GYORS AUTÓK: Lézerspektroszkópiai technika kidolgozása a baktériumspórák gyors azonosításához

Közreműködött: M. O. Scully

Absztrakt

A levegőben lévő szennyeződéseket, például a baktériumok spóráit általában időigényes mikroszkópos, kémiai és biológiai vizsgálatokkal elemzik. Az ilyen szennyezők valós idejű lézerspektroszkópos detektorainak jelenlegi kutatása például rezonancia fluoreszcencián alapul. Ez a megközelítés olyan közelmúltbeli kísérletekből származik, amelyek során az atomokat és molekulákat egy (vagy több) koherens lézer készíti elő, és egy másik lézersorozat vizsgálja. Azonban a maximálisan koherens oszcilláció előállítása és felhasználása hatalmas szabadságfokú makromolekulákban kihívást jelent. Különösen a rövid levonási idők és a gyors belső átváltási arány jelentenek fő akadályt. Az adiabatikus gyors átjárási technikák és a fázis-koherens femtoszekundumos impulzusok fésűinek előállításának képessége azonban eszközöket nyújt a maximális kvantumkoherencia előállítására és felhasználására nagy molekulákban és biopolimerekben. Ezt a technikát FAST CARS-nak (femtoszekundumos adaptív spektroszkópiai technikák a koherens anti-Stokes Raman spektroszkópiának) hívjuk, és a jelen cikk olyan módszereket javasol és elemez, amelyekkel az előre kiválasztott molekulák valós időben történő gyors azonosítására lehetne.

Sürgősen szükség van a kémiai és biológiai ismeretlen anyagok, például a bioaerosolok gyors vizsgálatára. Az elmúlt évtizedben jelentős előrelépés történt e cél felé. Az olyan módszereket, mint a fluoreszcencia spektroszkópia (1, 2) és az UV rezonáns Raman spektroszkópia (3–7), sikeresen alkalmazták a biopolimerek, baktériumok és bioaerosolok azonosítására.

Jelenleg olyan terepi eszközöket fejlesztenek (1), amelyek egy optikai előválasztási fázist foglalnak magukban, például az 1. ábrán bemutatott fluoreszcens sugárzás alapján. Ha a fluoreszcencia mérése nem adja meg a megfelelő aláírást, akkor ezt a részecskét figyelmen kívül hagyják. Legtöbbször a részecske érdektelen porrészecske lesz; ha azonban aláírás-egyezést rögzítenek, akkor a részecskét kiválasztják speciális biológiai vizsgálatra (lásd 1b. ábra). A viszonylag egyszerű fluoreszcencia szakasz nagyon gyorsan képes kiválogatni az érdektelen részecskék egy részét, míg az időigényesebb bioteszteket csak a „gyanúsítottak” esetében alkalmazzák.

(a) Az UV gerjesztő sugárzás elősegíti a molekulákat alapállapotból gerjesztett állapotú sokaságba. Ez az gerjesztett állapotú elosztó nem sugárzó folyamatok révén bomlik az alapállapotba egy alacsonyabb elosztóba, amely aztán látható vagy UV fluoreszcenciával bomlik le. (b) Olyan forgatókönyv, amelyben az UV lézer kölcsönhatásba lép az érdekes porszemcsékkel és bioszférákkal. Ha például egy baktérium spórát besugároznak, akkor fluoreszcencia jelenik meg, jelezve, hogy ezt a rendszert tovább kell vizsgálni. Elvileg az érdektelen részecskék egy irányba terelődnek; de amikor a fluoreszcencia bekövetkezik, a részecskéket egy másik irányba tereljük, majd ezeket további biológiai teszteknek vetjük alá. (c) Az árnyékolt terület számos biológiai minta, a Bacillus subtilis, a Bacillus thuringiensis, az Escherichia coli és a Staphylococcus aureus fluoreszcencia spektrumának jeltartományát mutatja. Egy ilyen mérés alapján nem lehet különbséget tenni a különböző minták között (további részletekért lásd a 2. hivatkozást).

A rezonancia fluoreszcencia technikával kapcsolatban jó hír, hogy gyors és egyszerű. A rossz hír az, hogy bár meg tudja különböztetni a por és a baktériumspórákat, nem tud különbséget tenni a spórák és sok más szerves bioaerosol között (lásd 1c. Ábra).

A fent említett tanulmányok biztató sikere ellenére azonban továbbra is érdeklődés mutatkozik a kémiai és biológiai anyagok gyors azonosításának egyéb megközelítései és eszközei iránt. Idézni egy nemrégiben készült tanulmányból (8):

„A jelenlegi [fluoreszcencia-alapú] prototípusok nagy előrelépést jelentenek a korábbi stand-off rendszerekhez képest, de emissziós spektrumuk hasonlósága miatt még nem tudják következetesen azonosítani a specifikus organizmusokat. A fejlett jelfeldolgozási technikák javíthatják az azonosítást. ”

A rezonáns Raman-spektrumok ígéretet tesznek arra, hogy spóraspecifikusak, amint azt a 2b. Ábra mutatja. Ez jó hír, rossz hír az, hogy a Raman jel gyenge, és néhány percbe telik a 2b. Ábra adatainak összegyűjtése. Mivel az 1b. Ábrához hasonlóan nagy a beépítés, az optikai lekérdezés részecskénként lényegében pillanatnyi.

(a) Rezonáns Raman-szórás, amelyben a ν1 sugárzás az atomot | c> -tól | a> -ig gerjeszti, és a Stokes-sugárzás kibocsájtja a molekulát | a> -ról | b> -ra. (b) Az UV rezonancia részletei A B. megaterium (1. nyom) Bacillus c. spóráinak Raman-spektrumai. (2. nyom) és kalcium-dipikolinát (3. nyom), mind 242 nm-en gerjesztve; hivatkozásból adaptálva 4. ábra (lásd még a 6. ábrát). (c) Fizikálisabb kép a Raman-szórásról, amelyben egyetlen nehézmagból és könnyű atomból álló diatomi molekula szórja be a beeső lézersugárzást ν1 frekvencián. A diatomikus molekulához kapcsolódó rezgési szabadságfokokat itt úgy ábrázoljuk, hogy az R0 amplitúdó oszcillál az ω frekvencián. Ennek a rezgő molekulának a szórt sugárzása ν2 = ν1 - ω frekvencián van a Stokes-sugárzásnál.

A kérdés ekkor: Növelhetjük-e a rezonáns Raman-jel erősségét, és ezáltal csökkenthetjük a részecskénkénti kihallgatási időt? Ha igen, akkor a technika különböző észlelési esetekben is hasznos lehet.

Az eljárási bekezdés kérdésére adott válasz igen. Fokozhatjuk a Raman jelet azáltal, hogy növeljük a 2c. Ábrán látható koherens R0 molekuláris oszcillációs amplitúdót. Lényegében ez azt jelenti, hogy maximalizáljuk a 2a. Ábra | b> és | c> rezgési állapotai közötti kvantumkoherenciát.

Álláspontunk a lézerfizika és a kvantumoptika területén végzett kutatásból származik, amelyek a kvantum koherencia kihasználására és maximalizálására koncentráltak. E tanulmányok lényege az a megfigyelés, hogy az atomok vagy molekulák együttese az állapotok koherens szuperpozíciójában valós értelemben egy új anyagállapotot jelent, amelyet alkalmasan fázisóniumnak (9–11) neveznek.

Különösen megjegyezzük, hogy a termodinamikai egyensúlyban lévő anyagnak nincs fáziskoherenciája az együttest alkotó molekulák elektronjai között. Ezt később részletesen tárgyaljuk. Ha kvantumállapotok koherens egymásra helyezéséről van szó, akkor a dolgok nagyon különbözőek, és ezekre a megfigyelésekre alapozva sok érdekes és ellentmondásos elképzelés mára laboratóriumi valóság. Ide tartozik az inverzió nélküli lézerezés (12–15), az elektromágnesesen indukált átlátszóság (16, 17), a fény, amelynek ultralassú csoportsebessége 10 m/sec nagyságrendű (18–23), és az ultrarövid impulzusok generálása fény szakaszos molekuláris állapotok alapján (24, 25).

A jelen cikkben egy másik feltörekvő technológia az izgalmas előrelépés a molekuladinamika femtoszekundumos kvantumszabályozásában, amelyet Judson és Rabitz eredetileg javasolt (26). Ezt az előrelépést Kosloff et al. (27), Warren és mtsai. (28), Gordon és Rice (29), Zare (30), Rabitz és mtsai. (31) és Brixner és mtsai. (32) A kvantum koherens vezérlésével kapcsolatos egyéb kapcsolódó munkák közé tartozik Brann és Shapiro (33) kvantuminterferencia megközelítése, az időtartomány (pump-dump) technika, amelyet Tannor et al. (34), valamint Bergmann és mtsai stimulált Raman adiabatikus passzázs (STIRAP) megközelítésével. (35) koherens lézerimpulzusok sorozatának előállítása. Az előző tanulmányok megtanítják, hogyan lehet olyan impulzusokat előállítani, amelyeknek tetszőlegesen szabályozható amplitúdója és frekvenciaideje függ. Valójában az impulzusok femtoszekundumos impulzusalakítóval történő faragásának képessége fontos új eszközt jelent az egész optika számára [lásd Heritage és mtsai úttörő munkáit. (36), Weiner és mtsai. (37), Wefers és Nelson (38) és Weiner (39)].

Ígéretes megközelítés a tanulási algoritmusok alkalmazása, így nincs szükség a molekuláris potenciális energiafelületek és a felületek közötti mátrix elemek ismeretére. A pontos rendszertani markerek gyakorisága nem feltétlenül ismert; visszacsatolási rendszerrel összekapcsolt impulzusalakító alkalmazásával azonban összetett spektrumok tárhatók fel.

Így most már rendelkezésünkre állnak technikák a fázis-koherens femtoszekundumos impulzusok vonatainak vezérlésére a molekuláris koherencia maximalizálása érdekében. Ez a folyamat lehetővé teszi számunkra, hogy növeljük a Raman jelet, miközben csökken a nemkívánatos fluoreszcencia háttér, amelynek sok közös vonása van a 3. ábra CARS spektroszkópiájával (40), de lényeges különbségekkel, amint ezt most megvitatjuk.

(a) Rendes rezonáns Raman-spektroszkópia, amelyben a ɛ1 amplitúdójú hajtólézer gyenge field2 amplitúdójú jelteret generál. A bejövő jel egy impulzusból áll ν1-nél, és az impulzus szerkezete a molekuláris közeggel való kölcsönhatás után két impulzusból áll ν1 és ν2 értékeken. (b) A CARS-hez kapcsolódó koherens Raman-folyamatot ábrázolják, amelyben az 1> és 2> frekvencián két mező esik ɛ1 és ɛ2 amplitúdóval. A harmadik sugárzott anti-Stokes jelmező a ν3 frekvencián van feltüntetve. (c) FAST CARS konfiguráció, amelyben a maximális koherens Raman spektroszkópia képzeli el. Az ɛ1 és ɛ2 előkészítési impulzusok elősegítik a | b> és | c> állapotok közötti maximális koherenciát. Ezután a e3 szondalézer kölcsönhatásba lép ezzel az oszcilláló molekulakonfigurációval, és az anti-Stokes sugárzás keletkezik.

Miután kijelentettük céljainkat és megközelítésünket e célok elérése érdekében, hangsúlyozzuk, hogy a jelen cikk lényegében mérnöki törekvést jelent. Javasoljuk, hogy erősen merítsen a kvantum koherenciájában és a kvantum kontrolljában folyamatban lévő munkára, amint azt korábban említettük. Például a Würzburg-csoport körültekintő kísérletei és elemzése a porfirinmolekulák alapállapot-koherenciájának előállításáról és vizsgálatáról (41) a femtoszekundum-CARS (fs-CARS) által nagyon fontosak. Az alapállapot koherenciáját azonban ezekben a kísérletekben nem maximalizálják. Egy másik gyönyörű kísérletsorozatban (42) a diacetilén polimerjeinek fs-CARS-on keresztüli szelektív gerjesztését vizsgálják. Ők szabályozzák előkészítési impulzusuk időzítését, fázisát és frekvenciáját (csirpelését). Ezekben a kísérletekben a gerjesztett állapotú molekuladinamika alakulására kellett koncentrálni. Reméljük, hogy elkerüljük ezt a szövődményt, amint azt később kifejtjük.

Talán a legközelebb áll a megközelítésünkhöz a Garching Max-Planck és a Würzburg csoport közelmúltbeli közös munkája (43). Írásuk példája a FAST CARS kísérletnek. Azonban arra koncentrálnak, hogy „bizonyos kötés rezgőmozgásának” erősen gerjesztett állapotát hozzák létre. Technikájuk alkalmazása a 2a. Ábra | b> és | c> állapotai közötti maximális koherencia előállítására molekulájuk meghatározott rezgési módjában nagy érdeklődésre tart számunkra és folyamatban van.

Végül szeretnénk felhívni az olvasó figyelmét a Journal of Raman Spectroscopy fs-CARS című közelmúltbeli különszámában megjelent hasznos cikkgyűjteményre (44). Hasonlóképpen Silberberg és munkatársai (45, 46) közelmúltbeli munkája, amelyben megmutatták, hogy a közeli Raman két szintjének egyikét is fel lehet gerjeszteni, még akkor is, ha jóval a széles fs impulzus spektrumon belül vannak, ez is egy kiváló példa a a FAST CARS technika.

Jelen munka egy maximálisan fázis-koherens molekulacsoport, azaz a molekuláris fázisónium felhasználására összpontosít a Raman-aláírások fokozása érdekében. Ez egy koherens impulzus gondos szabásával valósul meg, amelynek célja a molekula maximális alapállapotú koherenciával történő előállítása. Az ilyen impulzus egyfajta „dallam”, amelyet egy adott molekula előállítására terveztek. Miután ismerjük ezt a molekuláris dallamot, felhasználhatjuk az adott molekula mozgásba hozatalához, és ezt a rezgő mozgást egy másik impulzus detektálja; ez a FAST CARS protokoll, amelyet a 3c. ábra mutat be.

A következő részben áttekintjük a biológiai spórákra alkalmazott Raman-spektroszkópia állapotát. Ezután összehasonlítjuk a Raman spektroszkópia különféle típusait a kvantum koherencia legutóbbi sikeres alkalmazásával a lézerfizikában és a kvantumoptikában. Ezután számos kísérleti sémát mutatunk be ezeknek a megfontolásoknak a makromolekulák, és általában a biológiai spórák gyors azonosítására történő alkalmazására. Végül számos olyan forgatókönyvet javasolunk, amelyekben a FAST CARS hasznos lehet a bakteriális spórák gyors kimutatásában. A hivatkozott különféle mellékletek kiterjesztett cikkünkben találhatók, amelyet kiegészítő információként a PNAS webhelyén, a www.pnas.org címen teszünk közzé. Mint korábban említettük, ez a cikk a baktériumok spórák kimutatásának problémájával kapcsolatos ígéretes megközelítés mérnöki tudományának elemzése.

A baktériumspórákra alkalmazott Raman-spektroszkópia pico-áttekintése

A baktérium spóra csodálatos életforma. A több ezer éves spórák életképesek. Egy tankönyv (48) arról számolt be, hogy „a borostyánban 25 millió évig csapdába esett endoszporák csíráznak, ha tápanyag-közegbe kerülnek”.

A hihetetlen hosszú élettartam kulcsa a dipikolinsav (DPA) és só-kalcium-dipikolinát jelenléte az élő magban, amely tartalmazza a DNS-t, az RNS-t és a fehérjét, amint az a 4. ábrán látható.