Inzulin- és leptinrezisztencia hiperleptinémiával egerekben, amelyekben nincs androgénreceptor

Absztrakt

AR, androgén receptor
GTT, glükóz tolerancia teszt
ITT, inzulin tolerancia teszt
PI3K, foszfoinozidid-3-OH kináz
PPAR, peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor
TNF-α, tumor nekrózis faktor-α
WAT, fehér zsírszövet

Becslések szerint 2030-ig ~ 366 millió embert érint a 2-es típusú cukorbetegség világszerte (1), közülük sok az idős korosztályban (2). Bár a betegséget okozó elsődleges tényezők megfoghatatlanok, egyértelmű, hogy az inzulinrezisztencia és a leptin-érzéketlenség nagy szerepet játszhat a fejlődésében (3).

Epidemiológiai bizonyítékok arra utalnak, hogy a 2-es típusú cukorbetegségben nemi különbségek vannak. A 2-es típusú cukorbetegség gyakorisága magasabb a férfiaknál, mint a nőknél (1), valószínűleg az inzulinérzékenység és a regionális testzsír-lerakódás különbségei miatt (4,5). A nemi hormonok hatásának részletes mechanizmusai az inzulinérzékenységre vagy a zsírlerakódásra azonban továbbra sem tisztázottak. A tesztoszteron és metabolitja, a dihidrotesztoszteron aktiválhatja az androgénreceptort (AR) androgén hatásuk kifejtésére. A megfelelő vagy maximális androgénhatás szükségessé teheti a szelektív szövetekben lévő szelektív coregulátorokkal való interakciót (6,7).

Kimutatták, hogy a leptin, az ob gén adipocita eredetű adipokinterméke negatív energiaháztartást vált ki az étvágy csökkentésével és az energiafelhasználás növelésével (8). A leptin a testzsír tömegével párhuzamos szinten kering a szérumban. Az elhízott egyénekről azonban kiderült, hogy ellenállnak a keringő leptin negatív szabályozó funkciójának (9). Az ob/ob és db/db egerek, amelyekből hiányzik a leptin, vagy amelyek leptin-rezisztensek, mélyen hiperfágikusak és hipometabolikusak, elhízott fenotípushoz vezetnek, és számos rendellenességet mutatnak, például 2-es típusú cukorbetegséget súlyos inzulinrezisztenciával, hipotermiával és hideg intoleranciával., meddőség és a sovány tömeg csökkenése (10–14).

A mai napig azonban az androgén-AR és az inzulinérzékenység kapcsolata továbbra sem tisztázott, és keveset tudunk arról, hogy az androgén-AR milyen szerepet játszik az életkorral összefüggő változásokban a leptin termelésének szabályozásában. Ezért feltételes kiütési stratégiát alkalmaztunk AR knockout egerek (AR -/y) előállításához ennek a kapcsolatnak a tanulmányozásához (15), és itt beszámolunk az AR elvesztésének az inzulin- és leptinrezisztenciára gyakorolt hatásáról.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Minden állatkísérletet a Rochesteri Egyetem Orvostudományi Egyetem állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyott jóvá az Országos Egészségügyi Intézet irányelveivel összhangban. A célvektorok felépítését és a kiméraalapító egerek generálását korábban leírták (15). A mozaikalapító egerek törzse C57BL/6 és 129Sv háttér volt. A β-aktin takarító gén, és minden szövetben univerzálisan expresszálódik; ezért a β-aktin promóter által vezérelt Cre (ACTB-Cre; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) az összes szövetben expresszálja és törli a lebegő AR fragmenseket. Az AR -/y egereket genotipizáljuk PCR-rel, a korábban leírtak szerint (15). Az állatokat kórokozóktól mentes létesítményekben helyeztük el, 12 órás világos/sötét rendben tartottuk (világítás 0600-kor), és szabad hozzáférést kaptak a szokásos laboratóriumi chow-hoz (5010 sz.; PMI Lab Diet, St. Louis, MO). víz.

Szövettan.

A szöveteket 10% semleges pufferolt formalinban rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. Nem szomszédos, 70–80 μm-rel elválasztott metszeteket kaptunk a perigonadal zsírpárnáiból, és szisztematikusan elemeztük az adipocita méretét és számát. A metszetek festését hematoxilin/eozin alkalmazásával végeztük. A képeket E800 mikroszkóppal (Nikon, Melville, NY) és SPOT kamerával (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI) szereztük, és a SigmaScan Pro szoftverrel (5.0 verzió; SPSS, Chicago, IL) elemeztük.

Analitikai eljárások.

Foszfoinozidid-3-OH kináz aktivitás.

Az egereket gyorsan 14 órán át vetjük alá, sóoldattal vagy inzulinnal (10 egység/testtömeg-kg i.p.) injektáljuk, és az injekció után 3 perccel feláldozzuk. A szöveteket összegyűjtöttük és lefagyasztottuk. A foszfoinozidid-3-OH kináz (PI3K) aktivitását fehér zsírszövetből (WAT), vázizomból és májlizátumból származó foszfotirozin immunprecipitátumokban (p-Tyr, Ab-4; EMD Biosciences, San Diego, Kalifornia) mértük, a korábban leírtak szerint. (16).

Intraperitoneális leptin beadása.

Az egereket két csoportra osztottuk, és naponta egyszer kezeltük azonos térfogatú intraperitoneálisan injektált sóoldattal vagy egér leptinnel (R&D Systems, Minneapolis, MN), sóoldatban oldva 5 μg/testtömeg-dózisban, 6 napig. A táplálékfelvételt és a testtömeg változását mértük, hogy megbecsüljük az exogén leptin beadásának hatásait.

Valós idejű kvantitatív RT-PCR.

TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával az egér WAT-ját, a vázizmokat és a vad típusú és AR -/y májokat boncoltuk, és az összes RNS-t izoláltuk. A cDNS-szintézist és a PCR-t Superscript RNase H - reverz transzkriptáz és cDNS ciklus készlet (Invitrogen) alkalmazásával hajtottuk végre a gyártó utasításainak megfelelően. A valós idejű PCR-t iCycler valós idejű PCR-erősítő (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) alkalmazásával hajtottuk végre. Minden PCR 1 μl cDNS-t, 50 μmol/l primereket és 12,5 μl iQ SYBR Green Supermix reagenst (Bio-Rad Laboratories) tartalmazott, és háromszorosítottuk, és 18-at használtunk belső kontrollként. A valós idejű PCR primer szekvenciáinak felsorolása az 1. táblázatban található.

Dihidrotesztoszteron-helyettesítő vizsgálat.

60 napos időtartamú felszabadulású 5α-dihidrotesztoszteront (5 mg) vagy placebo pelletet (Innovative Research of America, Sarasota, FL) behelyeztünk hím vad típusú és AR -/y egerek szubkután zsebébe (hátsó nyaki régióba), illetőleg. A pellet beültetése után 8 héttel az egereket leöltük, hogy tanulmányozzuk a szérum hormonokat és az anyagcsere paramétereket.

statisztikai elemzések.

Az inzulinrezisztencia kialakulása AR -/y egerekben.

Figyelembe véve a WAT-ban a lipidfelesleg feleslegét, megvizsgáltuk a vércukor- és inzulinszinteket vad vad, nőstény vad típusú és AR -/y egerekben. Az AR -/y egereknél a vércukorszint emelkedése a 20. héten kezdődik (3. táblázat), amely legalább 35 hétig fennmaradt mind éhezési, mind táplálási körülmények között (2. táblázat). A hiperglikémia az éhomi (~ 60%) és a táplált (~ 67%) állapotban a szérum inzulinszintjének jelentős növekedése ellenére következett be, jelezve, hogy az AR -/y egerek környezeti körülmények között jobban ellenálltak az inzulinnak, mint a vad típusú társaik ( 2. táblázat).

Az egész test glükóz homeosztázisának értékeléséhez legközelebb orális bolus GTT-ket és intraperitoneális ITT-ket hajtottunk végre ezeken az egereken. Az orális bolus GTT-k markáns glükóz-intoleranciát és megkülönböztethető területet mutattak a görbe alatt AR -/y egerekben (2A. És B. Ábra). Az AR -/y egerek vércukorszintje a vizsgálat során mindig nagyobb volt, és a hiperglikémia 2 órával a glükóz bolus után is nyilvánvaló volt. Az ITT-k azt mutatták, hogy az AR -/y egerek kissé rezisztensek és rendkívül ellenállóak az exogén inzulin hipoglikémiás hatásával szemben 25, illetve 35 hetes korban (2C. És D ábra). Az egész test inzulinérzékenységének hibáját nem nőstény fenotípus okozta AR -/y egerekben, mivel nem találtunk különbséget hím és nőstény vad típusú egerek válaszmintáiban.

Mivel az inzulinrezisztencia korrelálhat a PI3K aktivitásával, amely az inzulin számos metabolikus hatásához szükséges jelátviteli közvetítő, az inzulin által stimulált PI3K aktivitást vad típusú egerekkel kontrollként vizsgáltuk. Az AR -/y egerek inzulinstimulációjának PI3K aktivitása 60-63% -kal csökkent az inzulin célszervekben, például a vázizomban és a májban (2E. Ábra), ami arra utal, hogy az AR -/y egereknél volt vázizom és máj inzulin rezisztencia és hiperinzulinémia elhízással.

Fokozott lipidlerakódás és leptinszint az AR -/y egerekben.

A szérum szabad zsírsavszintek éhomi állapotban megemelkedtek az AR -/y egerekben (2. táblázat). Ezenkívül a vázizomzat és a máj trigliceridtartalma jelentősen, 2,6-, illetve 1,9-szeresére nőtt, ami azt jelzi, hogy az inzulinrezisztencia a triglicerid fokozódó lerakódásával jár együtt a vázizomban és a májban (2F. Ábra). Amint a megnövekedett WAT-tömegtől elvárható, az etetett szérum leptin-koncentráció magasabb volt az AR -/y egerekben mind 25, mind 35 hetes korban (3A. Ábra). Ezenkívül a szérum leptinszintek magasabb lineáris összefüggést mutatnak a testtömeggel az AR -/y egerekben a vad típusú alomtársakkal összehasonlítva (3B. Ábra). Meglepő módon az etetett szérum leptinszintek is magasabbak voltak, annak ellenére, hogy az AR -/y egerek 20 hetes koruk előtt szignifikánsan kevesebb súlyt kaptak (3A. Ábra), ami azt jelzi, hogy az AR elvesztése korábban megnövekedett leptint okozhat, mint a megnövekedett testtömeg. Az adiponektin, egy inzulin-szenzibilizáló adipokin csökkent az AR -/y egerekben (3C. Ábra), míg a TNF-α szintekben nem volt különbség (3D. Ábra).

Leptinrezisztencia kialakulása AR -/y egerekben.

Azt is megállapítottuk, hogy a táplálékbevitel és a testtömeg jelentősen csökkent a vad típusú egerek exogén beadása után a leptin után, az AR -/y egereknél azonban nem (4A. És B. Ábra). Továbbá, a táplálékbevitel nem különbözött szignifikánsan az AR -/y egerekben, mint a vad típusú egerek az exogén leptin beadása előtt, annak ellenére, hogy az AR -/y egerek 35 hetes korban leptinrezisztensek voltak. Ugyanakkor a táplálékfelvétel és a testtömeg csökkent egy exogén leptinterhelés után mind a 20 hetes AR -/y egerekben, mind a vad típusú egerekben, míg két kontrollcsoport testtömege és zsírtartalma hasonló volt (4C. És D. Ábra) . Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az AR -/y egerek leptinrezisztenciát fejlesztenek ki, amelyet az adipozitás kialakulása és az AR hosszú távú hiánya okozhat.

Az AR elvesztése megváltoztatta a lipid metabolikus profilját.

A WAT-ban megnövekedett lipid-lerakódás mechanizmusának, valamint a vázizomzat és a máj triglicerid-felhalmozódásának meghatározásához az ezen szövetekből származó mRNS-t tovább elemeztük. Négy lipid metabolizmus gén, peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor (PPAR) -γ (PPARγ), CCAAT/enhancer-kötő protein-α (C/EBPα), adipocita zsírsavat kötő fehérje/adipocita P2 (aP2) mRNS-szintje, és a szterin szabályozó elemet megkötő 1c fehérje (SREBP1c) magasabb volt az AR -/y WAT-ban a vad típusú egerekhez képest (4. táblázat), ami arra utal, hogy az AR elvesztése többféle stimuláció révén hozzájárulhat az adipogenezis és a lipogenezis növekedéséhez. gének. Ezenkívül, összhangban a triglicerid akkumulációval, az AR elvesztése csökkentette a PPAR-α (PPARα) mRNS szintjét a vázizomban és a májban (4. táblázat). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az AR közvetlenül vagy közvetve részt vesz a lipid anyagcserében.

A dihidrotesztoszteron-pótlás nem fordította meg a metabolikus rendellenességeket és az inzulinrezisztenciát az AR -/y egerekben.

Mivel az AR -/y egerekben az atrófiás herék következtében a szérum tesztoszteronszint jelentősen csökkent, nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy az AR -/y egerek inzulinrezisztenciája és anyagcserezavarai egyszerűen az alacsony androgénszintet tükrözzék. Ennek a kérdésnek a kezelésére mind a 26, mind a 12 hetes AR -/y és a vad típusú alomtársaknak nem aromatizálható androgént, dihidrotesztoszteront adtak. 8 hetes pellet beültetés után számos szérumhormont és metabolikus paramétert értékeltek. A dihidrotesztoszteron-pótlás helyreállította a szérum dihidrotesztoszteron szintjét a fiziológiai tartományba (0,6–0,9 ng/ml) az AR -/y egerekben. Ismeretes, hogy az ösztradiol nemcsak ösztronból, hanem tesztoszteronból is átalakul; ezért nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy az AR -/y egerek rendellenességei egyszerűen kevesebb tesztoszteronból átalakult ösztrogént tükröznek, bár azt találtuk, hogy a szérum ösztradiol szintje, valamint a prohormon androsztenedion szintje változatlan maradt az AR -/y egerekben vad típusú egerekhez képest (3. és 5. táblázat). A dihidrotesztoszteron-pótlás nem tudta megfordítani a metabolikus rendellenességeket és az inzulinrezisztenciát az AR -/y egerekben egyik korcsoportban sem (3. és 5. táblázat), ami arra utal, hogy az AR által közvetlenül közvetített androgén hatások jelentősek az inzulinérzékenységben.

VITA

A keresztmetszeti epidemiológiai vizsgálatok közvetlen összefüggést mutattak a szérum tesztoszteron koncentrációja és az inzulinérzékenység között (19). Az alacsony tesztoszteronszint a férfiak 2-es típusú cukorbetegségének megnövekedett kockázatával jár (20,21). Mivel a legtöbb androgénnek kötődnie kell az AR-hoz, hogy androgén biológiai funkcióit kiváltsa, úgy gondolták, hogy az AR az inzulinérzékenység modulátoraként működik. Jelenlegi eredményeink azt mutatják, hogy az AR hiányos egereknél magas életkorban inzulin- és leptinrezisztencia alakul ki. Az elhízás késői megjelenése, amint azt AR -/y egereknél megfigyeltük, összefüggésbe hozható az inzulinrezisztenciával (22). Az AR -/y egerek markáns hiperinsulinémiája és hiperglikémiája egyértelműen bizonyítja, hogy az AR elvesztése csökkentheti az inzulinérzékenységet. A testtömeg viszonylag kicsi növekedése (~ 15%) összefügg az inzulinérzékenység figyelemre méltó csökkenésével (~ 65%) AR -/y egereknél és az inzulinrezisztenciával, amely már 20 hetes korban jelentkezik nonobese AR esetében -/egerek, ami arra utal, hogy az AR elvesztése közvetlenül csökkentheti az inzulinérzékenységet a célszövetekben anélkül, hogy először jelentősen megnövelné a testtömeget.

Az AR -/y egerek fenotipikusan nőstény megjelenése hasonló a Tfm (herefeminizált) egerekhez, amelyekben AR funkcionálisan hiányos azáltal, hogy a Tfm mutációt beviszik az AR génbe (23). Ezért összehasonlítás céljából nőstény vad típusú egereket adtunk hozzá, és ezek az egerek kisebbek és kevésbé zsírosak, mint a hím vad típusú és az AR -/y egerek. Ezenkívül nem találtunk szignifikánsan megkülönböztethető anyagcsere mintát a nőstény és hím vad típusú egerek között, míg az AR -/y egerek súlyos inzulinrezisztenciát és elhízást mutattak. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a db/db Tfm/Y hímeknél súlyos cukorbetegség alakul ki. Ezzel szemben a női db/db alomtársak csak enyhe hiperglikémiát mutatnak (24).

Érdekes, hogy az AR elvesztésével együtt, amelynek eredményeként metabolikus szindrómát mutattunk ki, mind az ösztrogén receptor-α (48), mind az aromatáz hiány, amely az ösztrogén szintetizáló képességének elvesztését okozza (49), metabolikus szindrómákat eredményez. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy mind az androgén, mind az ösztrogén reagálóképességének elvesztése megzavarja az energia homeosztázisát.

Összefoglalva, az AR -/y egerek in vivo modellt nyújtanak, amely azt mutatja, hogy az AR elvesztése növeli a szérum leptin koncentrációját és a vázizom/máj triglicerid tartalmát, ami elhízás, leptin rezisztencia és inzulinrezisztencia kialakulását eredményezheti. Mivel az elhízás és a progresszív inzulinrezisztencia 2-es típusú cukorbetegséghez és a szív- és érrendszeri betegségek fokozott kockázatához vezethet (50), az érintett molekuláris mechanizmusok jobb megismerése, valamint az androgén-AR inzulin- és leptinrezisztenciában betöltött szerepének felismerése segíthet a fejlődésben. a jobb típusú terápiás megközelítések a 2-es típusú cukorbetegség, az elhízás és a szív- és érrendszeri betegségek terén.