.

(A) Reprezentatív CT-képek (bal oldali panelek) és az alsó végtagok (jobb oldali panel) számított zsíraránya olyan idős egerekben, amelyeknél kevesebb (3. ábra). A PMAT növekszik az elhízott egereknél, és felgyorsult vázizom atrófia kíséri.