A májglikogén csökkenti a táplálékfelvételt és gyengíti az elhízást egy magas zsírtartalmú étrenddel táplált egérmodellben

Absztrakt

Bevezetés

A máj glikogén energiaraktárként működik a táplálék-elégséges időszakokban, és szükség esetén alkalmazható. Ennek a poliszacharidnak az anyagcseréjét a májban két kulcsfontosságú enzim: a glikogénszintáz (GS) és a glikogén-foszforiláz (GP) aktivitása szabályozza (1). A GS több helyen foszforilálódik, ami inaktiválódását indukálja, míg a GP-t egyetlen helyen foszforilezéssel aktiválják. Mindkét enzim alloszterikusan is szabályozott (2,3).

A glikogénre célzó alegységek kötődnek a glikogénhez és a protein-foszfatáz 1-hez (PP1), és megkönnyítik a GS és GP defoszforilezését, ezáltal aktiválva az előbbit és inaktiválva az utóbbit. Hat gén kódolja a glikogén-célzó alegységeket (4). Ezek közül a sok szövetben expresszálódó fehérje glikogénre (PTG) (PPP1R3C vagy PPP1R5) történő célzása kimutatták, hogy különböző állatmodellekben kontrollálja a glikogén készleteket (5–7).

Az adenovirális PTG túlzott expressziója normál patkányok májában növeli a glikogént és javítja a glükóz toleranciát anélkül, hogy zavarná a lipid anyagcserét (8). Cukorbetegség-fókuszált megközelítésben Yang és Newgard (9) kimutatták, hogy a PTG adenovirális expressziója az STZ-diabéteszes patkányok májában megnövelte a glikogén-tartalmat, és megfordította a hiperglikémiát és a hiperfágiát. Más megközelítéssel beszámoltunk arról, hogy az STZ-diabéteszes patkányokban a máj GS aktív formájának (LGS) máj adenovirális expressziója, amely szintén növeli a glikogén tartalmat, csökkentette a táplálékfelvételt és a hiperglikémiát (10).

Russek (11) elsőként javasolta az élelmiszer-bevitel hepatosztatikus elméletét, amelyet Flatt (12) tovább definiált glikogenosztatikus modellként. Ez a modell azt jósolja, hogy az egyének olyan szintre fogyasztják az ételt, amely fenntartja a test glikogénszintjét (12). Valójában számos kísérleti bizonyíték mutat összefüggést a máj glikogénkészleteinek nagysága és az élelmiszer-bevitel között (13,14); azonban más eredmények vitatták ezt a hipotézist (15–17). Az eredmények Yang és Newgard (9) és Ros et al. (10) alátámasztják azt az elképzelést, miszerint a máj glikogénje az 1-es típusú hiperfágikus diabéteszes állatok táplálékfelvételét szabályozó tényező. Ezek a vizsgálatok azonban korlátozták az adenovírus transzdukció alkalmazását állatmodellekben, amelyek a kísérleti időszakot 1 hétre korlátozzák. Jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a máj glikogénkészleteinek tartós növekedése szabályozza-e az élelmiszer-bevitelt. Erre a célra olyan egereket állítottunk elő, amelyek túlzottan expresszálják a PTG-t a májban (PTG OE), ami a máj glikogénjének tartós növekedését eredményezi, és vagy szokásos étrenddel, vagy magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) tápláltuk őket. A HFD-vel táplált állat alkalmas modell a csökkent glükóz tolerancia és a 2-es típusú cukorbetegség tanulmányozásához (18), és a HFD hosszan tartó lenyelése túlfogyasztással és elhízással jár (19).

Megmutattuk, hogy HFD-vel etetve a PTG OE állatok táplálék-fogyasztása csökkent, testtömegük és zsírtömegük alacsonyabb volt, mint a kontroll állatoké. Ezek az eredmények a máj-glikogén raktárakat azonosítják az ételfogyasztás szabályozójaként a hiperfágia és az elhízás modelljében, és arra utalnak, hogy a máj-glikogén növelésére irányuló stratégiák kezelési lehetőséget nyújthatnak a cukorbetegség és az elhízás szempontjából.

Kutatási tervezés és módszerek

A PTG túlexpresszáló egerek előállításához a genOway (Lyon, Franciaország) megtervezte és végrehajtotta a célvektor-konstrukciót és a helyszínre irányított transzgenikus stratégiát. Röviden: a mindenütt jelenlévő CAG promoter (citomegalovírus azonnali korai enhancer/csirke β-aktin promoter fúzió) irányítása alatt lévő PTG cDNS-t homológ rekombinációval vezettük be egy ártalmatlan lokuszba. A CAG promoter és a PTG cDNS közé loxP-szegélyű transzkripciós stop kazettát helyeztek, hogy az expresszió a Cre rekombináz működésétől függjön. A kapott egérvonalat egy albumin promoter Cre rekombinázt expresszáló állattal (The Jackson Laboratory) tenyésztették, amely a PTG expresszióját kifejezetten a májba terelte. Az összes vizsgált egér alomtárs volt. Az egereket 12: 12 órás világos-sötét ciklusban tartottuk szabadon hozzáférve a vízhez, és standard táplálékkal (Harlan Laboratories) vagy HFD-vel (45% kcal zsír; katalógusszám: D12451; Research Diets) 16 hétig tápláltuk, 6 hetes.

Vér és máj biokémiai elemzés

A máj glikogéntartalmát amiloglükozidáz-alapú vizsgálattal határoztuk meg, másutt leírva (20). Az LGS aktivitást a korábban leírtak szerint határoztuk meg Glc-6-P jelenlétében vagy hiányában (10). Telített Glc-6-P jelenlétében mért GS-aktivitás [(+) Glc-6-P] megfelel az enzim teljes mennyiségének, míg annak hiányában végzett mérés [(-) Glc-6-P] a az aktív (nem foszforilezett) GS forma. A (-) Glc-6-P/(+) Glc-6-P aktivitási arány (GS aktivitási arány) az enzim aktivációs állapotának becslése. Az ATP intracelluláris koncentrációját a máj perklórsav-kivonatából mértük egy korábban leírt fluorimetriás módszerrel (21). A májban lévő triglicerideket triacil-glicerid készlet (Sigma-Aldrich) alkalmazásával számszerűsítettük 3 mol/l KOH-ban és 65% -os etanol-extraktumokban, a Salmon and Flatt (22) által leírt módszer alapján a máj elszappanosításához. A vércukorszintet glükométerrel (Ascensia Breeze2; Bayer HealthCare) mértük. A p-hidroxi-butirát (Sigma-Aldrich), a triacil-gliceridek (Sigma-Aldrich) és a nem észterezett zsírsavak (Wako) szérumkoncentrációit spektrofotometriásan mértük. A plazma inzulint és a leptint ELISA-val (Crystal Chem) elemeztük.

Glükóz és inzulin tolerancia tesztek

A glükóz tolerancia tesztek (GTT) céljából egy éjszakán át éheztetett (16 órás) egerekbe 2 g/kg glükózt injektáltunk i.p. A farkhegyből teljes vért vettünk a glükózméréshez. Az in vivo glükózstimulált inzulin szekréciót külön kísérletekben határoztuk meg. Az inzulin tolerancia tesztekhez (ITT) a 6 órán át éheztetett egereket 0,75 egység/kg inzulinnal injektálták i.p., és az injekció után a megadott időpontokban vett farokvérből mértük a glikémiát.

RNS-készítmények és kvantitatív RT-PCR

A szövet előkészítését, az RNS extrakcióját, az RT-PCR-t és a valós idejű kvantitatív analízist a leírtak szerint végeztük (23). A kvantitatív RT-PCR-hez a következő TaqMan primer/próba készleteket (Applied Biosystems, Madrid, Spanyolország) használtuk: PTG (Mm01204084_m1), Hprt (Mm00446968_m1), piruvát-kináz (Pklr) (Mm00443090_m1), zsírsavszintáz (Fasn19_mm00 ), acetil-CoA-karboxiláz (Acc1α) (Mm01304257_m1), SREBP1 (Mm00550338_m1), peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptor (PPAR) γ (Mm01184322_g1), monoacil-glicerin-O-acil-transzferferáz 1 (MGAT1) (MGAT1) Ucp1 (Mm01244861_m1), Ucp2 (Mm00495907_g1), Ucp3 (Mm00494077_m1), PPARα (Mm00440939_m1), Fgf21 (Mm00840165_g1), Y Mm01231183_m1), acil-CoA-oxidáz (Acox1) (Mm01246834_m1) és Ppia (Mm02342429_g1). A Ppia-t háztartási génként használták a májban. A Hprt-t háztartási génként használták a hipotalamuszban és a barna zsírszövetben.

Közvetett kalorimetria, táplálékbevitel és testhőmérséklet

A közvetett kalorimetriát egy nyolckamrás Oxymax rendszer (Columbus Instruments) segítségével végeztük a hőtermelés mérésére, amelyet az oxigénfogyasztás és a CO2 termelés alapján számítottunk ki. Az egereket 2 napig hagyták akklimatizálódni a ketrecekhez, egy vagy két 24 órás mérési ciklus előtt. Az energiafogyasztás kiszámítása (3,185 + 1,232 × RER) × VO2 (24) volt, ahol a RER (légzéscsere arány) = VCO2/VO2. Glükóz oxidáció (g/perc/kg 0,75 = [(4,545 × VCO2) - (3,205 × VO2)]/1000) és lipid oxidáció (g/perc/kg 0,75 = [1,672 × (VO2 - VCO2)]/1000 ) kiszámították. Az ambuláns és a teljes mozgásaktivitást infravörös fotocella-sugár megszakítási módszerrel figyeltük meg. A testhőmérsékletet állati rektális szonda hőmérővel (Cibertec) határoztuk meg. A táplálékbevitel nyomon követése érdekében az egereket egyedileg helyezték el és 1 hétig akklimatizálták a vizsgálat előtt. A táplálékfelvételt napi 5 napon keresztül mértük. Az epididymális zsírszövetet eltávolítottuk és paraffinban készítettük, miután 10% foszfáttal pufferolt formalinban rögzítettük. Ezután hematoxilin-eozin foltokat hajtottunk végre. Az adipociták méretének méréséhez a teljes adipocita területet manuálisan követték nyomon és elemezték. A fehér adipocita területeket minden csoportban egérenként ≥100 sejtben mértük.

Olajvörös O festés

A májszöveteket optimális vágási hőmérsékletű vegyületbe (Sakura Finetek) ágyazzák és lefagyasztják. A fagyott szöveteket 5 μm vastag kriozekciókra vágtuk, és olajvörös O-val (Sigma-Aldrich) festettük.

Statisztika

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A P értékeket nem párosított Student t teszttel, kétirányú ANOVA vagy háromutas ANOVA alkalmazásával számoltuk, post hoc Tukey tesztekkel. P OE) (lásd a kutatás tervét és módszereit). Ezen egerek májában a PTG mRNS-szintje 12-szer nagyobb volt, mint a kontroll állatoké (1A. Ábra). Ahogy az várható volt, az LGS aktiválódott, mert a PTG a PP1 glikogén részecskére irányításával a GS-t és a GP-t defoszforilezett állapotban tartja (7). A várakozásoknak megfelelően ezekben az egerekben aktiválódott az LGS (1B. Ábra).

Májspecifikus PTG túlzott expressziójú egerek jellemzése standard étrenddel vagy HFD-vel. A kontroll és máj 6 hetes PTG OE egereket standard táplálékkal vagy HFD-vel tápláltuk 16 hétig. A táplált és 16 órás éhomi egereket megölték. V: A PTG relatív mRNS-je a májban táplált körülmények között. B: A máj GS-aktivitása a (-) Glc-6-P/(+) Glc-6-P arányában kifejezve táplált körülmények között. C: Májglikogén tartalom táplált körülmények között vagy 16 órás gyors. D: Quadriceps izomglikogén tartalma táplált körülmények között. Az adatok átlag ± SEM. n = 5–8/csoport. * P OE egerek szokásos táplálékkal vagy HFD-vel etettek; ^ P OE egerek és éheztetett PTG OE egerek; §P OE egerek a máj glikogéntartalmának körülbelül kétszeres növekedését mutatták a kontroll állatokhoz képest (1C. Ábra), függetlenül attól, hogy standard étrendet vagy HFD-t kaptak (1C. Ábra).

Egy éjszakán át tartó böjt után a PTG OE egerek csökkent májglikogén-tartalmat mutattak az etetett állapothoz képest. Ez a megfigyelés a máj glikogén nettó mobilizálását jelzi, bár ez a glikogén nem volt ugyanolyan mértékben kimerült, mint a kontroll egereknél (1C. Ábra). Ráadásul éhgyomorra a HFD-t kapó kontrollegerek magasabb májglikogén-tartalmat mutattak, mint a standard étrendet tápláló éheztetett kontrollállatok, amint arról korábban beszámoltunk (25) (1C ábra). A csontvázizom glikogén tartalma hasonló volt a csoportok között, és így összhangban állt azzal az elképzeléssel, hogy a nem májsejtekben a glikogénszintézis nem változott (1D. Ábra).

A HFD által táplált PTG OE egereknek alacsonyabb az étkezésük és csökkent az elhízásuk

A kontroll és a PTG OE állatok normál étrenddel vagy HFD-vel etetett energiafelhasználása. A kontroll és máj 6 hetes PTG OE egereket standard táplálékkal vagy HFD-vel tápláltuk 16 hétig. V: Pihentető oxigénfogyasztás a világos és a sötét fázis alatt, és az összes állat standard táplálékkal etetett. B: Nyugalmi oxigénfogyasztás a világos és a sötét fázis alatt, és az összes HFD-vel táplált állat. C: RER a világos és sötét fázisban, és az összes állat normál étrendet etetett. D: RER a világos és sötét fázisban, és az összes állat HFD-vel etetett. E: mozgásszervi aktivitás (ambuláció) a világos és sötét fázis alatt, valamint a szokásos étrenddel etetett állatok teljes aktivitása. F: mozgásszervi aktivitás (ambuláció) a világos és sötét fázis alatt, valamint a HFD-vel táplált állatok teljes aktivitása. G: Mozgásszervi aktivitás (teljes szám) a világos és sötét fázisban, valamint a szokásos étrenddel etetett állatok teljes aktivitása. H: mozgásszervi aktivitás (teljes szám) a világos és sötét fázis alatt, valamint a HFD-vel táplált állatok teljes aktivitása. Az adatok átlag ± SEM. n = 6–8/csoport. SD, szokásos étrend.

RER, glükóz és lipid oxidáció. A kontroll és máj 6 hetes PTG OE egereket standard táplálékkal vagy HFD-vel tápláltuk 16 hétig. V: RER a világos és a sötét fázisban, és az összes állat standard táplálékkal etetett. B: RER a világos és sötét fázisban, és az összes HFD-vel táplált állat. C: A glükóz oxidációja a világos és a sötét fázisban, és az összes állat standard táplálékkal etetett. D: A glükóz oxidációja a világos és a sötét fázis alatt, valamint az összes HFD-vel táplált állat. E: A lipid oxidációja a világos és a sötét fázis alatt, és az összes állat standard táplálékkal etetett. F: Az állatok lipid oxidációja a világos és a sötét fázisban, valamint az összes HFD-vel táplált állat. G: Kvantitatív valós idejű PCR, amely az Ucp1, Ucp2 és Ucp3 relatív mRNS-szintjét mutatja HFD-vel táplált állatok barna zsírszövetében. H: HFD-vel etetett állatok magtesthőmérséklete. Az adatok átlag ± SEM. n = 6–8/csoport. * P OE egerek szokásos táplálékkal vagy HFD-vel etettek. BAT, barna zsírszövet; SD, szokásos étrend.

Az etetési periódus (sötét fázis) során a HFD-vel táplált PTG OE egerekben az RER kissé megnőtt, ami azt jelzi, hogy ezek az állatok éjszakánként több szénhidrátot használtak energiaforrásként, mint a kontroll csoport (4B. Ábra). Ezeket az eredményeket megerősítettük az oxidált glükóz mennyiségének kiszámításával, amely megnövekedett a PTG OE egerekben, akiket HFD-vel tápláltunk (4D. Ábra). Azonban a PTG OE standard táplálékkal táplálva ugyanannyi glükózt oxidált, mint a kontroll egerek (4C. Ábra). A lipidoxidáció változását nem tapasztaltuk a PTG OE egerekben, amelyeket standard táplálékkal (4E. Ábra) vagy HFD-vel (4F ábra) tápláltak. Mivel a HFD-vel táplált PTG OE-ben a glükóz oxidációja magasabb volt, a máj ATP-tartalmát vizsgáltuk. Ismeretes, hogy ez a paraméter csökken a HFD által kiváltott diabéteszes egerek májában (29). A HFD-vel táplált egerek májjában az ATP-tartalom szignifikánsan csökkent, és a PTG túlzott expressziója hasonló ATP-tartalmat eredményezett, mint a szokásos étrenddel etetett egereké (2H ábra).

A máj PTG túlzott expressziójának hatása a vércukorszintre, az inzulinszintre, a glükóz toleranciára és az inzulin érzékenységre

A máj kulcsszerepet játszik a vércukorszint eltávolításában az étkezés utáni állapotban (30). A táplált PTG OE állatok vércukorszintje alacsonyabb volt, mint a kontroll alomtársaké, függetlenül a kapott étrendtől (5A. Ábra). A vércukorszint és a plazma inzulin koncentrációja csökkent a kontrollállatoknál, amikor 16 órán keresztül élelemhiányt szenvedtek tőlük (5A. És B ábra). Az éheztetett PTG OE egereknek azonban hasonló volt a glükóz- és inzulinszintje, mint az etetett PTG OE egereknek. Ezt a hatást a megadott étrendtől függetlenül figyelték meg (5A. És B. Ábra). Ezenkívül a HFD-vel táplált PTG OE egerek alacsonyabb inzulinszintet mutattak táplált állapotban, mint az azonos étrendben lévő kontroll egerek (5B. Ábra).

Mértük az inzulin szekréciót az intraperitoneális GTT során is. HFD-re reagálva a PTG OE egerek csökkentették a glükóz által stimulált inzulin felszabadulását a kontroll egerekhez képest (5D. Ábra). Megjegyzendő, hogy az előbbi állatok inzulin felszabadulása hasonló volt a PTG OE állatokkal, amelyeket standard táplálékkal etettek (5D. Ábra).

Ezután 6 órás böjt után ITT-t hajtottak végre. Ilyen körülmények között a HFD-vel táplált PTG OE egereknek már lényegesen alacsonyabb volt a vércukor-koncentrációjuk, mint a HFD-vel táplált kontroll egereknek (14 ± 1,7 vs. 10 ± 0,3 mmol/l), ami megnehezítette az ITT eredményeinek elemzését. hasonlítsa össze (5E. ábra). Amikor azonban az ITT-t a kezdeti értékek százalékában fejeztük ki, a HFD-vel táplált állatok görbéje mindkét genotípusban hasonló volt (5F. Ábra). Megjegyzendő, hogy a szokásos étrenddel etetett PTG OE egerek 60 perccel az inzulininjekció után magasabb vércukorszintet mutattak. Ez a megállapítás azt sugallja, hogy ezek az állatok gyorsabban gyógyultak meg az inzulin által kiváltott hipoglikémiából, mint kontroll alomtársaik (5. ábra E és F).

A máj PTG túlexpressziója csökkenti a HFD által kiváltott máj steatózist

Elemeztük a PTG túlzott expressziójának hatását a máj triacil-gliceridjeinek tárolására is. Normál táplálékkal etetve a PTG OE egerek hasonló máj triacil-glicerin-tartalmat mutattak, mint kontroll alomtársaik (6A. És B. Ábra), ami arra utal, hogy a PTG ilyen körülmények között nem kapcsolódik a lipidanyagcseréhez. Ezenkívül a de novo lipogenezissel kapcsolatos gének kifejeződése nem módosult a standard táplálékkal etetett PTG OE állatokban (6.C ábra). HFD-vel etetve azonban ezek az állatok alacsonyabb máj triglicerid-tartalmat mutattak (6A. És B. Ábra), ami összefüggésben állt az SREBP1, GK, PPARγ és MGAT1 génexpresszió csökkentésével (6C és D ábra). Amint azt korábban leírtuk (31), megerősítettük, hogy a PPARγ és az MGAT1 expresszió normál májban nagyon alacsony volt, de a zsíros májban kifejezetten expresszálódott (6D. Ábra). A HFD-vel táplált csoportok között nem voltak statisztikailag szignifikáns különbségek a lipogén gének, például a Pklr, Fasn és Acc1α expressziójában (6C. Ábra). Kiértékeltük továbbá a lipid oxidációval kapcsolatos gének expresszióját. A PPARα, Cpt1α vagy Acox1 májban történő expressziójában nem találtak különbséget a genotípusok között (6. ábra E).

Ezenkívül a szokásos étrenddel etetett PTG OE egerek javított glükóz toleranciát mutattak. Ezzel az elképzeléssel összhangban az adenovírus által kiváltott PTG túlzott expressziója normál patkányokban a glükóz tolerancia mérsékelt javulását eredményezte; ezek az állatok azonban nem mutattak alacsonyabb glikogénszintet az éhezés hatására (8). A máj PTG OE egereink modelljében az állatok az éhgyomorra reagálva lebontották a glikogént, bár 16 órás éhezési időszak után nem voltak képesek teljesen kimeríteni ennek a poliszacharidnak a készletét. Ennél is fontosabb, hogy a PTG túlzott expressziója megfordította a HFD által kiváltott glükóz intoleranciát és hiperinsulinémiát. Hasonló vizsgálatok azt mutatták, hogy a PP1 egyéb célzó alegység-izoformáinak - például az izom izoformájának „GMΔC” csonkított változata - adenovírus alkalmazásával - expressziója javított glükóz-intolerancia patkányokban, akiket HFD-vel tápláltak, de nem csökkentették ezen állatok magas éhomi inzulinszintjét. (39).

Jelen eredmények azt mutatják, hogy a máj glikogén felhalmozódása megakadályozza a HFD által kiváltott glükóz intoleranciát, csökkenti a táplálékfelvételt és csökkenti a testtömeget. Összefoglalva, az eredmények rámutatnak a máj glikogéntartalmára, mint a cukorbetegség és az elhízás farmakológiai manipulációjának potenciális célpontjára.

Cikk információk

Köszönetnyilvánítás. A szerzők köszönetet mondanak Ramon Gomisnak, Rosa Gasának, Marc Schneebergernek és Marc Claret-nek, az Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer-nek (IDIBAPS) (Barcelona, Spanyolország) hasznos javaslatokért. Köszönetet mondanak az IRB Barcelona következő tagjainak: Mar García Rochának a segítségért és tanácsért; Manuel Gris, Emma Veza, Natalia Plana és Nuno Vasconcelos technikai segítségért; Antonio Berenguer az adatok statisztikai elemzésével kapcsolatos tanácsért; és Tanya Yates a kézirat angol változatának javításáért.

Finanszírozás. Ezt a tanulmányt a spanyol Gazdasági és Versenyképességi Minisztérium (BFU2011-30554) és a CIBERDEM (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovación) támogatásával támogatták.

Egyik támogató ügynökségnek sem volt szerepe a munka elkészítésében vagy a kézirat megírásában.

Érdeklődési kettősség. A cikk szempontjából lényeges összeférhetetlenségről nem számoltak be.