Hyperleptinemia szükséges a leptin rezisztencia kialakulásához

Hovatartozás Howard Hughes Orvosi Intézet, Molekuláris Genetikai Laboratórium, The Rockefeller Egyetem, New York, New York, Amerikai Egyesült Államok

Zachary A. lovag,
K. Schot Hannan,
Matthew L. Greenberg,
Jeffrey M. Friedman

Ábrák

Absztrakt

A leptin úgy szabályozza a testtömeget, hogy jelzi az agynak a zsírként tárolt energia rendelkezésre állását. Ez a negatív visszacsatolási hurok a legtöbb elhízott egyénnél megszakad, ami leptinrezisztencia néven ismert állapotot eredményez. A leptin-rezisztencia fiziológiai okai továbbra sem ismeretesek. Itt teszteljük azt a hipotézist, miszerint a hiperleptinémia szükséges a leptinrezisztencia kialakulásához az étrend okozta elhízott egerekben. Megmutatjuk, hogy azoknál az egereknél, akiknek plazma leptinjét sovány szintre szorították, elhízás alakult ki a magas zsírtartalmú étrendre reagálva, és ennek az elhízásnak a nagysága nem különböztethető meg a vad típusú kontrollaktól. Ezek az elhízott állatok, akiknek állandóan alacsony a plazma leptinszintje, továbbra is nagyon érzékenyek az exogén leptinre, még akkor is, ha tartósan magas zsírtartalmú étrendnek vannak kitéve. Ez azt mutatja, hogy az étkezési zsírok önmagukban nem elegendők a leptinre adott válasz blokkolásához. Az adatok arra is utalnak, hogy a hiperleptinémia maga is hozzájárulhat a leptinrezisztenciához azáltal, hogy csökkenti a leptinre adott sejtes választ, amint más hormonok esetében is kimutatták.

Idézet: Knight ZA, Hannan KS, Greenberg ML, Friedman JM (2010) Hyperleptinemia szükséges a leptin rezisztencia kialakulásához. PLoS ONE 5 (6): e11376. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011376

Szerkesztő: Stadler Krisztian, Louisiana State University, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2010. március 30 .; Elfogadott: 2010. június 7 .; Közzétett: 2010. június 29

Finanszírozás: Ezt a munkát az NIH DK083531 (Z.A.K.) és DK041096 (J.M.F.) pályázatok támogatták. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az emlősök testtömegét egy fiziológiai rendszer szabályozza, amely hosszú távon egyensúlyban tartja az energiafogyasztást és a ráfordítást [1]. Ennek a rendszernek a testzsír rendelkezésre állását jelző alapkomponens a leptin hormon [2]. A leptint az adipociták méretük és számuk arányában választják el úgy, hogy a leptin koncentrációja a vérben arányos legyen a zsírszövet teljes mennyiségével [3], [4]. A leptin megkötése a célneuronokhoz, amelyek a hipotalamuszban, az agytörzsben és más agyi régiókban expresszálódnak, gátolja az etetést és serkenti az energiafelhasználást. A leptin tehát afferens jelként működik egy negatív visszacsatolási ciklusban, amely fenntartja a testzsír-tartalékok stabil szintjét.

A leptinhiányos egerek (ob/ob) és az emberek elhízottak és hiperfágikusak [5], és ezeknél az egyéneknél a leptinpótló terápia drámai súlycsökkenést vált ki [6], [7], [8], [9]. Az elhízás nagy része azonban a plazma leptinszintjének emelkedésével jár [3], [4], ami a leptin súlycsökkentő hatásaival szembeni rezisztenciát jelenti [10]. A leptin rezisztencia elhízáshoz való hozzájárulását annak a demonstrációval is igazolták, hogy a hiperleptinémiás állatok és emberek tompán reagálnak az exogén leptinre. Annak ellenére, hogy fontos meghatározni a leptin-rezisztencia okait, a felelős sejtes és molekuláris mechanizmusok továbbra sem ismeretesek.

A diéta okozta elhízott egér jól jellemzett rendszer a heptin rezisztencia kialakulásának és az elhízás patogenezisének tanulmányozására. Ebben a modellben a C57Bl/6J egerek, amelyek magas zsírtartalmú étrendet fogyasztottak (45–60% kalória a zsírból), fokozatosan elhíznak és hiperleptinémiásak lesznek 4–6 hónapon keresztül. Mivel ezek az állatok elhíznak, elveszítik a táplálékfelvétel és a testsúly csökkentésének képességét a leptin kezelés hatására. Az elhízás korai szakaszában az egerek ellenállást fejtenek ki a periférián, de nem központilag szállított leptinnel szemben; ennek tulajdonítható a leptint a vér-agy gáton át szállító transzportrendszer visszaszorításának vagy telítettségének tulajdonítható [11], [12]. Hosszú ideig tartó, magas zsírtartalmú étrend (> 20 hét) után az egerek rezisztenssé válnak a leptinnel szemben, még akkor is, ha az agyi kamrán keresztül közvetlenül az agyba kerülnek [10], [12], [13], [14]. Ezekben az állatokban az első rendű, leptinre reagáló idegsejtek nyilvánvalóan elvesztették azt a képességüket, hogy aktiválják a jelátviteli utakat a leptin receptor után.

Hogyan károsíthatja a magas zsírtartalmú étrend expozíciója ezen idegsejtek leptinérzékenységét? Két modellt javasoltak. Az első az, hogy a leptin rezisztenciát a megnövekedett plazma leptin szint okozza, ami a leptin receptor krónikus túlstimulációját és a negatív visszacsatolási utak aktiválódását eredményezi, amelyek blokkolják a további leptin jelátvitelt. Ezt a modellt támasztja alá az a tény, hogy a leptin stimulálja a SOCS-3, egy olyan fehérje expresszióját, amely közvetlenül gátolja a leptin jelátvitelt [15], [16], [17], és hogy a SOCS-3 ablációja az idegsejtekben fokozza a leptin érzékenységét és védi diéta okozta elhízás ellen [18], [19], [20]. Ezenkívül a STAT3 konstitutívan aktív formájának célzott expressziója, amely a leptin szignalizáció kulcsfontosságú közvetítője, elegendő ahhoz, hogy a leptin rezisztenciát kiváltsa a hipotalamuszban [21]. Ez a mechanizmus analóg az inzulinreceptorok szignalizációjának csökkenésével, amely a krónikus inzulinkezeléssel jár, és feltételezhető, hogy negatív visszacsatolási utak, például az IRS-1 szerin-foszforilációjának aktiválásából ered [22].

A leptinrezisztencia kialakulásának alternatív magyarázata, hogy a hiperleptinémia helyett maguk az étkezési zsírok a felelősek. A zsírok vagy közvetlenül blokkolhatják a leptin jelátvitelt, vagy aktiválhatják a sejtes folyamatokat, például az endoplazmatikus retikulum (ER) stresszt és gyulladást, amelyek károsítják a leptinre reagáló idegsejteket [23], [24], [25], [26], [27], [28 ]. Ezt a modellt támasztja alá az a tény, hogy a hipotalamuszban a zsíranyagcsere farmakológiai vagy genetikai modulációja kimutatták, hogy befolyásolja az energiaegyensúlyt és a leptin érzékenységet [26], [29], [30]. Sőt, a leptinrezisztencia köztudottan a legerősebben a hipotalamusz íves magjában fejlődik ki, amely az agy más régióihoz viszonyítva fokozottabb hozzáférést biztosít a keringő tápanyagokhoz [13]. Ezenkívül egyes [10], [31], de nem minden [32] kísérleti körülmények között megfigyelték, hogy a magas zsírtartalmú diétás zsírral táplált egerek nem fogyasztanak több kalóriát, mint az alacsony zsírtartalmú étrendet fogyasztók; ez azt jelenti, hogy az étkezési zsír helyett a megnövekedett energiafogyasztás lehet felelős a leptinrezisztenciáért ezekben az állatokban.

E két lehetőség megkülönböztetése érdekében elkülönítettük a hiperleptinémia és az étkezési zsír hozzájárulását a leptin-rezisztencia kialakulásához (1) ozmotikus infúziós szivattyúk segítségével az ob/ob egerek plazma leptinjét a sovány vad- típusú állatokat hosszú távon, majd (2) mérjük ezen állatok leptinérzékenységét, miután alacsony vagy magas zsírtartalmú étrendet tartanak.

Eredmények

A központi leptinrezisztencia kialakulása a C57Bl/6J egerekben 20 hétig magas zsírtartalmú étrendet igényel [10], [14]. Annak megállapítása érdekében, hogy a magas zsírtartalmú étrend milyen mértékben járulhat hozzá a magas zsírtartalmú étrendhez a leptinrezisztencia kialakulásához, kidolgoztunk egy kísérleti protokollt, amelyben az elválasztástól kezdve az ob/ob egerek plazma leptinszintjét a sovány vad szintjéhez lehet rögzíteni. típusú egerek (~ 5 ng/ml) erre az időtartamra (1a. ábra). Kiterjedt dózis-válasz vizsgálatokat hajtottunk végre, amelyek ozmotikus infúziós szivattyúkkal infúzióval adták a leptint ob/ob egerekbe, és megállapítottuk, hogy az ob/ob egerekben a vad típusú plazma leptinszintje körülbelül 5 ng/ml megközelíthető a leptin 150 ng/órás adagolásával. Ez az infúziós sebesség stabilan fennmaradhat hat hónapnál hosszabb ideig is, ha a pumpákat 28 naponta cserélik.

A. Plazma glükózkoncentráció az ad libitum táplált vad típusú és ob-norm egerekben, amelyeket magas zsírtartalmú étrenden (nyitott rudak) vagy alacsony zsírtartalmú étrenden (töltött rudak) tartottak. B. A vad típusú és ob-norm egerek plazma inzulin koncentrációja 18 és 26 hetes korban, amelyeket magas zsírtartalmú étrenden (nyitott rudak) vagy alacsony zsírtartalmú étrenden (töltött oszlopok) tartottak. C. A plazma glükózkoncentrációja a vad típusú (fekete) és az ob-norm (vörös) egerek glükózinjekciójára adott válaszként. A háromszögek az egereket alacsony zsírtartalmú étrenden, a négyzetek pedig az egereket jelzik a magas zsírtartalmú étrenden. * jelzi p 0.5). Ez megerősíti, hogy a leptin fiziológiai szinten történő helyettesítése elegendő volt a sovány ob-norm állatok glükóz homeosztázisának normalizálásához. Ezzel szemben mindkét magas zsírtartalmú étrendnek kitett kohorsz késleltetett glükóz-clearance-t mutatott (2c. Ábra; p 3. ábra. Leptinérzékenység 12 napos infúzióban).

A. Vad típusú állatok testtömege, akik 12 napig leptin (piros) vagy PBS (fekete) infúziót kaptak (szürke blokk). B. Az ob-norm állatok testsúlya, akik 12 napig leptin (vörös) vagy PBS (fekete) infúziót kaptak (szürke blokk). C. A súlycsökkenés különbsége a leptin és a hordozó között minden kohorszban a 12 napos leptin infúzióban. Az értékeket a testtömeg százalékos változásában fejezzük ki. D. Átlagos napi táplálékfogyasztás a 12 napos infúzió alatt az egyes kohorszok állatai számára.

Az alacsony zsírtartalmú étrenden tartott ob-norm egerek érzékenyek voltak a leptinre, és hasonló csökkenést mutattak a táplálékbevitelben, mint vad típusú társaik (15,2 ± 1,4 kcal/d a jármű esetében, szemben a 12,1 ± 1,1 kcal/d leptin esetén p = 0,08), és testtömegük körülbelül 10% -át veszítik el a 12 napos infúzió során (−2,8 ± 1,1% a kontrollnál, míg −11,6 ± 1,0% a leptinnél, p 4. ábra. STAT3 foszforiláció válaszként akut leptin injekcióig.

A. A pSTAT3 festése egerek mediobasalis hipotalamuszában alacsony zsírtartalmú étrenden, leptin vagy vivőanyag intraperitoneális injekciójával. B. A pSTAT3 festése egerek mediobasalis hipotalamuszában magas zsírtartalmú étrenden, intraperitoneális injekcióval, leptin vagy vivőanyag beadásával. C. Alacsony zsírtartalmú étrenden lévő egerek pSTAT3 pozitív sejtjeinek mennyisége az ív alakú magban. D. A pSTAT3 pozitív sejtek mennyisége az ív alakú magban magas zsírtartalmú étrenden.

Legközelebb ugyanabban a vizsgálatban teszteltük az ob-norm egereket. Az alacsony zsírtartalmú étrenden tartott Ob-norm egerek fokozott STAT3 foszforilációt mutattak a leptinre reagálva, és ennek a növekedésnek a nagysága hasonló volt a vad típusú kontrollokhoz (10,7 ± 4,5 sejt a vivőanyaghoz, szemben a 71 ± 1,7 sejtekhez a leptinhez, p 2 g) kizártuk az elemzésből.

Leptin infúziós vizsgálatok

Az állatok rövid távú leptin infúzióval szembeni érzékenységének mérésére az egyes állatok mikro-ozmotikus pumpáját 14 napos pumpával (Model 2002, Durect) helyettesítettük, amely a neptárt a kiindulási érték felett 450 ng/h sebességgel adagolta. Ez azt jelenti, hogy a vad típusú állatoknál a PBS-t szállító szivattyúkat leptint szállító 450 ng/h sebességű szivattyúkkal helyettesítették, ob/ob állatok esetében pedig a 150 ng/h sebességű leptint szállító szivattyúkat 600 ng/h sebességű leptint szállító szivattyúkkal helyettesítették. . A testtömeget naponta regisztrálták, az ételt pedig 6 naponként regisztrálták. 12 nap elteltével a szivattyúkat eltávolítottuk és leptint adagoló szivattyúkkal helyettesítettük a kiindulási értéket (PBS vad típusú állatoknál és 150 ng/h ob/ob állatoknál).

Immunhisztokémia

Az egereknek vagy leptint (2 mg/kg, intraperitoneális) vagy vivőanyagot (PBS) injektáltunk. Az injekció beadása után 30 perccel az állatokat izofluránnal altattuk és 10% semleges pufferelt formalinnal (Sigma, St. Louis, MO) perfundáltuk. Az agyakat boncolással eltávolítottuk, és egy éjszakán át 4 ° C-on formalinban áztattuk. 50 um-os metszeteket készítettünk és festettük a pSTAT3-ra az alábbiak szerint [10]. A szabadon lebegő szakaszokat 1% H2O2 + 1% NaOH vízzel 10 percig, majd 0,3% glicin PBS-ben 10 percig és 0,03% SDS-t PBS-ben 10 percig kezeljük. Ezután a metszeteket blokkoló oldatnak (0,1% Triton X-100/2% kecskeszérum/3% BSA tartalmú PBS-nek) tettük ki 1 órán át. A foszfo-STAT3 (Tyr 705) antitestet (# 9131, Cell Signaling, Danvers, MA) 1: 1000 arányban hígítottuk blokkoló oldatba, és a metszeteket 48 órán át 4 ° C-on festettük. A metszeteket ezután háromszor, 20 percig mostuk és másodlagos antitesttel inkubáltuk 2 órán át (Alexa 488 konjugált kecske nyúlellenes antitest; Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia). A metszeteket háromszor, 20 percig mostuk, mikroszkóp tárgylemezekre helyeztük és lefényképeztük.

A festett sejtek számának számszerűsítéséhez egy 300 × 300 pixeles részt távolítottunk el az íves magot ábrázoló régióból minden képen. A pozitív sejtek számát ezután egy megfigyelő megvizsgálta, aki megvakult a minta azonosságára.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: ZAK JMF. Végezte a kísérleteket: ZAK KSH MLG. Elemezte az adatokat: ZAK KSH MLG JMF. Írtam a papírt: ZAK.