Endometriózis szövetek molekuláris leképezése deszorpciós elektrospray ionizációs tömegspektrometriával

Clara L. Feider

1 Texasi Egyetem, Austin, Kémiai Tanszék, 100 E. 24. St, Austin, TX 78712 USA

Spencer Woody

2 Texasi Egyetem, Austin, Statisztikai és Adattudományi Tanszék, 2317 Speedway, Austin, TX 78712 USA

Suzanne Ledet

3 Ascension Seton Medical Center, Patológiai Osztály, 1201W. 38. St., Austin, TX 78705, USA

Jialing Zhang

1 Texasi Egyetem, Austin, Kémiai Tanszék, 100 E. 24. St, Austin, TX 78712 USA

Katherine Sebastian

4 Texasi Egyetem, Austin Dell Medical School, Belgyógyászati Klinika, 1601 Trinity St., Austin, TX 78712 USA

Michael T. Breen

5 Texasi Egyetem, Austin Dell Medical School, Női Egészségügyi Minisztérium, 1301W. 38. St., Austin, TX 7870 USA

Livia S. Eberlin

1 Texasi Egyetem, Austin, Kémiai Tanszék, 100 E. 24. St, Austin, TX 78712 USA

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

Eredmények

Az endometriózis elváltozásainak és az eutopikus endometrium molekuláris képalkotása

Negatív ion módú DESI-MS képalkotó adatok, amelyeket különböző betegektől nyert endometriózisból és eutopikus endometrium szövetekből nyertek. (a) Kiválasztott DESI-MS profilok a méhnyálkahártya mirigyből az ektopiás méhnyálkahártya szövetében, amelyet az endometriózis elváltozásaiból (felül) és az eutópiás méhnyálkahártya szövetekből gyűjtöttek a méh belsejéből (alulról). A bemutatott spektrumok átlagosan 10 beolvasás. (b) Az endometriózis és az endometrium szövetek kiválasztott DESI-MS ion képei. Az elváltozásokon belül az endometrium mirigyek és a stroma régiói fekete színnel vannak felvázolva a H&E-vel festett szöveti szakaszok optikai képein. (c) Az endometriózis szövet nagyított nézete az endometrium mirigyek és sztrómák körvonalait mutatja, amelyek térben korrelálnak a DESI-MS képalkotással detektált különféle molekuláris ionok eloszlásával, amint ezt a m/z 303. 233 és a m/z 723.478 mutatja.

A petefészekből, a végbélből, a hólyagból és az endometriómából gyűjtött eutopikus endometrium és négy endometriózis szövet betegen belüli elemzése (98. beteg). (a) Három mintából nyert kiválasztott DESI tömegspektrum, beleértve a jobb petefészek és a petefészek ciszta endometriózisát (endometrioma), valamint az eutopikus endometriumot. (b) Az összes endometriózis szövetből (sárga) kivont pixelenkénti adatok PCA pontszám diagramjai az eutópiás endometrium szövetekből (fekete). (c) Az endometriózis szöveteiből kivont pixelenkénti adatok kivágási régiónként (petefészek narancssárgában; rektális rózsaszínben, hólyag zöldben, endometrioma kékben) összehasonlítva az eutopikus endometrium szövetekkel (fekete). Az ellipsziseket egy-szigma ellipszissel számolják (68% -os valószínűség), becsült kétváltozós Gauss-eloszlással minden csoport esetében.

A DESI-MS képalkotó kísérletek további egyedi tömegspektrumot tártak fel számos endometriózis lézióminta specifikus régióiban. Noha ez a tömegspektrum nem volt összefüggésben a hisztopatológiai értékelés által meghatározott különféle szövettani jellemzőkkel, úgy tűnt, hogy a szövetben a vér lerakódásainak régióiban lokalizálódik. A tömegspektrumok egyedülálló molekuláris mintázatot mutattak, bármely más, ebben a vizsgálatban megfigyeltnél, szokatlanul magas relatív bőségű ionokkal, amelyeket tipikusan nem detektálnak emlős szövetekből (S9. Kiegészítő ábra). A m/z 950–1050 nagyobb tömegű régióban detektált ionokat n-acil-foszfatidil-etanol-aminokként (NAPE) azonosították, amelyek ritka komplex lipidek, amelyek akkor keletkeznek, amikor a PE-foszfolipid fejcsoport aminocsoportja egy amidkötést képez egy zsírsavval. A NAPE lipideket ezen az egyedüli tömegspektrumon belül figyeltük meg a PA, PG és PI lipidek nagy mennyisége között, amelyeket a szövetminta többi részében is kimutattunk, bár alacsonyabb relatív bőségnél.

Az endometriózis és az eutopikus endometrium statisztikai osztályozása lasszóval

A DESI-MS képalkotó adatokon végzett statisztikai elemzések eredményei. (a) Összesen 98 szövetet, köztük 76 szövetet endometriózis elváltozással és 22 eutopiás endometrium szövetet gyűjtöttünk prospektív módon 51 különböző betegből. A művészetet Viktoriia Tymoshenoko/Shutterstock.com nyújtotta. (b) A képzési, tesztelési és validálási mintasorozatok Lasso pixel pontosságú eredményei. (c) Azok a tulajdonságok, amelyeket a lasso választott megkülönböztető módon az endometriózis és az endometrium szövetek esetében, ahol a negatív súlyok inkább az endometriózist, a pozitív súlyok pedig inkább az endometrium szövetét jelzik. (d) Ugyanazon mintacsomag bootstrap elemzésével kiválasztott jellemzők, amelyek az endometriózisra vagy az endometrium szövetre utalnak, ahol a negatív z-pontszámok az endometriosisban a növekedés növekedését jelzik, a pozitív z-pontszámok pedig az endometrium szövetének nagyobb mértékű növekedését.

A lasso logisztikai regressziós módszer előnye az olyan prediktív jellemzők kiválasztása, amelyek a legnagyobb mértékben hozzájárulnak az osztályozási modellhez. A kiválasztott endometriózis-modell 16 szövetspecifikus molekulából áll, amelyek lehetővé tették az optimális differenciálódást e szövettípusok között, változó matematikai súlyokkal, ami azt jelzi, hogy hozzájárulnak a modellhez (3c. Ábra). Megjegyezzük, hogy összesen 18 tulajdonságot választottunk ki, de ezek közül 2-t háttér-csúcsnak határoztak meg, és így biológiailag nem relevánsak. A 16 szövetspecifikus jellemző közül 5-öt választottak az endometriózisra utaló jelként, míg 11-et inkább az eutópiás endometrium szövetre. A kiválasztott jellemzők listáját, a modellben szereplő statisztikai súlyukat és előzetes azonosításukat az S6 kiegészítő táblázat tartalmazza. .

Érdekes molekuláris jellemzők kiválasztása bootstrap empirikus Bayes elemzéssel

Míg a lasszó logisztikai regresszió a jellemzők kiválasztását végzi a prediktív modell felépítése során, nem feltétlenül választja ki az adatkészlet összes olyan tulajdonságát, amely jelentősen eltér a két csoport között, ha ezek a tulajdonságok nem javítják az osztályozási teljesítményt. A végső kiválasztott lasszó modell mintán kívüli prediktív pontosságából ítélve úgy tűnik, hogy nagy mennyiségű jel van jelen a két csoport megkülönböztetésére. Mivel a lasso a parsimóniát favorizálja, a végső kiválasztott jellemzőkészlet valószínűleg nem teljesen fedi le a csoportok közötti molekuláris különbségeket.

Az endometriózis altípusokhoz kapcsolódó molekuláris különbségek

Statisztikai elemzéseinket abból a feltételezésből hajtottuk végre, hogy minden endometriózis elváltozás hasonló molekuláris mintázattal bír. Mindazonáltal az endometriózis altípusok, amelyeket excíziós régió jellemez, hozzájárulhatnak a heterogenitáshoz a kollektív adatokon belül, amint azt a betegen belüli elemzéseink sugallják. A lézió altípus miatti heterogenitás potenciáljának kezelése érdekében PCA-t végeztünk az összes méhen kívüli méhnyálkahártyán. Az S12 kiegészítő ábra a PCA eredményeket mutatja, a különböző színek a különböző szöveti alkategóriákat képviselik, a pácienseken belüli elhelyezkedésük alapján. Az endometriózis alkategóriája alapján nem történt szétválasztás, nagy mennyiségű adat fedi egymást. Ezenkívül, amikor a PCA-pontszámdiagramot egyazon páciensmintából származó pixelek izolálása céljából végezzük el (S13. Kiegészítő ábra), a megfigyelt csoportosulások ugyanazon szövetmintából származó adatokhoz és nem altípusokhoz köthetők, ez a megfigyelés nem volt meglepő a betegek.

Vita

Az endometriózis elváltozásaiból nyert adatok PCA elemzését végeztük annak értékelésére, hogy a kapott molekuláris információk korrelálnak-e a betegség altípusaival (S12. Kiegészítő ábra). Az endometriózis elváltozásai három kategóriába sorolhatók: petefészek, hashártya és mélyen beszűrődő endometriózis, attól függően, hogy az elváltozás hol található a testben 52. A kutatók azt javasolták, hogy ezeket a kategóriákat különálló entitásokként kell kezelni, potenciálisan eltérő okokkal, tünetekkel és kezelésekkel 28. Vizsgálatunk során, miközben némi klaszterezés figyelhető meg ugyanazon betegtől összegyűjtött négy endometriózis elváltozásból nyert adatokon belül (2c. Ábra), az endometriózis elváltozásaiból származó összes DESI-MS képalkotó adat PCA elemzése nem mutatott szignifikáns elválasztást klaszterezés a kivágás helye alapján. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a DESI-MS képalkotás által ebben a vizsgálatban megszerzett molekuláris adatok nem teszik lehetővé a szövetek elhelyezkedése alapján történő altípust a különböző betegek között. Ezt a megfigyelést részben alátámasztja a lasszó modellünk által elért magas prediktív pontosság is, amelyben az adatokat együttesen egyetlen endometriózis osztályba egyesítettük.

Mód

Szövetmintagyűjtés

Humán endometriózis elváltozásokat (n = 234) és eutópiás méhszövetet (n = 35) prospektív módon gyűjtöttünk 89 konzervatív és radikális endometriózis műtéten átesett betegből, Dr. Michael T. Breen a Dell Orvosi Iskolában. A szöveteket mind a Texasi Egyetem IRB, mind pedig a Seton Hospitals IRB család jóváhagyott IRB-protokolljai alapján gyűjtötték. Tájékozott beleegyezést kaptak minden, ebben a vizsgálatban részt vevő beteg. Valamennyi endometriózis elváltozásmintát unipoláris elektromos ollóval kivágtuk egy laparoszkópos eljárás során, míg az eutopiás endometrium mintákat csak az eljárás befejezése után, normál szikével teljes hysterectomián átesett páciensektől gyűjtöttük. A mintákat 4 ° C-on, légmentesen lezárt tartályokban, nedves géz tetején tároltuk, amíg folyékony nitrogénben gyorsan le nem fagyaszthatók, általában a kivágástól számított 6 órán belül. A mintákat ezután fagyasztóban tárolták, amíg szétvágták őket. A szövetmintákat 16 µm vastag metszeteken osztottuk szét CryoStar NX50 kriosztát (Thermo Scientific, Waltham, MA) alkalmazásával, és üvegmikroszkóp tárgylemezekre szerelve felolvasztottuk. A metszés után az üveglemezeket -80 ° C-os fagyasztóban tároltuk. Az MS képalkotása előtt az üveg tárgylemezeket exszikkátorban szárítottuk

Vegyszerek

A DESI-MS permetező oldószerhez használt acetonitrilt és dimetil-formamidot a Fisher Scientific (Waltham, MA) és Sigma Aldrich (St. Louis, MO) cégektől szereztük be. A szövettani festéshez használt összes oldószert, beleértve a metanolt, a hematoxilint, a kékítő reagenst, az eozin y-t, az etanolt és a xilolokat, a Fisher Scientific-től (Waltham, MA) szereztük be.

DESI-MS képalkotás

Minden elvégzett kísérletet a jóváhagyott IRB protokollnak megfelelően hajtottunk végre. A szöveti képalkotáshoz DESI 2D rendszert (Prosolia Inc., Indianapolis, IN) alkalmaztunk 100 µm pixelmérettel. A DESI-MS képalkotást negatív ion üzemmódban m/z 100–1500 között hajtottuk végre, hibrid LTQ-Orbitrap Elite tömegspektrométer (Thermo Scientific, San Jose, CA) alkalmazásával 60 000 felbontó erővel (m/z 200-nál) dimetil-formamid alkalmazásával.: acetonitril 1: 3 (v/v) 1,4 µL/perc áramlási sebességgel, hacsak másképp nem jelezzük. A szkennelésenkénti hozzávetőleges idő 1,24 másodperc volt 94,3 μm/s szakaszsebesség mellett. A kapott tömegpontosság 55 volt .

Szövettani és fénymikroszkópia

Ugyanezeket a DESI-MS képalkotással elemzett szövetmetszeteket standard hemotoxilyn és eozin (H&E) festési protokoll alkalmazásával festettük. A patológiai értékelést Dr. Suzanne Ledet végezte. A határozott és valószínű endometrium stroma, az endometrium mirigyek és a hemosiderin régiói az endometriosis elváltozásokon belül helyezkedtek el. Az eutópiás méhnyálkahártya-patológiát megerősítették, és tiszta méhnyálkahártya-szöveteket tartalmazó régiókat figyeltek meg. A H&E-vel festett tárgylemezek fénymikroszkópos képeit az EVOS FL Auto Cell Imaging System (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) segítségével készítettük.

A molekuláris ionok azonosítása

A metabolit- és lipidfajtákat nagy tömegpontosságú mérések és ütközés okozta disszociáció (CID) és nagy energiájú ütközés által indukált disszociáció (HCD) tandem MS elemzésekkel azonosítottuk, amelyeket Orbitrap segítségével hajtottunk végre az LTQ-Orbitrap Elite tömegspektrométer tömegelemzőjeként. A töredezettséget a DESI-forrás raszterezésével végeztük el soros szövetszelvényeken, nagyobb áramlási sebességgel (3 μl/perc). Az alkalmazott izolációs ablak 1 m/z volt, az energiája 10–30 normalizált ütközési energia volt CID esetén és 40–90 normális ütközési energia esetén. A fragmentációs mintákat összehasonlítottuk az irodalmi jelentésekkel, és összehasonlítottuk a Lipidmaps (www.lipidmaps.org) és a Human Metabolome Databases (www.hmbd.ca) adataival. A lipideket zsírsavösszetétel jellemezte, de a láncok és a kettős kötés helyzete nem ismert.

Statisztikai analízis

A fő alkotóelem-elemzést (PCA) alkalmazták az adatok altípusból adódó mennyiségi különbségek értékelésére. Az egyes tömegspektrumok intenzitásait a medián-log nem nulla intenzitással normalizáltuk, hogy figyelembe vegyük a magasabb intenzitású csúcsokat, amelyek nagyobb szórást mutatnak, és így rosszul reprezentálják a teljes spektrum varianciáját .