A zsírtartalmú étrend által kiváltott atrófiás gyomorhurut esetén egereknél a leptin receptor jelátvitel szükséges

Kyoko Inagaki-Ohara

Kutatóintézet, Nemzeti Globális Egészségügyi és Orvostudományi Központ (NCGM), 1-21-1, Toyama Shinjuku, Tokió, 162-0052 Japán

Endokrinológiai és Metabolizmus Osztály, Fejlesztési Élettani Tanszék, Országos Fiziológiai Tudományok Intézete (NIPS), 38 Nishigonaka Myodaiji, Okazaki, Aichi 444-8585 Japán

A fogadó védelem osztálya, Hirosimai prefektúra Egyetem, Élettudományi Tanszék, Élettudományi Kar, 562 Nanatsuka, Shobara, Hirosima 727-0023 Japán

Shiki Okamoto

Endokrinológiai és Metabolizmus Osztály, Fejlesztési Élettani Tanszék, Országos Fiziológiai Tudományok Intézete (NIPS), 38 Nishigonaka Myodaiji, Okazaki, Aichi 444-8585 Japán

Kazuyo Takagi

Endokrinológiai és Metabolizmus Osztály, Fejlesztési Élettani Tanszék, Országos Fiziológiai Tudományok Intézete (NIPS), 38 Nishigonaka Myodaiji, Okazaki, Aichi 444-8585 Japán

Kumiko Saito

Endokrinológiai és Metabolizmus osztály, Fejlesztési Élettani Tanszék, Országos Fiziológiai Tudományok Intézete (NIPS), 38 Nishigonaka Myodaiji, Okazaki, Aichi 444-8585 Japán

Seiya Arita

A fogadó védelem osztálya, Hirosimai prefektúra Egyetem Élettudományi Tanszék Élettudományi Tanszék, 562 Nanatsuka, Shobara, Hirosima 727-0023 Japán

Lijun Tang

Endokrinológiai és Metabolizmus Osztály, Fejlesztési Élettani Tanszék, Országos Fiziológiai Tudományok Intézete (NIPS), 38 Nishigonaka Myodaiji, Okazaki, Aichi 444-8585 Japán

Tetsuji Hori

Yakult Központi Mikrobiológiai Kutatóintézet, Izumi 5-11, Kunitachi, Tokió, 186-8650 Japán

Hiroaki Kataoka

Miyazaki Egyetem Orvostudományi Karának Onkopatológiai és Regeneratív Biológiai Szakosztálya, 5200 Kihara, Kiyotake, Miyazaki, 889-1692 Japán

Satoshi Matsumoto

Yakult Központi Mikrobiológiai Kutatóintézet, Izumi 5-11, Kunitachi, Tokió, 186-8650 Japán

Yasuhiko Minokoshi

Endokrinológiai és Metabolizmus Osztály, Fejlesztési Élettani Tanszék, Országos Fiziológiai Tudományok Intézete (NIPS), 38 Nishigonaka Myodaiji, Okazaki, Aichi 444-8585 Japán

Absztrakt

Háttér

Az elhízás növeli a rosszindulatú daganatok kockázatát a különböző szövetekben, beleértve a gyomrot is. A rákmegelőző elváltozásokkal járó atrófiás gasztritisz elhízással összefüggő betegség; az elhízással összefüggő atrófiás gastritis kialakulásának hátterében álló mechanizmusok azonban nem ismertek. A leptin a gyomorból, valamint a zsírszövetből származó hormon, a gyomor leptin pedig részt vesz a gyomorrák kialakulásában. A jelenlegi tanulmány célja a leptin receptor szignalizáció részvételének vizsgálata az atrófiás gastritis kialakulásában az étrend okozta elhízás során.

Mód

A hím C57BL/6, ob/ob és db/db egereket magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) vagy kontroll diétával (CD) táplálták 1 hét és 5 hónap között. Ezekben az egerekben értékelték a gyomornyálkahártya patológiás változásait és az atrófiás gyomorhuruthoz kapcsolódó molekulák expresszióját.

Eredmények

A HFD-táplálás gyomor nyálkahártya hiperpláziát váltott ki, fokozott gyomor leptin expresszióval. A nyálkahártya hiperpláziát a Ki67-pozitív proliferáló sejtek nagyobb gyakorisága és a gyomormirigyek sorvadása kísérte gyulladás jelenlétében, amely a HFD-etetés után fokozódott. Az 1 hétig a HFD-vel táplált egerek gyomornyálkahártyájában kimutatták az ObR szignálhoz kapcsolódó molekulák, például az ObR, a STAT3, az Akt és az ERK aktiválódását. A gyomornyálkahártya atrófiájához kapcsolódó morfológiai változások, valamint a Muc2 és Cdx2 expressziója hasonlít az emberi bél metapláziájához. A vad típusú egerekkel ellentétben a leptinhiányos ob/ob egerek és a leptinreceptorral mutált db/db egerek nem mutattak megnövekedett Cdx2 expressziót a HFD etetésére válaszul.

Következtetés

Ezek az eredmények együtt azt sugallják, hogy az elhízáshoz társuló atrófiás gastritis kialakulásához a leptin jelátviteli útjának aktiválása szükséges a gyomorban.

Elektronikus kiegészítő anyag

A cikk online verziója (doi: 10.1186/s12986-016-0066-1) kiegészítő anyagot tartalmaz, amely az engedélyezett felhasználók számára elérhető.

Háttér

A gyomor-karcinóma (GC) általában atrófiás gyomorhurut, bélmetaplazia és a gyomornyálkahártya diszpláziájának hátterében keletkezik, és világszerte a rákhoz kapcsolódó halálozások második vezető oka [1]. Az elhízás növeli a gasztritisz [2, 3], az atrófiás gasztritisz [4–6] és a gyomor-kardia adenokarcinóma [7–9] nagyobb előfordulásának kockázatát. Az embert megfertőző és a gyomrot kolonizáló baktérium, a Helicobacter pylori fertőzés az elsődleges oka a gyomor nyálkahártyáján lévő rák előtti elváltozásoknak [10]. Bár a H. pylori-fertőzés nem korlátozódik a kórosan elhízott betegekre, az elhízás növeli a krónikus gyomorhurut és a GC prevalenciáját [2]. Ezenkívül az elhízás nemcsak bizonyos daganatok kockázati tényezője, hanem a megnövekedett halálozási arányhoz is kapcsolódik [11]. Így az elhízás potenciálisan befolyásolja a gasztritisz gyomor tumorigenesisé fejlődését. Ezért elengedhetetlen az elhízáshoz és a rák előtti elváltozásokhoz társuló jelző molekulák azonosítása a nagy kockázatú egyének kezelésében.

Mód

Állatok és diéták

A hím C57BL/6J (vad típusú: WT), ob/ob és db/db egereket (CLEA Japan, Tokió, Japán) 7 hetes korban vizsgálták. Az állatokat egyenként műanyag ketrecekben helyeztük el 24 ° C ± 1 ° C hőmérsékleten, 0600 és 1800 óra közötti világítással. Az egereket vagy kontroll-étrenddel (CD, zsírból származó kalória 10% -a, D12450J) vagy magas zsírtartalmú étrendet (HFD, zsírból származó kalória 60% -a, D12492) kaptuk (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ ) és a víz ad libitum. Az Országos Fiziológiai Tudományok Intézetének állatkísérletekkel foglalkozó etikai bizottsága minden állatkísérletet jóváhagyott.

A gyomor nyálkahártyájának hisztopatológiai elemzése

A HFD- és CD-vel táplált egerekből 10% -os formalinnal fixált szövetek paraffinba ágyazott gyomorszelvényeit nyertük, és hematoxilinnel és eozinnal (H&E) festettük, és megvizsgáltuk a gyomor nyálkahártyájának változásait. A gyomor nyálkahártya-változásainak értékelése a hiperplázia (0, nem lényegi változás; 1, alacsony; 2, mérsékelt; 3, magas), a sejtek beszivárgása (0, nem lényegi változás; 1, alacsony, 2, mérsékelt, 3, magas), a gyomor mirigysejtjeinek elvesztése (0, nem lényeges változás; 4, alacsony; 5, mérsékelt; 6, magas), Alcian blue festés (0, nem lényegi változás; 4, fokális; 5, diffúz; 6, nagyon erős diffúz) és dysplasia (0, nem lényeges változás; 7, alacsony). Mindegyik kritériumot két egyén egymástól függetlenül vak pontozással értékelte, korábban meghatározott kritériumok alkalmazásával [19].

Intragasztrikus pH-mérések

A gyomor pH-ját publikált módszerrel mértük [21]. Röviden, az egereket szén-dioxid inhalációval végzett altatás után feláldoztuk. A gyomor eltávolítását követően a gyomor lumenét eltávolítottuk és 0,5 ml sóoldattal (150 mM, pH 7,0) mostuk, és az összegyűjtött gyomor folyadék pH-ját pH-mérővel (Mettler, Toledo, OH) mértük.

Immunhisztokémiai elemzés

Western blot elemzés

A gyomor hámsejtjeit elkülönítettük és egy korábban publikált módszer módosításával készítettük [22]. A gyomor boncolt kis szegmenseit szobahőmérsékleten 10 percig kevertük 1 mM DTT-t tartalmazó Hank kiegyensúlyozott sóoldatában (HBSS) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). A felülúszó eltávolítása után a szöveteket 37 ° C-on 10 percig keverjük 10 mM EDTA-t tartalmazó HBSS-ben. A felülúszó eltávolítása után a szövetszuszpenziót nejlonhálón vezetjük át a törmelék eltávolítása céljából, és 25/40% -os szakaszos Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gradiensen át centrifugáljuk 600 × g hőmérsékleten 20 ° C-on 20 percig. min. A 25/40% határfelületről gyűjtött sejtek a hámsejtek voltak. Lizátumokat állítottunk elő szövetekből és sejtekből, és Western-blot-analízissel elemeztük egy korábban publikált módszer szerint [23]. A Western blotolásnál használt Abs-t az 1. kiegészítő fájl foglalja össze: S1. Táblázat.

Lézerrel befogható mikrodisszekció

A fent leírt paraffinba ágyazott gyomorszöveteket 6 μm vastag szakaszokra vágtuk és membrán tárgylemezekre szereltük (MembraneSlide 1.0 PEN, Carl Zeiss Microscopy, LLC, Thornwood, NY). A paraffint a metszetek xilollal történő öblítésével távolítottuk el, majd a metszeteket 100-70% etanolos fürdők sorozatába merítettük és levegőn szárítottuk. A gyomorhám nyálkahártya metszeteit levágtuk és az AdhesiveCaps-ra (PALM, Microlaser Technologies, Bernried, Németország) gyűjtöttük egy lézer-befogó mikrodisszekciós (LMD) rendszerrel (PALM MB-III, Microlaser Technologies).

Kvantitatív reverz transzkripció-polimeráz láncreakció (qRT-PCR)

Az LMD mintákból és az egér gyomornyálkahártyájából származó teljes RNS-t AllPrep FFPE DNS/RNS és RNeasy Mini készletek (Qiagen, Valencia, CA) felhasználásával extraháltuk a gyártó protokolljainak megfelelően. A cDNS-t szintetizálták kb. 100–200 ng LMD metszetekből vagy 1-2 μg RNS gyomornyálkahártya sejtekből a ReverTra Ace® qPCR RT Kit (TOYOBO, Co., Ltd., Osaka, Japán) segítségével a gyártó protokollja szerint. . A qRT-PCR-t a Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, CA) felhasználásával végeztük specifikus alapozó készletekkel (400 nM a végső koncentrációnál, 2. kiegészítő fájl: S2 táblázat) a gyártók protokollja szerint. A génexpresszió relatív változásait ΔΔCt módszerrel számoltuk, és a normalizáláshoz a 18S rRNS gént használtuk.

Az immunhisztokémiai festés kvantitatív elemzése

A mikroszkópos mérésekhez a leptinnel festett gyomornyálkahártya-mintákat mikroszkóppal (Olympus) fényképeztük, és kvantitatív elemzést végeztünk ImageJ szoftver segítségével (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). A nyálkahártya magasságát a gyomormirigyek töve és a nyaki zóna között mértük.

Plazma assay

A szérumot érzéstelenítéssel kardiocentézissel nyert vérből gyűjtötték és -80 ° C-on tárolták. Inzulin (egér inzulin ELISA készlet, Shibayagi, Gunma, Japán), leptin (Leptin ELISA, Millipore, St. Charles, MO), glükóz (glükóz CII-teszt, Wako, Osaka, Japán) és nem észterezett zsírsav (NEFA ) (NEFA C-teszt, Wako) a szérum szintjét a gyártó protokolljai szerint mértük.

Statisztikai analízis

A szignifikáns különbségek meghatározásához a Mann – Whitney U tesztet és a Kruskal-Wallis tesztet használtuk. A 0,05 alatti p-értéket szignifikánsnak tekintették. A statisztikai elemzéseket a Prism szoftver 6-os verziójával végeztük (GraphPad, San Diego, CA, USA).

Eredmények

A HFD-vel táplált egereknél atrófiás gastritis alakul ki

A gyomornyálkahártya patológiás változásai a HFD-táplálás következtében. a CD (n = 10) vagy HFD (n = 10) táplált C57BL/6 J egerek testtömegének növekedése 20 hét alatt. b A gyomor cardia és az antrum reprezentatív H & E szakaszai CD-vel vagy HFD-vel etetett egerekből 1, 3 és 12 hétig. c A gyomor antrumának nagyított képe CD-vel és HFD-vel táplált egerekben az 1b. Ábrán az etetés után 12 héttel (nagyítás, × 400). Megfigyelték a sejtmagot, a mag hipertrófiáját, a diszpolaritást és az álstratifikációt. d 1. és 3. héten HFD-vel táplált egerek gyomornyálkahártyájának CD45 festése. e Ki67-festés CD-vel vagy HFD-vel táplált egerek gyomornyálkahártyájában 3 hétig. Minden elemzéshez 5–10 egeret használtunk, és reprezentatív adatokat mutatunk be

Késleltetett proinflammatorikus citokinek indukciója a gyomor nyálkahártyájában HFD-etetés után. a A leptin, az Il6 és az Il11 génexpressziója a CD- és HFD-vel táplált egerek gyomornyálkahártyájában 1, 3 és 12 hét elteltével. Az értékek 4 egér átlag ± SD értékét jelentik. Az eredményeket Kruskal-Wallis teszttel elemeztük. * p 7a). A nyálkahártya magasságának elemzése összhangban volt a szövettani eredményekkel (7c. Ábra). Ezenkívül az immunhisztokémiai elemzés a Cdx2 és a leptin fokozott kolokalizációját mutatta ki a HFD-t 1 hétig tápláló WT egerek gyomornyálkahártyájában (8a. Ábra), míg a db/db egerek nem mutattak Cdx2 expressziót a leptin-pozitív sejtekben. Ezzel szemben az ob/ob egereknél kevés Cdx2 volt, és nem volt leptin expresszió. Hasonlóképpen, a foszforilezett ObRb és Cdx2 ko-lokalizációját detektáltuk HFD-vel táplált WT egerekben, de nem HFD-vel táplált ob/ob vagy db/db egerekben, amelyek csak némi ObRb vagy Cdx2 foszforilációját mutatták. A CD-vel táplált ob/ob és db/db egerek a testtömeg drasztikus növekedését mutatták, de a gyomornyálkahártyában csak enyhe hiperpláziát mutattak a WT egerekhez képest a 3. héten (7b. És 7c. Ábra). 7c. Annak ellenére, hogy nagyobb a testtömege, az ob/ob és a db/db egerek, amelyek 3 hétig táplálták a HFD-t, kevésbé mutattak hiperpláziát, mint a WT egerek, akik 20 hétig táplálták a HFD-t. 20 hetes HFD-etetés után a WT egerek szabálytalan és összeolvadt szerkezettel rendelkeztek a szívben (7b. Ábra). A HFD-etetés nem növelte a Cdx2 és Muc2 expresszióját ob/ob és db/db egerek gyomornyálkahártyájában (8b. Ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a gyomorban lévő leptin jelátvitel fontos tényező, amely metaplasztikus patológiához vezet az elhízással kapcsolatos gastritisben.

A gyomor morfológiájának elnyomott változása HFD-vel táplált egerekben, amelyekben nincs leptin szignál. A gyomornyálkahártya reprezentatív H & E szakaszai WT, ob/ob és db/db egerekből CD-vel vagy HFD-vel táplálták 1 (a) és 3 hét (b). A képeken szereplő minden érték azt az egér testtömegét jelzi, amelyből a gyomornyálkahártyát nyerték, és amelyet H & E-folttal festettek. c A nyálkahártya magasságának mérése a WT, ob/ob és db/db egerek gyomor fundusában az 1. és 3. héten, a WT egerek pedig az etetés után 20 héttel. Az értékek 4 egér átlag ± SD értékét jelentik. Az eredményeket Kruskal-Wallis teszttel elemeztük. * p 5a), és a gyomor hiperpláziája kevésbé progrediál, annak ellenére, hogy ezek az egerek elhízottabbak, mint a HFD-vel táplált WT egerek (7. ábra). Ezenkívül az ob/ob és a db/db egereknél spontán nem alakul ki gyomortumor, bár ezek az egerek rendkívüli elhízást mutatnak. Vizsgálatunk eredményei és az előző jelentések eredményei együttesen azt sugallják, hogy a leptin szignalizáció kritikusan részt vesz a hám fejlődésének szabályozásában számos szövetben. Bár a leptin expressziójának és a gyomorban történő jelzésének jelentősége továbbra is bizonytalan, figyelembe véve a leptin és az ObRb gyomorban való konstitutív expresszióját [45, 46], a leptinre szükség lehet a gyomornyálkahártya homeosztázisának fenntartásához.

Összefoglalva, bemutattuk az atrófiás gyomorhurut kialakulását az étrend által kiváltott elhízás egérmodelljének felhasználásával, fokozott leptin-ObRb jelátviteli útvonallal. A leptin-ObR jelátviteli út expressziója és egyedi lokalizációja túlnyomórészt szerepet játszik a humán GC korai szakaszában betöltött szerepben. A tanulmány jelentősége abban rejlik, hogy a leptin és az ObR biomarkerként vagy új terápiás célpontként használható az atrófiás gyomorhurut diagnosztizálásában és kezelésében.

Következtetés

Ebben a tanulmányban azt mutatjuk be, hogy az étrend által kiváltott elhízott WT egerek túlzottan expresszálják a leptint és aktiválják a leptin receptor jelátvitelt a gyomor nyálkahártyájában, ami atrófiás gyomorhuruthoz vezet a gyomornyálkahártya bél metaplaziajával. Ezek a kóros tulajdonságok kevésbé súlyosak az ob/ob és a db/db egereknél, amelyeknél nincs leptin receptor jelátvitel, mint a WT egereknél. Ezért a gyomorban lévő leptin receptor szignalizáció kritikus ellenőrzési pont a gyomor neoplazia kialakulásához, és a gyomor leptin receptor szignalizációt célzó megelőző terápiákat lehet fejleszteni a GC ellen.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Japán Oktatási, Kulturális, Sport-, Tudományos és Technológiai Minisztérium tudományos kutatási támogatásai (C) támogatták (23590272 és 26461391), valamint egy PUH kutatási ösztöndíjprogram (A) (Hiroshima prefekturális egyetem) ) K. IO-nak ítélték. Köszönetet mondunk Takao Shimizu professzornak, Masashi Mizokami (NCGM) professzornak, Dr. Masanobu Nanno (Yakult Honsha Co. Ltd.) és Masao Mitsuyama professzornak (Kiotói Egyetem) folyamatos bátorításukért és támogatásukért.

Rövidítések

CD	Kontroll étrend
DTT	Ditiotreitol
EDTA	Etilén-diamin-tetraecetsav
ELISA	Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat
GC	Gyomor karcinóma
HFD	Magas zsírtartalmú étrend
LMD	Lézerrel befogható mikrodisszekció
NEFA	Nem észterezett zsírsav
WT	Vad típus

További fájlok

Antitestek listája: Western-blotoláshoz és immunhisztokémiához használt antitestek. (DOCX 127 kb)

A kvantitatív PCR-hez használt primerek. (DOCX 100 kb)

Az elhízással járó index megváltozása. A testsúlyt (A), az inzulint, a leptint, a glükózt és a NEFA-t a szérumokban (B) CD- és HFD-vel táplált WT, ob/ob és db/db egerekben mértük az etetés után 1 héttel. Az eredményeket Kruskal Wallis teszttel elemeztük. * o

Lábjegyzetek

Versenyző érdekek

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő érdekeik.

A szerzők hozzájárulása

A K I-O megtervezte és megtervezte a projektet, elvégezte a kísérleteket és megírta a kéziratot. KT, LT, KS és SA segítették az állatgondozási és plazma vizsgálati kísérleteket, TH és SM felállították az LMD-t. SO és YM elemezte az adatokat és konstruktív vitát folytatott. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.