Ex vivo módszer az egér reproduktív traktus spontán mozgékonyságának és egy MATLAB-alapú méh mozgáskövető algoritmusának az adatok elemzéséhez

Összegzés

A méhösszehúzódások fontosak a nők jólétének szempontjából. A kórosan megnövekedett kontraktilitás azonban dysmenorrhea-t eredményezhet, különösen fiatalabb nőknél. Itt leírunk egy egyszerű ex vivo készítményt, amely lehetővé teszi a diszmenorrhoea kezelésére alkalmazható simaizomrelaxánsok hatékonyságának gyors értékelését.

Absztrakt

Bevezetés

A méh, mint fő női szerv, döntő fontosságú a szaporodás szempontjából, és nélkülözhetetlen a magzat táplálásához 1. A méh három rétegből áll: a perimetriumból, a myometriumból és az endometriumból. A myometrium a méh fő összehúzódó rétege, és kulcsszerepet játszik a magzat szállításában. Az endometrium a méh üregét borító legbelső réteg, amely elengedhetetlen az embrió beültetéséhez. A reproduktív korú, nem vemhes nőknél az endometrium rétege havonta hullik a menstruációs ciklus elején. A myometrium elősegíti ezt a leválási folyamatot azáltal, hogy fenntartja a spontán myometrium-összehúzódásokat, amelyek szükségesek a nekrotikus endometrium szövetének a méhtől való megtisztításához. .

Sajnos a megnövekedett myometrium kontraktilitás negatív mellékhatásokat eredményezhet, mint például dysmenorrhoea vagy fájdalmas menstruációs görcsök. Ez különösen a fiatal nőknél és a házastárs nőknél tapasztalható 2. A dysmenorrhoea azonban minden nő esetében más és a myometrium kontrakcióinak erejétől függ; erősebb összehúzódások gyakran társulnak a súlyos görcsök érzésével 3. A myometrium kontraktilitása a méh ultrahangjának segítségével vizualizálható, és gyakran endometrium hullámként ismerik fel. A prosztaglandinok fokozott felszabadulása a 4. menstruáció alatt egy méhben, amely méhnyálkahártya-elhúzódást szenved, feltételezhetően hozzájárul a myometrium hiperkontraktilitásának fokozásához, ami a méh izomának iszkémiáját és hipoxiáját, és ezáltal fokozott fájdalmat eredményez 3 .

A súlyos dysmenorrhoea gátolhatja egyes nők mindennapi tevékenységét, és a nők 3–33% -ának nagyon súlyos fájdalmai vannak, ami egy nőnek minden menstruációs ciklusban 1-3 napig ágyhoz vezethet 5. A reproduktív korú nőknél a dysmenorrhoea a nőgyógyászati ​​megbetegedések vezető oka, kortól, nemzetiségtől és gazdasági státusztól függetlenül 5. A dysmenorrhoea becsült prevalenciája mind magas, mind változó, 45 és 93% között mozog a reproduktív korú nők esetében 5. A diszmenorrea okozta fájdalom hatással van a nők mindennapi életére, és gyenge tanulmányi teljesítményt eredményezhet serdülőknél, gyengébb alvásminőséget, korlátozhatja a napi tevékenységeket és megváltozhat a hangulat 5 .

Sok olyan nő, aki súlyos dysmenorrhea-t tapasztal, vény nélkül kapható gyógyszerekhez folyamodik fájdalmainak enyhítésére. Az ilyen vény nélkül kapható gyógyszerek ciklooxigenáz (COX) inhibitorokat tartalmaznak, amelyek megakadályozzák a prosztaglandinok képződését 6. A COX-gátlók azonban káros kardiovaszkuláris eseményekhez kapcsolódnak, és a dysmenorrhoában szenvedő nők mintegy 18% -a nem reagál ezekre az inhibitorokra 7. Ezért új gyógyszerekre van szükség a menstruációs görcsök csökkentésére. Mivel a méh túlzott kontraktilitása hozzájárul a dysmenorrhoea patogeneziséhez, az egyik lehetséges stratégia lehet a méh relaxánsainak használata.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az állatokkal végzett összes eljárást az Indiana Egyetem Orvostudományi Egyetemének (Indianapolis, IN) intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá. 2-5 hónapos F2-129S-C57BL/6 ivarérett nőstény egeret használtunk a vizsgálatban.

VIGYÁZAT: Állatokkal és biológiailag veszélyes anyagokkal végzett munka során biztosítsa a biztonságot laboratóriumi kabát, maszk és kesztyű viselésével.

1. Oldatkészítés

  1. Készítsük elő a Krebs puffert, amely tartalmaz: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 0,56 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3 és 5 mM glükóz (pH 7,4). Folyamatosan oxigénezzük a Krebs puffert 5% CO2 és 95% O2 tartalmú sűrített gázok keverékével, miközben a puffer hőmérsékletét 37 ° C-on tartjuk keringő vízfürdővel.
  2. Készítse elő a Dulbecco foszfáttal pufferolt sóoldatát (DPBS), amely tartalmaz: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2P04, 136,89 mM NaCl és 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4.

2. Állatok előkészítése

  1. Érzéstelenítsük az egereket izoflurán (3%) belégzésével, füstgáz elszívással. Biztosítsa a megfelelő érzéstelenítést az elvonási reflexek értékelésével. Csípje meg a hátsó lábujjat, hogy megbizonyosodjon arról, hogy nincs mozgás, ami a reflex válaszok elvesztésére utal. A mély érzéstelenítés elérése után eutanizálja az állatot lefejezéssel.
    JEGYZET: Az izoflurán simaizom dilatációt okozhat. Ezért a reproduktív traktus készítményt alaposan meg kell mosni és inkubálni kell a Krebs pufferben legalább 15-30 percig az ex vivo kísérletek megkezdése előtt. Az izoflurán irritációt és kényelmetlenséget okozhat, ha bőrrel érintkezik, ezért óvatosan járjon el.
  2. Helyezze a testet egy papírtörlővel bélelt nagy súlyú hajóra.
    JEGYZET: A terhes női laboratóriumi személyzetet nem szabad bevonni az izofluránnal végzett kísérletekbe, mert ez csökkentheti a magzat súlyát, csökkentheti a magzat csontozatának csontosodását és növelheti a spontán abortusz kockázatát 8,9. A CO2 belégzése helyettesíthető az egerek eutanizálásához.

3. Az ösztrikus ciklus szakaszának meghatározása

  1. Kis csipesszel emelje fel a csiklót, hogy hozzáférhessen a hüvelyi ótiumhoz, és lassan helyezzen egy 10 µL DPBS-t tartalmazó mikropipetta hegyét a hüvelybe.
    1. Győződjön meg arról, hogy a mikropipetta hegyét 10 - 30 ° -os szögben helyezzük be az ostiumba, hogy elkerüljük a hüvelyfal szúrását. A behelyezés után a folyadéknak továbbra is láthatónak kell lennie a hegyében. Ha a folyadék nem látható, a hegyet túlságosan a hüvelybe illesztették, és a hüvely paracervikális területe perforált lehetett.
    2. Enyhén húzza le a hüvelyi ostium izmokat a mikropipetta hegyével, hogy a levegő távozhasson a hüvelyből.
  2. Lassan öblítse le a hüvelyüreget 2-3-szor 10–1 µL DPBS-sel történő fel- és lefelé történő pipettázással, és helyezze a lehúzott sejtszuszpenziót egy üveglemezre.
  3. Használjon inverz fázisú kontrasztmikroszkópot az ösztrikus ciklus szakaszának citológiai elemzéssel történő meghatározásához. Az eljárást a 10, 11 máshol leírtak szerint végezzük. A citológiai analízis elvégzése előtt győződjön meg arról, hogy a sejtszuszpenzió nem szárad ki. A szuszpenzió szükség esetén friss DPBS-sel hígítható.

4. Egér reproduktív traktus disszekciója

5. Szövet képalkotás

6. Adatok elemzése

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

1.ábra reprezentatív képeket mutat az egész reproduktív traktus izolációs eljárás során, amelyet ebben a protokollban leírtak. Annak elkerülése érdekében, hogy a puffert szőrrel szennyezzük, ami csökkentené a videó minőségét, az egér testét 70% -os etanollal megnedvesítettük. A protokoll boncolási szakaszának fő mércéje a húgyhólyag megtalálása. A méh és a hüvely a húgyhólyagnál alacsonyabban helyezkedik el.

A protokoll teszteléséhez a teljes reproduktív traktust epinefinnel kezeltük. Az epinefrin köztudottan a méh simaizmainak relaxációját okozza. Ez a hormon endogén módon termelődik a mellékvesében, és stresszhormonként szolgál az emlősökben. Kísérleteink során 1 µM adrenalint használtunk. Ez egy telített koncentráció, amelyről ismert, hogy maximális választ eredményez 12. Négy kísérlet sorozatát hajtották végre. Valamennyi vizsgálatban az 1 µM epinefrin reverzibilisen gátolta a méh spontán motilitását (2. ábra).

A reproduktív traktus spontán mozgásának számszerűsítésére egy olyan algoritmust terveztünk meg, amely lehetővé teszi számunkra, hogy értékeljük az egér reproduktív traktusának két kiválasztott pontja közötti euklideszi távolság átlagos változásának sebességét. A pont pozíciókat a MATLAB szoftver mozgáskövető moduljával követik nyomon. A MATLAB megfelelő szkriptjét, amelyet az euklideszi távolságok kiszámításához használtunk, a Kiegészítő anyag online. A pontok helyzete kritikus a sikeres mozgáskövetési eljáráshoz. Gondosan mérlegelni kell a videók minőségét, mert a Petri-csésze faláról érkező fényvisszaverődések elterelhetik a mozgáskövetőt, és leállíthatják a kürt mozgásának nyomon követését, miközben a pontot újra hozzárendelik az egyik fényvisszaverődéshez. Úgy döntöttünk, hogy az egyik pontot egy kürt közepén helyezzük el, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy az eléggé távol van a Petri-csésze falának visszaverődésétől. A második pontot általában a hüvelyen választották ki, mivel az nem mutatott spontán mozgékonyságot. 3. ábra - adatot ad az adatok elemzéséről, és - 1. kiegészítő ábra a mozgáskövetés során szerzett reprezentatív képeket mutatja.

módszer

1.ábra: A teljes reproduktív traktus izolációjának lépései. (A) A bőrön bemetszést végeztek, és a hasüreg feletti részt a hashártya fölé tették (1). (B) A serosus membránt lassan kinyitották, hogy a gyomor-bél traktus láthatóvá váljon (2). (C) A gyomor-bél traktust megmozgatták a méh szarvainak feltárására (3). A húgyhólyag (4) vizualizálható a szarvak együttesének közelében. (D) A méh szarvai felszabadultak, és a szemérem szimfízisének oldalsó oldalán levágták a hüvelyt (6). (E) Az izolált reproduktív traktus eltávolítása és elhelyezése DPBS-oldatba. A felesleges bundát vagy kötőszövetet eltávolítottuk. (F) A hüvelyben (jobbra) mély behúzás látható a végbél eltávolítása után (bal, 7). (G) A környező kötőszövet eltávolításra kerül. Digitális fényképezőgépet és Application Suite szoftvert (3.7.0 verzió) használtunk valós idejű képek készítésére a boncolás során (kamera beállítása: színárnyalat 20/telítettség 80). Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


2. ábra: Egy reprezentatív kísérletet mutatunk be a teljes elszigetelt reproduktív traktussal. A képeket korábban 15 másodpercenként készítették el (A) során (B), és utána (C) 1 µM epinefrin alkalmazása. A reproduktív traktus preparátuma nagy mozgékonyságot mutatott az A és C panelekben epinefrin hiányában, de a B panelben nyugvó, 1 µM epinefrin jelenlétében. A szerkesztetlen videofelvételeket a következőképpen adják meg Kiegészítő videók 1-3. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

Vita

Itt leírtunk egy módszert az egész rágcsáló reproduktív traktus spontán összehúzódásának értékelésére, amely magában foglalja a petefészkeket, petevezetékeket, méhszarvakat és a hüvelyt. Hasonló módszert alkalmaztunk a fenilefrin relaxáló hatásának kimutatására a spontán méhmozgásra 13, azonban a múltban nem volt képes az adatok kvantitatív elemzésére. Ebben a munkában kifejlesztettünk egy algoritmust a kvantitatív motilitási adatok elemzéséhez a MATLAB mozgáskövető modul segítségével. Ez egy hasznos technika új gyógyszerek tesztelésére, amelyek szabályozzák a méh összehúzódását, függetlenül attól, hogy a gyógyszerek ellazítják-e vagy összehúzják-e a méh simaizmait. A modell fő előnye, hogy a reproduktív traktus ép, megőrzi az összes belső intrauterin sejt interakciót. Nevezetesen, ez a protokoll nem igényel különleges felszerelést. A méh izolálása egyszerű nagyítóval történhet, és semmiféle kifinomult videofelvevő berendezésre nincs szükség. Ha nagy felbontású digitális fényképezőgép nem áll rendelkezésre képalkotáshoz, akkor alternatívaként egy személyes mobiltelefonos fényképezőgép is használható.

A reproduktív traktus motilitásának értékelésére szolgáló protokoll legkritikusabb lépése az életképes méhszövet megszerzése. A myometrium a méh szarván belül a reproduktív traktus mozgó eleme. Ezért az izolálás során fontos elkerülni a szarvak túlfeszítését vagy összenyomását. Fontos azt is biztosítani, hogy a méh szövete jól oxigénezett legyen a kísérlet során a méh mozgékonyságának fenntartása érdekében. A méhszarvak károsodásának megelőzésére a legjobb módszer az, ha csak a szomszédos kötőszövetekkel érintkezik, mialatt a méhet tisztítja vagy a reproduktív traktust mozgatja. Mivel a hüvely a kísérlet során nem húzódik össze spontán módon, elfogadható a csipesszel összenyomni, amikor a reproduktív traktust egyik csészéből a másikra mozgatja. A teljes reproduktív traktus kísérletei elvégezhetők izometrikus feszültség felvételekkel együtt, amelyek felmérik az előterhelés és/vagy az oxitocin által kiváltott méh kontraktilitását. A huzal-myograph azonban drága berendezés, amely nem mindig elérhető a közös laboratóriumi környezetben.

Megállapítottuk, hogy a nőstény egerek optimális életkora 2-5 hónap. Jeleztük, hogy az izofluránnal végzett érzéstelenítés csökkent mozgékonyságot eredményezhet, és további mosásokra lehet szükség ezen izoflurán által kiváltott szövődmény megelőzésére. Alternatív megoldásként széndioxidot használhatunk az egerek eutanizálásához. Ha a boncolás során nehézségek merülnek fel, segíthet a tereptárgyakra való összpontosítás, például a húgyhólyag. A kapott motilitási adatok számszerűsítéséhez a MATLAB szoftvert használtuk. A MATLAB mozgáskövetésének legfőbb problémája az volt, hogy a nyomkövető nem tudta megfelelően megtalálni a szarvakat, amikor a Petri-csésze falához közeledtek. Az Adobe Premier Element-et használták a videofelvételek klipelésére és a videofájlok méretének csökkentésére. Bár ez egy kiemelkedő szoftvercsomag, nem biztos, hogy tipikus laboratóriumi körülmények között érhető el. Alternatív lehetőség lehet az ImageJ szoftver szabad mozgáskövető moduljának használata, vagy akár az azonos időközönként készített képek egyszerű kézi értékelése és a méhszarvak helyzetének összehasonlítása a szegmentációs rácson. 2. ábra egy példát mutat be a spontán méhmozgás egyszerű értékelésére, és magában foglalja a reproduktív traktus mozgásának összehasonlítását 15 s intervallumon belül.

Eddig egyetlen egyszerű módszerről sem számoltak be a méh mozgékonyságának Petri-csészében történő meghatározására. Ultrahang és méhen belüli nyomásérzékelők használhatók az emberi méh kontraktilitásának ellenőrzésére 14. Nehéz azonban megvizsgálni az ép emberi méh mögöttes mechanizmusait. Ezért fontos az állatmodellek használata a méh spontán kontraktilitásának vizsgálatára. A női reproduktív traktus spontán myometrium-összehúzódásokat mutat, amelyek kritikusak a női jólét szempontjából, beleértve a termékenységét és a vajúdását15. Ezek az összehúzódások endometrium hullámként vizualizálhatók az ultrahangvizsgálat során. A menstruáció alatt azonban a méh túlzott kontraktilitása kényelmetlenséget okozhat, és dysmenorrhoéhez vagy menstruációs görcsökhöz vezethet. A dysmenorrhoea egyes tüneteinek enyhítéséhez új gyógyszerekre van szükség, amelyek a méh simaizmainak ellazítására irányulnak. Egyszerű módszerünk lehetővé teszi a különböző vegyületek méhösszehúzódásra gyakorolt ​​hatásának értékelését.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.