Példák

I. Az Alga kultúrája Neochloris Oleoabundans és a biomassza helyreállítása

A felhasznált törzs az UTEX algothekéből származik (az Austini Texas Egyetem algagyűjteményéből), és UTEX 1185 referenciával rendelkezik. Ezt a törzset Szaúd-Arábiában izolálták.

A példa kapcsán a tenyésztést szakaszos üzemmódban hajtottuk végre 20 g 3 tartályban, 18 g/l sót tartalmazó sós vízzel megtöltve, a következő összetételű tápközeg hozzáadásával:

B1-vitamin: 1,10 −4 g/l

B12-vitamin: 5,10 −7 g/l

H-vitamin: 5,10-7 g/l

Félig folyamatos üzemmód is alkalmazható. Az alkalmazott tartálytípusban a tenyészet 12-15 nap múlva érik el.

Ezen időszak végén az algaszuszpenzió egészét vagy egy részét visszavonják.

A biomasszát ezután centrifugálással betöményítjük 14000 g gyorsulással (1 g = 9,18 m/s 2).

II. Kivonatok előállítása a találmány szerint

1. Kivonatok készítése metanollal végzett első extrakcióból

a. 500 g-os gömblombikban 250 g metanolt adunk 100 g 26% száraz kivonatot tartalmazó algabiomasszához. Az elegyet nitrogénatmoszférában 30 percig 65 ° C-on melegítjük. Az egészet 400 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáljuk. A folyékony fázist elválasztjuk a szilárd maradéktól és eldobjuk. A szűrési maradékot ezután egy 250 ml-es gömblombikba visszük, és ugyanezen körülmények között 250 ml metanollal extraháljuk. Ezt a műveletet még egyszer megismétlik. A három folyékony fázist egyesítjük, majd rotációs bepárlón szárazra pároljuk. A kapott szilárd anyagokat 100 ml vízben reszubilizáljuk, majd fagyasztjuk és liofilizáljuk. Ez a kivonat végül por formájában van, és a továbbiakban A kivonatként jelöljük.

a.1. Az a) pontban leírtakkal megegyező előkészítési sémát követve az ismét összegyűjtött folyékony fázist rotációs bepárlón szárazra pároljuk, majd reszubilizáljuk, de ezúttal 200 ml heptánnal. Az egészet ultrahanggal kezeljük, majd 30 percig 4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszót kinyerjük, rotációs bepárlón szárazra pároljuk, majd 100 ml desztillált víz hozzáadásával reszubilizáljuk, fagyasztjuk, majd liofilizáljuk, így kivonatot kapunk, amelyet a továbbiakban A1-nek jelölünk.

a.2. Ugyanazon extrakciós sémát követve, mint amit az A) kivonat elkészítéséhez az 1.a) pontban leírtak, a metanollal végzett extrakcióval kapott szűrési maradékot ebben az esetben 100 ml kloroformban, 95 ml vízben és 5 ml metanolban oldjuk fel. hozzáadódnak. A két fázis között folyadék-folyadék megoszlást hajtanak végre. A szerves fázist eldobjuk, a vizes fázist kétszer 50 ml kloroformmal mossuk, majd ezt is eldobjuk az a.3) pontban leírt kivonat előállításához. A szerves fázisokat egyesítjük, majd rotációs bepárlón szárazra pároljuk, 50 ml vízben reszubilizáljuk és liofilizáljuk. A kapott kivonatot a továbbiakban A2-nek jelöljük.

a.3. Az a.2) pontban meghatározott vizes fázist rotációs bepárlón bepároljuk, 50 ml vízben reszubilizáljuk és liofilizáljuk, így kivonatot kapunk, amelyet a továbbiakban A3-nak jelölünk.

2. A B kivonat elkészítése első vizes-etanolos extrakcióval és a kivonat frakcionálása

a. B vizes-etanolos kivonat készítése

250 g etanol/víz keveréket (94/4 térfogat/térfogat, a továbbiakban v/v) adunk 100 g algabiomasszához, amely 14,6% száraz extraktumot tartalmaz, 500 ml-es gömblombikban. Az elegyet 30 percig visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Lehűlés után az extraktumot 20 percig 4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, majd a centrifugálási maradékot összesen háromszor 250 ml vizes-alkoholos oldattal extraháljuk.

A felülúszókat ezután egyesítjük, Büchner-tölcséren szűrjük 0,40 μm-es szűrővel (GF/F, Whatman), majd rotációs bepárlón szárazra pároljuk.

A kapott B kivonatot ezután DMSO-ban oldjuk 5% (tömeg/térfogat, a továbbiakban w/v) koncentrációban a biológiai vizsgálatokhoz.

b. A B kivonat frakcionálása folyadék-folyadék partícióval a B1 és a B2 kivonat elkészítéséhez

2 g előző B kivonatot kb. 80 ml etanol/víz (20/40, v/v) elegyben hígítunk, így 2,5% -os oldatot kapunk. Kétfázisú rendszer előállításához 53 ml etil-acetátot adunk hozzá. A két fázist elválasztjuk az első szerves fázis kinyerése érdekében. A vizes fázist 53 ml etil-acetáttal átmossuk, és ezt összesen négyszer megismételjük. A 4 szerves fázist egyesítjük, majd rotációs bepárlón bepároljuk, így kivonatot kapunk, amelyet a továbbiakban B1 kivonatnak nevezünk.

A vizes fázist rotációs bepárlón is szárítjuk, így száraz kivonatot kapunk, amelyet a továbbiakban B2 kivonatnak nevezünk.

A B1 kivonatot DMSO-ban oldjuk 5% (w/v) koncentrációban, és a B2 kivonatot 5% (w/v) koncentrációjú vízben oldjuk fel a biológiai vizsgálatokhoz.

3. C kivonat elkészítése első vizes-etanolos extrakcióval

500 ml-es gömblombikban 250 g etanol/víz (96/4, v/v) elegyet adunk 100 g 12% száraz kivonatot tartalmazó algabiomasszához. Az elegyet 30 percig visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Lehűtés után az extraktumot 400 fordulat/perc sebességgel 20 percig centrifugáljuk, majd a centrifugálási maradékot összesen háromszor 250 ml vizes-alkoholos oldattal extraháljuk.

A felülúszókat ezután egyesítjük, Büchner-tölcséren (GF/F szűrő, Whatman, 40 μm) szűrjük, majd rotációs bepárlón szárazra pároljuk. A kapott száraz extraktum C kivonat. Ezt követően DMSO-ban oldjuk 5% (w/v) koncentrációban a biológiai vizsgálatokhoz.

III. A találmány szerinti kivonatok lipolitikus aktivitásának meghatározása

III 1. A vizsgálat elve

A cél az (I) általános képletű kivonatok lipolitikus aktivitásának értékelése Neochloris oleoabundans a találmány szerint a zsírszövetek életben tartott explantátjaira.

A különböző kivonatokat az alábbiakban ismertetett körülmények között beépítjük a táptalajba.

8 napos érintkezési idő elteltével az aktivitást a táptalajba kibocsátott zsírsavak meghatározásával értékeljük.

III 2. Eljárás

9 zsírszövet explantátumának elkészítése és életben tartása a BEM-ben (BIO-EC Explants Medium)

Az explantánsok felosztása 3 tételre, 3 explantánsra:

- referencia tétel a táptalaj jelenlétében
- pozitív referenciaként koffeinnel kezelt adag
- a találmány szerinti kivonattal kezelt adag

Teszttermékek:

- Pozitív referencia: A koffeint 0,1% (1 mg/ml) végkoncentrációban használják a túlélési közegben, azaz tízszer nagyobb koncentrációban, mint a találmány szerinti kivonatoké, és a koffein már nem rendelkezik lipolitikus hatással. 0,01% -os koncentrációban (100 μg/ml).
- A találmány szerinti Neochloris kivonat: Az extraktum száraz por formájában van, amelyet 50% -os DMSO-ban oldunk, majd az explant táptalajban 1/500-ra hígítjuk, hogy a végső koncentrációban teszteljük. 0,01% (100 μg/ml).

A kivonatok alkalmazása:

D0-nál az explantátumokat életben tartjuk 2 ml táptalajban, amelybe a tesztkivonatot beépítettük.

Ezt a kezelést D2, D4 és D6 hőmérsékleten megismételjük.

D2, D4, D6 és D8 hőmérsékleten a táptalajból mintát veszünk. Az egyes explantánsokhoz a D2, D4, D6 és D8 hőmérsékleten mintát vett közegeket ugyanabban a csőben egyesítjük és -20 ° C-on tároljuk a táptalajban található zsírsavak meghatározásához.

A tápközegben jelen lévő szabad zsírsavak meghatározása:

A táptalaj extrahálása után a benne lévő szabad zsírsavakat elválasztjuk és nagy teljesítményű vékonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk.

Az adipociták életképességét és morfológiáját szövettan figyelemmel kíséri. 8 napos életben tartás után a referencia és a kezelt explánsok sem látható lebomlást, sem sejtekrózist nem mutatnak.

A lipolitikus aktivitást a tápközegbe felszabaduló szabad zsírsavak arányának meghatározásával értékeljük.

A kapott eredményeket az alábbi táblázatok adják meg, és megegyeznek a tenyészközegbe a kezelés nyolc napja alatt felszabadult zsírsavak tömegével, μg-ban kifejezve.

a. A találmány szerinti B kivonattal elért eredmények

Látható, hogy a találmány szerinti összes tesztkivonat jelentős lipolitikus aktivitással rendelkezik, mivel jelentős mennyiségű zsírsav szabadul fel a közegben. Ez a lipolitikus aktivitás akár nagyon jelentősnek tekinthető, különösen a Bi kivonaté, mert a találmány szerinti kivonatokhoz használt 0,01% -os dózisnál a koffein, amely lipolitikus aktivitásáról jól ismert pozitív referencia, már nem aktív.