Helyi szöveti válasz a ceftriaxon szubkután beadására állatmodellben

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

Az 1970-es évek óta az ambuláns parenterális antimikrobiális terápia (OPAT) életképes lehetőség azoknak a betegeknek, akik intravénás antibiotikumokat igényelnek, ami miatt a kórházi kezelést szükségtelennek tartják. Az OPAT azonban megköveteli egy hosszú távú vénás hozzáférési eszköz (azaz perifériásan behelyezett központi katéter [PICC]) elhelyezését és az otthoni vagy orvosi rendelő-alapú infúziós szolgáltatások összehangolását. A PICC vonalak elhelyezése késleltetheti a kórházi mentést, és szövődményekkel járhat. A PICC vonalak nem tervezett sürgősségi osztályok látogatásaihoz is társultak szövődmények, köztük fertőzések vagy vérrögök miatt, amelyek gyakran kórházi kezelést eredményeznek.

Míg az intramuszkuláris beadás az antibiotikumok (például a ceftriaxon) általánosan elfogadott módja az FDA-nak, gyakran fájdalommal és helyi kellemetlenséggel társul (1). Az antibiotikumok szubkután beadása előnyökkel jár a fentiekben kiemelt intravénás és intramuszkuláris útvonalhoz kapcsolódó számos korlátozással szemben. Az Egyesült Államokban jelenleg nincsenek szubkután alkalmazásra jóváhagyott antibiotikumok. A ceftriaxont azonban Franciaországban szubkután beadásra engedélyezték. Bár számos antibiotikum szubkután beadását jelentették, a nemkívánatos események, köztük a bőr nekrózisának magas arányát figyelték meg (2). A szubkután gyógyszer beadása esetén több tényező is befolyásolhatja az elviselhetőséget. Ezek a tényezők magukban foglalják az injektálás térfogatát/sebességét, viszkozitását, pH-értékét, ozmolalitását, hígítószert, puffert és pufferkoncentrációt (3, 4). Ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy kifejlesszen egy állati szöveti nekrózis modellt a ceftriaxon szubkután beadásának lokális tolerálhatóságának értékelésére különböző koncentrációkban és adagolási sebességeken.

EREDMÉNYEK

A negatív kontroll állatoknál nem észleltek durva elváltozásokat. A patkány bőrének mikroszkópos vizsgálata azonban bizonyította az exogén hatásokat az injektált állatokban, összehasonlítva a kezeletlen kontrollokkal. Azok a állatok, akiknek „ál” tűt/normál sóoldat injekciót adtak, egyértelműen szöveti rendellenességet mutattak ki, és markáns szubkután krónikus (limfocita és hisztocita) gyulladásos beszűrődést mutattak be angiogenezissel, valamint fokális vérzéssel (1. ábra). A kálium-kloriddal végzett injekciók teljes vastagságú bőrelhalást és szubkután atrófiát eredményeztek, amelyet a sóoldattal injektált állatoknál nem tapasztaltak; az izmos panniculus (MP) gyulladását figyelték meg, különböző fokú myocyta sérüléssel (2. ábra). A későbbi összehasonlítás szempontjából optimális feltételként 2 meq/2 ml koncentrációt azonosítottunk; a közepes súlyosságú helyi elváltozásokat a következetes módon a vizsgálat korai befejezése nélkül figyelték meg a kiterjedt eschar-képződés és etikai aggályok miatt. A hisztopatológiai index pontszámai 7,5 és 17,75 között változtak a fiziológiás sóoldat (negatív) kontrolloknál (medián, 11,3) és 18,5 és 41,25 között a kálium-klorid (pozitív) kontrolloknál (medián, 27,1) (P = 0,005 Mann-Whitney teszttel).

Reprezentatív szövettani eredmények negatív kontroll mellett (nátrium-klorid, 0,9%). H&E festés látható. A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott 4 μm-es szövetszakaszok normális epidermist, dermist és izmos panniculust (MP), valamint egy szubkután teret mutatnak, enyhe krónikus gyulladásos sejtekkel az injekció beadásának helyén. Az epidermisz és a dermis adnexalis szőrtüszőkkel és faggyúlebenyökkel normális, ép és jól körülhatárolható stratum corneum, stratum granulosa, stratum spinosum és stratum basale (bal és jobb felső). Az adnexe-ok sorvadás és sérülésmentesek, a bőr érrendszere normális, megnövekedett szám (telangiectasia), kaliber vagy falvastagság (bal és jobb felső) nélkül. Az izmos panniculus normál izomsejt-kaliberű, perifériás nukleáris helyet és izomrost megjelenést tartalmaz, megnövekedett intersticiális térfolyadék (ödéma) vagy rendellenesen megnövekedett erek nélkül (bal alsó rész). A szubkután zsírszövet az MP-n belül helyezkedik el (jobb alsó rész), szétszórt krónikus gyulladásos sejtekkel, amelyek többnyire limfociták, ritka plazmasejtekkel és fokális extravazált vörösvértestekkel. Különösen hiányoznak az akut gyulladásos sejtek, a neutrofilek/polimorfonukleáris sejtek (PMN) és az őszinte vérzés. Nagyítások, × 4 (bal felső sarokban) és × 20 (mások).

Reprezentatív szövettani eredmények pozitív kontroll mellett (kálium-klorid, 2 meq/2 ml). H & E festés látható. A titrált pozitív kontroll megőrzi az érintetlen epidermist fokális felületi spongiosissal és krónikus gyulladással, valamint a dermist az összes normális adnexe-vel (teteje). A fennmaradó epidermisz normális, jól karbantartott rétegekkel (jobb felső sarokban). Az izmos panniculus ödémás (megnövekedett tér az izomsejtek között) telangiectasiaval (megnövekedett erekkel) és torlódással (vörösvérsejtekkel töltött lumen és nincs látható fibrin) (bal alsó sarokban). Ezenkívül az izmos panniculus vegyes akut-krónikus gyulladásos infiltrátumot tartalmaz, többnyire limfocitákkal, plazma sejtekkel és ritkán neutrofilekkel (bal alsó rész). A szubkután tér telangiectasia és vaszkuláris torlódást mutat, markáns kapilláris szivárgással (extravazált vörösvértestek és fibrin), ödémával és krónikus gyulladással (bal felső sarokban [zöld doboz] és jobb alsó sarokban). Nagyítások, × 4 (bal felső sarokban) és × 20 (mások).

Körülbelül 125 mg/ml ceftriaxont 1 perc alatt beadott állatok tipikus szövettani eredményei. H & E festés látható. A metszetek sértetlen epidermist mutatnak minden normál réteggel és dermissel anélkül, hogy rendellenességek és normális adnexe lennének. Az izmos panniculus normális. A szubkután rekeszben üreges vérzés, fokozott fibrózis, fibrinos nekrózis, adipociták elvesztése és limfoplazmatikus krónikus gyulladásos infiltrátum található. Nagyítások, × 4 (bal felső sarokban) és × 20 (mások).

Körülbelül 25 mg/ml ceftriaxont 120 perc alatt beadott állatok tipikus szövettani eredményei. H & E festés látható. Az epidermisz, a dermis és az izmos panniculus normális. Enyhe krónikus gyulladást észlelnek a szubkután rekeszben, normál adipociták megtartásával telangiectasia, nekrózis, fibrózis, vérzés, akut gyulladás vagy súlyos krónikus gyulladás nélkül. Nagyítások, × 4 (bal felső sarokban) és × 20 (mások).

A különböző kezelési kohorszok hisztopatológiai pontszámainak összehasonlítása. NaCl, normál sóoldat, 0,9% (tömeg/térfogat), 2 ml; KCl, 2 mekv/2 ml kálium-klorid. A ceftriaxont (CRO) napi 1000 mg/kg adagban adták minden csoport számára. Minden nullpont az állat 4 negyedének átlagos pontszámát jelenti. A vízszintes oszlopok az egyes csoportok mediánjait jelentik. *, P 75 évesek, akik szubkután ceftriaxont kaptak, arról számoltak be, hogy nem állapították meg, hogy a ceftriaxon szubkután beadásával összefüggésben lenne semmilyen káros esemény (8). A szubkután antibiotikumok beadása nem jár csökkent hatékonysággal vagy megnövekedett halálozási rátával.

Egy másik prospektív megfigyelési multicentrikus vizsgálatban a szubkután antibiotikum-beadás gyakori, bár jóindulatú helyi káros hatásokkal járt (3). A fájdalom volt a leggyakrabban jelentett káros hatás. A beadott antibiotikum osztályát, gyors antibiotikus infúziót (400 mg/ml) bolus injekció formájában adták be (9). A frakcionálás tervezésével később megállapítottuk, hogy a gyógyszerkoncentráció összefüggésbe hozható a helyi szöveti gyulladásos reakcióval. Megjegyeztük, hogy a gyógyszer koncentrációjának nagyobb infúziós térfogattal történő csökkentésével a gyógyszer beadásának időtartama valószínűleg meghosszabbodik. Azonban ugyanazon gyógyszer-koncentráció hosszabb ideig történő beadása önmagában nem eredményezte a hisztopatológiai pontszámok javulását. Ezek a megfigyelések azt jelezték, hogy a helyi gyógyszerkoncentráció nagyobb hatással volt a szöveti gyulladásos válaszra, mint a gyógyszer beadásának időtartama. Röviden megvizsgálták a ceftriaxon beadásának közepes időtartamának (több mint 30 perc) hatását, de nem találták, hogy ez nagy előny lenne a hisztopatológiai pontszám csökkentésében (az adatokat nem mutatjuk be).

Vizsgálatunknak számos korlátja volt. Először csak az in vivo lokális szöveti választ értékeltük egy időközi keret (azaz 12 nap) végén; hosszabb időtartam informatívabb lehetett volna a krónikus terápiában. Másodszor, nem végeztek longitudinális értékeléseket (szekvenciálisan az idő múlásával), hogy megértsék a helyi gyulladásos válasz kezdetét és sebességét. Harmadszor, nem vizsgáltuk a helyi gyulladásos válasz reverzibilitását/helyreállítását a szubkután gyógyszer beadásának leállításakor. Végül csak egy ceftriaxon készítményt vizsgáltak; eredményeink nem feltétlenül alkalmazhatók közvetlenül a ceftriaxon egyéb kereskedelmi készítményeire. Előzetes eredményeink alapján a folyamatban lévő vizsgálatok igazolják fiatalkorú sertésmodell eredményeinket, amelyet nagyobb klinikai jelentőségűnek tekintenek az emberi bőr anatómiájához való hasonlóság (azaz hasonló bőrvastagság, patkányos izmos panniculus hiánya) miatt és durva és ritka szőr, és nem szőr, mint patkányokban). A jövőbeni irányok tartalmazzák a bőr gyulladásos hisztopatológiai indexének további validálását több mint 2 mikroszkóppal, beleértve a napközi és az interobserver pontosság számítását.

Összefoglalva, a ceftriaxon infúziót meglehetősen jól tolerálták egy állati szöveti nekrózis modellben. A helyi szöveti válasz figyelemre méltóan csökkent, ha ugyanazt a ceftriaxon dózist alacsonyabb koncentrációban (25 mg/ml) adták hosszabb ideig (120 perc). Ha validálták, a modell instrumentális gyógyszerfejlesztési platform lehet a különböző gyógyszerkészítmények szubkután adagolásának értékelésére.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Antimikrobiális szerek és reagensek. A ceftriaxon injekcióhoz (USP) (0001D81 tételszám) saját készítményét az ACS Dobfar-tól (Tribiano, Olaszország) szereztük be. Nátrium-klorid (0,9%, tömeg/térfogat) injekciót (USP), kálium-klorid (2 meq/ml) injekcióhoz való koncentrátumot (USP) és nem pirogén steril injekcióhoz való vizet (USP) vásároltunk a Henry Schein Animal Health-től (Dublin) (OH). A ceftriaxon friss oldatát készítjük steril vízben, a kívánt koncentrációra hígítjuk, és minden nap azonnal felhasználjuk.

Állatok. Sprague-Dawley patkányokat (nőstények, 225–250 g; hímek, 325–350 g) (Envigo RMS, Inc., Indianapolis, IN) használtunk. Valamennyi állatot a legmagasabb humánus és etikai normáknak megfelelően gondozták, a Houstoni Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (IACUC) jóváhagyásával. A patkányok ad libitum táplálékot és vizet kaptak. Minden kísérlet előtt a patkányokat hajvágógépekkel borotválták az alapvonalon és szükség esetén. Minden állat hátsó részét négy negyedre osztottuk (azaz tengelyekkel a középvonalon/a gerincnél és a középtájnál), az injekciókat minden nap forgattuk a kvadrátok között. Orális acetaminofen oldatot (1,6 mg/ml ivóvízben) állítottunk elő az állatokban tapasztalható kellemetlenségek kezelésére. A vizsgálat időtartama alatt 3-4 naponta készítünk friss acetaminofen oldatot. Nem használtunk nem szteroid gyulladáscsökkentőket (pl. Karprofent), mivel ezek befolyásolhatják a vérlemezkék aktiválódását és a szövetgyulladást (a vizsgálat végpontjai).

Kísérleti tervezés és biztonsági értékelés. Az egyes kísérletek időtartama 12 nap volt egy tipikus antibiotikum-kúra utánzásához. Az állatokat (n = 6 csoportonként; minden nemből 3 állat) minden injekció beadása előtt altattunk (izofluránnal). Megfelelő előkészítés után a bőrt háromszögbe szorították a tű beillesztésére a testtel párhuzamos két ujj között, hogy be lehessen hatolni a szubkután térbe. 27-es tűt használtunk, és naponta egyszer különféle szereket injektáltunk szubkután.

Helyi tolerálhatóság értékelése. Mindegyik állatot naponta ellenőriztük a bőr intoleranciájának, beleértve a nekrózist. Minden bőrnegyedet szemrevételezéssel megvizsgáltak bőrpír, induráció (vagy tapintható dudor vagy szöveti ödéma jelei), petechiák (kapilláris szivárgásra utaló piros foltok), pikkely (bőrpehely), szérum kéreg (varasodás), vízelvezetés (serozus, vér, vagy kevert), gennyes genny/genny (akut gyulladás [neutrofilek]), bűzös szag (a bőr és a lágy szövetek fertőzésének jelei) vagy fekete eschar képződése (meghatározható nekrózis és irreverzibilis szövetkárosodás esetén). Egy fekete eschar vizualizálása befejezné a tanulmányt. A hólyagok nem várhatók, és csak akkor fejeznék be a kísérletet, ha meghaladják az> 1 cm átmérőt. Az állatok viselkedését a fájdalomértékelés helyettesítőjeként nevezték meg, amely magában foglalta a kezelés során történő visszavonást, az injekció helyének könnyű megérintésével történő visszahúzást, rázást, hátulsó ívelést, farokgöndörítést, valamint az élelmiszer- vagy vízfogyasztás csökkenését. A kísérlet végén a patkányokat CO2-elfojtással áldoztuk meg legalább 3 órával az utolsó injekció után.

Az eutanázia után az egész háti bőrt kivágták a hát és a mellkas myofascialis síkjáig. Megjegyezték a fokozott tapadás (fibrózisra utaló) vagy vörösség (angiogenezisre vagy vérzésre utaló) területeket. Excsizív és lyukasztásos biopsziás mintavételt (kör alakú vágóél, 5 mm és 8 mm között) végeztek a subcutis külső felületéről és a mortem utáni vizsgálattal. A szöveteket 10% semleges pufferolt formalinban rögzítettük legalább 5 órán át a szöveti feldolgozás előtt soros dehidratálással (osztályozott etanol), tisztítottuk (xilol), és parafin viaszba ágyazottuk be szöveti blokkokként, szokásos módon. A formalinnal rögzített paraffinba ágyazott (FFPE) blokkokat rutinszerű klinikai hisztopatológiai technikák alkalmazásával metszettük, ideértve a 4-7 μm vastagságú mikrotómiát, töltéssel ellátott üveg tárgylemezekre történő átültetéssel; hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festve; fedőfedél rögzítő közeggel; és mikroszkópos morfometrikus elemzésnek vetjük alá.

Szövettani kórkép. A helyi szöveti sérüléseket az állatok kezelésének ismerete nélkül értékelték. A szövetarchitektúra globális értékelését szkennelő nagyítással (eredeti nagyítás, × 2 és × 4) végeztük, függőleges áteresztett fénymikroszkóppal, amely parfókális Köhler-megvilágításra hangolt (Eclipse Ci [Nikon, Tokió, Japán] vagy BX43 [Olympus, Tokió, Japán). ]). × 20-as nagyítással a 4 szövetrész (epidermisz, dermis [papilláris és retikuláris], izmos panniculus és szubkután zsír) átfogó áttekintését 40 hisztomorfológiai jellemző között félkvantitatívan elemeztük (lásd a kiegészítő anyag S1 táblázatát). összetett bőrgyulladásos hisztopatológiai index pontszámot generálhat 0 és 100 között. A pontszámot két vizsgáló (tábla által tanúsított anatómiai patológus [DN Cohen] és egy tapasztalt mikroszkóp [B. Guillory]) belül validálták. Mindkét nyomozót kezdetben 10–20 eset együttes áttekintésével képezték ki, és egymástól függetlenül 10 további esetet pontoztak. Időnként kisebb, 1-5 egység közötti nézeteltéréseket figyeltek meg. A 10 pont feletti nagyobb nézeteltéréseket nem figyelték meg. A jelentett pontszámok egyedi és konszenzusos felülvizsgálatokból származnak.

Statisztikai analízis. A hisztopatológiai pontszámokat egymástól függetlenül értékeltük minden állat kvadránsnál. Ha egynél több mintát nyertünk egy kvadránshoz (például alkalmanként, amikor nagy elváltozás történt), akkor a kvadráns legmagasabb pontszámát használtuk. A 4 kvadráns pontszámát átlagoltuk minden állatra. A különböző kohorszok index-pontjait Kruskal-Wallis-teszt (nonparametrikus varianciaanalízis [ANOVA]) segítségével hasonlítottuk össze, majd Dunn-teszt követte a többcsoportos összehasonlításokat. A kiválasztott 2 csoportos összehasonlításokat a Mann-Whitney teszttel is elvégeztük; a 0,01-nél kisebb P-értéket szignifikánsnak tekintették. A hagyományosnál magasabb küszöböt alkalmazták a negatív kontrollcsoporttal való többszörös kétirányú összehasonlítások potenciális problémájának csökkentésére (Bonferroni-korrekció).

ELISMERÉS

Ezt a vizsgálatot az scPharmaceuticals (Burlington, MA) támogatta.