Diabétesz által kiváltott gyorsított ateroszklerózis sertésekben

Absztrakt

A cukorbetegségben szenvedő betegek kétszer-hatszor nagyobb kockázatot jelentenek az érelmeszesedés kialakulásában, mint a nem cukorbetegek (1,2), és a felnőttkori diabéteszes betegek leggyakoribb halálának oka a koszorúér-betegség (3). Ez a túlzott kockázat mind az 1., mind a 2. típusú cukorbetegségben jelentkezik (3). A cukorbetegségben szenvedőkkel szemben a szívbetegségek az élet elején megjelennek, a nőket szinte ugyanolyan gyakran érintik, mint a férfiakat, és gyakrabban végzetesek (3). Az összes 2-es típusú diabéteszes beteg 80% -a ateroszklerotikus makrovaszkuláris betegségben hal meg (4), és a felnőtt cukorbetegek hajlamosabbak más ateroszklerotikus kockázati tényezők, köztük a magas vérnyomás és a diszlipidémiák kialakulására (3). Ezenkívül a cukorbetegség inzulinszabályozásának az ateroszklerotikus betegség enyhítésében mutatott hatékonyságára vonatkozó adatok következetlenek. Bár a glikémiás kontroll javulása csökkentheti a szívbetegségek kockázatát az 1-es típusú cukorbetegeknél (3), az inzulinnal kezelt 2-es típusú cukorbetegeknél továbbra is fokozott a kardiovaszkuláris események kockázata (3).

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

A hiperlipémia és a cukorbetegség kiváltása.

Az állatokat érintő összes eljárást a Georgiai Orvosi Főiskola Állat-egészségügyi Kutatási és Oktatási Bizottsága hagyta jóvá, és azok megegyeztek az Amerikai Állatorvosi Orvosi Szövetség eutanáziával foglalkozó testületének jóváhagyásával.

Szövet- és monocita-gyűjtés.

Az STZ hatása a β-sejtekre.

Az STZ injekció inzulintermelő β-sejtekre gyakorolt hatásának vizsgálatához a hasnyálmirigy mintáit formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk, metszettük és sertés inzulin ellen antitesttel festettük. Normál nagyítással az inzulintermelő sejtek által elfoglalt szakaszban a hasnyálmirigy százalékos területét mind a négy sertéscsoportban számítógépes képanalízissel mértük az STZ injekció után 2, 8 és 20 héttel.

Vérmonociták izolálása és lipidelemzés.

A boncolás előtt 400 ml vért vettek ki heparinizált fecskendőkbe egy nyaki katéteren keresztül. A monocitákat ellenáramú centrifugálással izoláltuk a korábban leírtak szerint (14). Frissen izolált,> 95% -os tisztaságú monocitákat inkubáltunk (1,5–2 × 106 sejt/ml) 37 ° C-on 90 percig 2,0 ml Medium 199 (Life Technologies, Grand Island, NY) és normál sertés plazma keverékében. (1: 1, térfogat/térfogat), amely vagy [1-14 C] -acetátot, vagy [1-14 C] -oleaátot tartalmazott 2 vagy 3 μCi/ml koncentrációban (fajlagos aktivitás: 58,0 és 57,0 Ci/mol, ) (NEN Research Products, Boston, MA). Inkubálás után a sejteket centrifugálással ülepítettük, Hanks kiegyensúlyozott sóoldatával átöblítettük Ca 2+ és Mg 2+ -val (Whitacker Products, Walkerville, MD), majd kloroform/metanol keverékekkel extraháltuk (24). A lipidkivonatokat vékonyréteg-kromatográfiával frakcionáltuk szilikagél G bevonattal ellátott üveglemezeken, N-hexán/dietil-éter/jégecet 146: 50: 4 (térfogat: térfogat: térfogat) oldószerrel (20). . A lipidszalagokat üvegcsékbe kaparták, és folyadék szcintillációs számlálással vizsgálták közvetlenül a radioaktivitást (25).

[1–14 C] -acetáttal történő inkubálás esetén a lipid-kivonatok egy részét 100 μg hordozó-koleszterinnel elegyítettük, majd elszappanosítottuk, és meghatároztuk a teljes radioaktivitást digitoninban kicsapódó szterinekben (26). A frissen izolált monociták mintáit szintén közvetlenül extraháltuk a fentiek szerint (24), és a lipidkivonatokat nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (27) frakcionáltuk a sejtek endogén lipidtömegének meghatározása céljából.

Artériás szövet és lipid elemzés.

A különféle artériás ágyakból származó mintákat azonnal hűtött foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) öblítettük és hosszanti irányban kinyitottuk, és az intima táptalaj készítményeket óvatosan eltávolítottuk az alatta lévő táptalajról és az adventitiumról, miközben disszekciós mikroszkóp alatt néztük meg őket. A szöveteket 37 ° C-on 90 percig inkubáltuk 9,0 ml fentebb leírt, 1,5 μCi/ml [1–14 C] -oleaátot tartalmazó fajlagos sertés plazma táptalajban (specifikus aktivitás: 57,0 Ci/mol) (NEN). Kutatási termékek). Inkubálás után a szöveteket PBS-ben öblítettük és kloroform/metanol keverékekben homogenizálással extraháltuk, a korábban leírtak szerint (15). A lipidkivonat egy részét frakcionáltuk vékonyréteg-kromatográfiával a fent leírtak szerint, míg a második részt elszappanosítottuk, és meghatároztuk a teljes koleszterintartalmat a szterinek digitoninnal történő kicsapása után (26).

EREDMÉNYEK

A plazma glükóz- és lipidszintje.

Az STZ hatása a β-sejtekre.

Minden STZ-vel injektált sertésben az éhgyomri plazmakoncentráció csúcsa volt a harmadik injekciót követő 2 napon belül. Ezt követően a sertések többségénél a glükózszint enyhe csökkenése mutatkozott, de a diabéteszes szint> 11 mmol/l értéket tartott fenn (1. ábra). Sertés anti-inzulin antitestekkel festett hasnyálmirigy metszetek vizsgálata azt mutatta, hogy a kontroll (N) sertés (n = 10) standardizált mezőnként 221 ± 86 inzulint termelő β-sejtet tartalmazott, összehasonlítva a 2 héten belüli 23 ± 4 β-sejtekkel (n = 10). 10 sertés) STZ injekció után és mezőnként 43 ± 10 β-sejt az injekció beadását követő 20. héten (n = 10 sertés) (4A – C. Ábra). A kontroll állatok inzulintermelő sejtjei egyértelműen túlnyomórészt szigetekbe csoportosultak (4A. Ábra), míg az STZ injekció után 2 héttel egyetlen β-sejtek szétszóródtak, a fürtözés bizonyítéka nélkül (4B. Ábra). Az STZ injekció után 8–20 héttel nyilvánvaló volt a β-sejtek regenerációja, és bár a β-sejtek sűrűsége a kontrollokhoz képest nagymértékben csökkent (4A. Ábra), az inzulintermelő sejtek bizonyos csoportosulása szigeteken észlelhető volt adagolás az egyes cellákhoz (4C. ábra).

Lipid vizsgálatok.

A koleszterintartalmat és a koleszteril-észter képződést az aorta, iliac és carotis artériák standardizált szegmenseiben mértük 20 hetes sertésektől (n = 10/csoport). A csípő- és a carotis artériákban, valamint az aortaív elváltozásra érzékeny és nem érzékeny területein megfigyelt minták hasonlóak voltak a mellkasi aortánál megfigyeltekhez, és ezekről az érszakaszokról szóló adatokat nem mutatjuk be. Az aortában a cukorbetegség önmagában nem volt hatással a koleszterintartalomra normolipémiás körülmények között (5A. És B. Ábra). A hiperlipémia önmagában két-hatszorosára növelte az artériás koleszterintartalmat a kontroll erek fölött, még az N-HL sertéseknél a mellkasi és hasi aorta durván le nem kötött területein is (5A. És B. Ábra). A hasi elváltozásoknak a diabétesz hiányában is tízszer nagyobb volt a koleszterintartalma, mint az azonos N-HL sertés nem kivágott területein (5B. És C. Ábra). Bár a cukorbetegség egymásra helyezése nem növelte szignifikánsan a koleszterintartalmat a hasi aorta durván lézermentes területein (5B. Ábra), az elváltozott területek tartalma kétszeresebb volt, mint önmagában a hiperlipémiában (5C. Ábra).

A koleszteril-észter szintézise az [14C] -oleaátból, amelyet az atherogenezis korai biokémiai indexének tekintenek, önmagában a hiperlipémiával 3-20-szorosára nőtt az összes durván normál artériás ágyban (1. táblázat). A cukorbetegségnek a hiperlipémiára való ráhelyezése azonban megduplázta az oleaát beépülést a csak a hiperlipémiához képest mind a mellkasi, mind az izületi hasi szegmensekben (1. táblázat). Az elváltozások megállapítása után azonban nem tapasztaltunk különbséget a nem cukorbeteg és a diabéteszes hiperlipémiás állatok között (1. táblázat), ami arra utal, hogy a maximális beépülési arány elérte.

Szintézis monocitákkal.

Mivel korábban bebizonyítottuk, hogy a monocita eredetű makrofágok a fő sejttípus az intimában jelen a korai elváltozásokban (8,9,15), és hogy a keringő monociták fokozott lipid bioszintézist, acil-CoA-koleszterin-aciltranszferáz (ACAT) aktivitást és koleszterint tartalmaznak észterezés hiperlipémiás állatokban (15), megvizsgáltuk a [14C] -acetát és [14C] -oleaát lipogenezisét a sertés négy csoportjának monocitáiban 20. héten. A [14C] -acetátból származó lipogenezist a hiperlipémia önmagában 40% -kal fokozta az összes lipidosztályban (6A. Ábra). Hiperlipémia hiányában a cukorbetegség alig vagy egyáltalán nem befolyásolta a lipogenezist. Ha azonban a hiperlipémiára helyezzük, a cukorbetegség tovább fokozta a szintézist az összes hiperlipémiában, csak a hiperlipémiában (6A ábra). Ezenkívül a monocitákban az ACAT-aktivitás, amelyet a [14C] -oleaát koleszteril-észterekbe való beépülésével mértek (6B. Ábra), mind a cukorbetegségre (a kontrollhoz képest 40% -os növekedés), mind a önmagában a hiperlipémiára (a kontroll fölött háromszorosára) és a kombinációra reagál a kettő közül tovább fokozta ezt a választ a kontroll négyszeresére, a megállapítások összhangban vannak az érfal nem lerakódott területein tapasztaltakkal (1. táblázat).

Felgyorsult érelmeszesedés cukorbeteg sertéseknél.

A hiperlipémiás diabéteszes sertések ezen modelljét nagymértékben felgyorsult ateroszklerózis jellemzi diabéteszes állapotban. A várakozásoknak megfelelően csak hiperlipémiás állatoknál alakultak ki elváltozások. Ezeket a különbségeket kvalitatív módon könnyen szemléltethetjük Szudán IV-vel festett aortákon, durván nézve, mint a 7. ábrán: Az A és B panel mellkasi és hasi aorta egy reprezentatív 20 hetes D-HL állatból; A C és D panel egy N-HL állatból származóakat mutat ugyanabban a stádiumban, összehasonlítható terminális koleszterinszinttel (15,2 vs. 14,7 mmol/l). A mind a négy csoportból származó szudáni festett aorták számítógépes képelemzése (8. ábra) azt mutatja, hogy a lézióval járó aortafelület százalékos aránya átlagosan kétszerese a D-HL-ben az N-HL sertésekhez képest, már 12 hétig. Hosszan tartó (48 hetes) hiperlipémiás állapotok esetén a cukorbetegség hatása kevésbé hangsúlyos, mivel az elváltozások lefedettsége maximalizálódik.