Krónikus acidózis által kiváltott változás a csont-hidrogén-karbonátban és a foszfátban

Absztrakt

emberben és más emlősökben a krónikus metabolikus acidózis fokozza a vizelet kalcium kiválasztását (19, 52), a vese tubuláris kalcium újrafelszívódásának közvetlen csökkenése miatt (67), anélkül, hogy fokozná a bél kalcium felszívódását (43), ami a negatív negatív kalcium egyensúlyt eredményezi 2, 49, 51). Mivel a test kalciumának túlnyomó része a csont ásványraktáraiban található (29), a negatív kalciumegyensúly a csont ásványi anyag elvesztésével jár (64). In vivo vizsgálatok kimutatták, hogy az ammónium-klorid által kiváltott metabolikus acidózis csontásvány veszteséghez vezet (3), és hogy a proximális vesetubulus acidózisban szenvedő betegek magassága rövidebb, csökkent radiális csontsűrűségük és vékonyabb csípőcortikuk, mint az érintetlen rokonoknál ( 50). A disztális vese tubuláris acidózisban szenvedő betegek csontsűrűsége és csontképződési sebessége is csökken (38); mindkét paraméter javul egy év HCO3-kezelés után (39). A krónikus veseelégtelenség folyamatban lévő metabolikus acidózisában a vér pH-értéke stabil maradhat, bár jelentősen csökken, a progresszív hidrogénion (proton) visszatartás ellenére, ami arra utal, hogy nagy mennyiségű protonpuffer áll rendelkezésre (59). Tekintettel a potenciális protonpufferek nagy tömegére, a csont nyilvánvaló hely a protonpufferelésben metabolikus acidózis során (12).

A metabolikus acidózis in vitro modellje, amelyet a közepes HCO3-koncentráció ([HCO3 -]) csökkentésével állítanak elő, a kalcium jelentős kiáramlását indukálja tenyésztett újszülött egér calvariákból (11, 22, 24, 30, 36, 48), míg metabolikus alkalózis kalcium beáramlást indukál a csontba (13). Rövid ideig tartó (3 órás) tenyészetek során ez a sav által kiváltott kalcium kiáramlás a csont ásványi anyag fizikokémiai oldódása miatt jelenik meg (24, 36). Hosszabb ideig (> 24 óra) azonban a sejtek által közvetített csontfelszívódás miatt a csontból származó kalcium kiáramlás is megjelenik (11, 22, 30, 48). Kimutattuk, hogy a metabolikus acidózis az osteoclastic β-glükuronidáz aktivitás növekedéséhez és az osteoblastos kollagén szintézis csökkenéséhez vezet (11, 42, 48). Ezenkívül az acidózis gátolja néhány, de nem az összes azonnali korai válaszgén stimulálását (42), és reverzibilisen gátolja bizonyos extracelluláris mátrix gének expresszióját (40). Ez a sejtközvetített reszorpció a fokozott prosztaglandin E2 szintézis eredménye, amely serkenti az osteoclastic reszorpciót és elnyomja az osteoblast funkciót (31, 44, 47, 58). Az in vitro metabolikus acidózis ásványi kálium és nátrium (21, 28, 36, 37) felszabadulását és ásványi karbonát (26, 27), HCO3 - és foszfát (34) kimerülését okozza.

Tehát a jelen tanulmányban nagy felbontású pásztázó ionos mikropondát alkalmaztunk szekunder ion tömegspektroszkópiával (SIMS) annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy a krónikus acidózis lokalizálásával és összehasonlításával nagyobb mértékben csökkenti az ömlesztett (keresztmetszetű) csontfoszfátot, mint a csontkarbonát. a csont HCO3 - és foszfátváltozása az újszülött egér kalvariáinak krónikus savas közegben történő inkubálása után. Megállapítottuk, hogy a krónikus acidózis a keresztmetszeti HCO3 - és a foszfát csökkenést váltott ki a felület HCO3 változása nélkül - és a foszfátban, és a foszfát esése túlsúlyban volt a HCO3 csökkenésével szemben. Ezen protonpufferek, a HCO3 - és a foszfát kimerülése segít enyhíteni a pH csökkenését a krónikus acidózis során.

A csont szervkultúrája. Az újszülött (4–6 napos) CD-1 egereket (Charles River, Wilmington, MA) megölték, a calvariáikat boncolással eltávolították, a tapadó porcos anyagot levágták, és a periosteumot érintetlenül hagyták (8, 9, 11, 13, 21-28, 30-34, 36, 37, 40-42, 46-48, 60). Pontosan 2,8 ml Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajt (MA Bioproducts, Walkersville, MD), amely hő-inaktivált lószérumot (15%), heparin-nátriumot (10 U/ml) és penicillin-káliumot (100 U/ml) tartalmaz, P-ben előinkubáltuk. co 2/40 Torr 37 ° C-on 3 órán át 35 mm-es edényekben (8, 9, 11, 13, 21-28, 30-34, 36, 37, 40-42, 46-48, 60). Megállapítottuk, hogy 3 óra elegendő a P co 2 kiegyensúlyozásához az inkubátor és a táptalaj között (25). Előinkubálás után 1 ml táptalajt eltávolítottunk, hogy meghatározzuk a tápközeg kezdeti pH-értékét, a P co2-t és az összes kalciumkoncentrációt, valamint két kalvariát helyezünk mindegyik edénybe egy rozsdamentes acél huzalrácsra. Az egyes tenyészetek teljes csonttartalmát azonos korú és méretű kölykök alkalmazásával, standardizált boncolási eljárás alkalmazásával és két csontot helyeztünk mindegyik edénybe. A kísérleti és kontroll tenyészeteket párhuzamosan és véletlenszerű sorrendben hajtottuk végre.

Asztal 1. Közepes ionkoncentrációk és fluxusok

A korábban beszámoltakhoz (15-18, 21-23, 28, 34-37, 53, 54) hasonló korrekciós módszereket alkalmaztunk a megfigyelt tömegfeloldási számlálási sebességekre, hogy a szekunder ionhozamokat arányosak legyünk az elemi koncentrációval. a minta. Korrekciók szükségesek a kibocsátott atomok fajfüggő porlasztási és ionizációs valószínűsége miatt. A mikrográfon a teljes ionszám nemcsak a minta ionjainak emissziós tulajdonságaitól, hanem a minta által elfoglalt látómező töredékétől is függ, amelynek a calvariák esetében fizikai lyukai lehetnek. Ezenkívül a detektált ionhozamok a minta felületi érdességének mértékétől függenek. Ezen megfontolások miatt az eredményeket a minta ugyanazon területére kapott számarányok alapján fejezzük ki. Az ilyen arányok függetlenek a minta által elfoglalt látómező töredékétől és a felületi domborzattól.

Hagyományos mérések. A közepes pH-értéket és P co 2 értéket vér-gáz analizátorral (radiometrikus ABL 30 modell) és kalciumot elektróddal (Nova Biomedical, Waltham, MA) határoztuk meg. A [HCO3 -] táptalajt a táptalaj pH-jából és a P2-értékből számítottuk, az előzőekben leírtak szerint (8, 11, 25, 36). A nettó kalcium fluxust Vm-ként ([Ca] f - [Ca] i) számítottuk, ahol Vm a közepes térfogat (1,8 ml), a [Ca] f és [Ca] i pedig a végső és a kezdeti közepes kalciumkoncentráció . A pozitív fluxusérték az ion mozgását a csontból a közegbe, negatív érték pedig a közegből a csontba való elmozdulást jelzi.

Statisztika. Valamennyi szignifikancia-tesztet kiszámítottuk egy varianciaanalízissel, Bonferroni-korrekcióval többszörös összehasonlításra (BMDP, Kaliforniai Egyetem, Los Angeles, Kalifornia) digitális számítógépen. Minden értéket átlag ± SE-ként fejezünk ki; P co 2 és kalcium. A Ctl tápközeggel összehasonlítva a kezdeti és a végső pH és a [HCO3 -] a savas táptalajban jelentősen csökkent a 0–24 órás, 24–48 órás és 48–51 órás inkubálás során (1. táblázat) . A Ctl és a Sav táptalajok között a P co 2 -ben nem volt különbség egyetlen időszak alatt sem. A Ctl-táptalajban inkubált calvariákkal összehasonlítva a három egyedi inkubáció során és a vizsgált teljes időtartam alatt a savas táptalajban inkubált csontokból származó nettó kalcium fluxus jelentősen megnőtt (1. ábra).

1. ábra.Nettó kalcium fluxus újszülött egér kalvariákból, kontroll (Ctl; kezdeti táptalaj pH = 7,45, HCO3 - ~ 26) vagy savas (savas; kezdeti táptalaj pH = 7,14, HCO3 - ~ 13) közegben inkubálva, összesen 51 órán át. A kalvariákat 24 és 48 órával hasonló friss, előinkubált táptalajra helyeztük. Minden inkubálás előtt és után a táptalajban elemeztük a kalciumot. A Total az egyes csoportok 3 külön inkubációjából származó nettó kalcium fluxus összegét jelenti. A pozitív fluxus a csontból a közegbe történő mozgást jelzi. * P

HCO3 - . 51 órás Ctl-táptalajban történő inkubálás után a HCO3 aránya a C2 kötéshez képest nagyobb volt keresztmetszetében, mint a Ctl-táptalajban inkubált calvariaák felületén; azonban a HCO3 aránya a felszínen lévő CN kötéshez képest nem különbözött a Ctl táptalajban inkubált calvariae keresztmetszetén mérttől [att. 2, tetejére, reprezentatív spektrumok a calvariae felületéről Ctl táptalajban (kontroll az ábrán); 3. ábra, tetejére, reprezentatív spektrumok a calvariae keresztmetszetéből Ctl táptalajban; 4. ábra, tetejére, összeállított adatok]. A Ctl táptalajban történő inkubáláshoz képest a savas táptalajban történő inkubálás nem változtatta meg a HCO3 - C2 vagy a HCO3 - CN arányát a calvariae felületén (2. ábra, vö. Ctl és Acid és 4. ábra, tetejére).

2. ábra.A negatív szekunder ionok tömegspektrumai az újszülött egér calvariák felületén, 51 órán át inkubáltuk Ctl-ben (ábra kontroll) vagy savas közegben. A kalvariákat 24 és 48 órával hasonló friss, előinkubált táptalajra helyeztük. A számlálás/csatorna a detektált másodlagos ionok száma/s a fajfüggő ionizációs valószínűségekre nem korrigálva. A megfigyelt spektrumokat 1000 csatornán mértük, egyenlően elosztva a tömeg 10-90 atomi tömegegysége között. CN, szén-nitrogén kötés; C2, szén-szén kötés.

3. ábra.A negatív szekunder ionok tömegspektrumai az újszülött egér calvariák keresztmetszetén, 51 órán át inkubáltuk Ctl vagy Sav közegben. A kalvariákat 24 és 48 órával hasonló friss, előinkubált táptalajra helyeztük. A számlálás/csatorna a detektált másodlagos ionok száma/s a fajfüggő ionizációs valószínűségekre nem korrigálva. A megfigyelt spektrumokat 1000 csatornán mértük, egyenlően elosztva a tömeg 10-90 atomi tömegegysége között.

4. ábra.A HCO3 aránya a C2-hez és a HCO3 aránya a CN-hez az újszülött egerek calvariáinak felületén és keresztmetszetében 51 órán át inkubáltuk Ctl vagy Sav közegben (tetejére). A calvariákat hasonló, friss, előinkubált táptalajra helyeztük 24 és 48 órával. Alsó: az összes foszfát (PO2 + PO3) C2-hez és (PO2 + PO3) és CN-hez viszonyított aránya az újszülött egér kalvariák felületén és keresztmetszetében 51 órán át inkubáltuk Ctl vagy Sav közegben. A kalvariákat 24 és 48 órával hasonló friss, előinkubált táptalajra helyeztük. Az értékek átlag ± SE. * P + P

A Ctl táptalajban végzett inkubáláshoz képest azonban a savas táptalajban történő inkubálás a HCO3 - C2 arányának csökkenéséhez és a HCO3 - CN arányának csökkenéséhez vezetett a calvariae keresztmetszetében (3. ábra, vö. Ctl és sav és a 4. ábra, tetejére). A savas táptalajban történő inkubálás jelentős csökkenést okoz az ásványi HCO3-ban - a calvariae keresztmetszetében, de nem a felszínén.

Foszfát. 51 órás Ctl-táptalajban történő inkubálás után az összes foszfát (PO2 + PO3) aránya a C2-hez és a (PO2 + PO3) aránya a CN-hez viszonyítva a felszínen nem különbözött attól, amelyet az inkubált calvariae keresztmetszeténél találtunk Ctl táptalajban (2. ábra, tetejére, a Ctl felület reprezentatív spektrumai; 3. ábra, tetejére, a Ctl keresztmetszet reprezentatív spektrumai; 4. ábra, alsó, összeállított adatok). A Ctl táptalajban történő inkubáláshoz képest a savas táptalajban történő inkubálás nem változtatta meg a (PO2 + PO3) és a C2 arányát, vagy a (PO2 + PO3) és a CN arányát a calvariae felületén (2. ábra, vö. Ctl és Acid) és 3. ábra, alsó).

A Ctl-táptalajban történő inkubáláshoz képest azonban a savas táptalajban történő inkubálás a (PO2 + PO3) és a C2 arányának csökkenéséhez és a (PO2 + PO3) és a CN arányának csökkenéséhez vezetett a calvariae keresztmetszetében ( 3. ábra, vö. Ctl és sav, valamint 4. ábra, alsó). Így a savas közegben történő inkubálás az ásványi foszfát jelentős csökkenését idézi elő a calvariae keresztmetszetében, de a felszínén nem.

HCO3 - a foszfát vonatkozásában. A HCO3 mennyisége - a (PO2 + PO3) -hoz viszonyítva a calvariae felszínén nem tér el szignifikánsan a Ctl-táptalajban inkubált calvariae keresztmetszetétől (5. ábra). A Ctl táptalajban történő inkubáláshoz képest a savas táptalajban történő inkubálás nem változtatta meg a kalvariumok felületén a HCO3 - (PO2 + PO3) arányát. A Ctl táptalajban végzett inkubáláshoz képest azonban a savas táptalajban végzett inkubálás a HCO3 - (PO2 + PO3) arányának jelentős növekedéséhez vezetett a calvariae keresztmetszetében. Mivel a savas közegben történő inkubálás mind a (PO2 + PO3), mind a HCO3 csökkenéséhez vezetett a calvariae keresztmetszetében (3. és 4. ábra), a HCO3 - (PO2 + PO3) arányának növekedése a kereszten a calvariae szakasznak jeleznie kell (PO2 + PO3) kimerülését a HCO3-hoz viszonyítva. Így a metabolikus acidózis az ásványi anyag (PO2 + PO3) csökkenését idézi elő az ásványi HCO3-hoz viszonyítva - a calvariae keresztmetszetében.

5. ábra.A HCO3 - és (PO2 + PO3) aránya az újszülött egér calvariák felületén és keresztmetszetében 51 órán át inkubáltuk Ctl vagy Sav közegben. A kalvariákat 24 és 48 órával hasonló friss, előinkubált táptalajra helyeztük. Az értékek átlag ± SE. * P + P

Jelen tanulmány célja annak a hipotézisnek a tesztelése volt, hogy a krónikus metabolikus acidózis nagyobb mértékben csökkenti az ömlesztett (keresztmetszetű) csontfoszfátot, mint a csont-karbonát. Nagy felbontású pásztázó ionos mikropróbát alkalmazva szekunder ion tömegspektroszkópiával lokalizáltuk és összehasonlítottuk a csont HCO3 - és foszfát változását az újszülött egér kalvariáinak savas közegben való krónikus inkubálása után. Megállapítottuk, hogy a semleges pH-jú közegben inkubált csontokhoz képest a krónikus acidózis a keresztmetszeti HCO3 - és a foszfát csökkenését váltotta ki, a felület HCO3 változása nélkül - és a foszfátot, és hogy a foszfát csökkenése túlsúlyban volt a HCO3 csökkenésével szemben. . Ezeknek a protonpuffereknek, a HCO3 - és a foszfátnak a fogyasztása segít csökkenteni a pH csökkenését a krónikus acidózis során.

Korábban tanulmányoztuk az ömlesztett midkortikális ionkoncentrációk változását az orális ammónium-klorid által kiváltott 7 napos in vivo metabolikus acidózis után (15). Megállapítottuk, hogy a csak desztillált vizet fogyasztó egerekhez képest az ammónium-klorid által kiváltott acidózis csont-nátrium és kálium veszteséghez vezetett, és - amint ez a tanulmány is mutatja - az ásványi HCO3 - és foszfát kimerüléséhez vezetett. Az előző tanulmányban megkérdőjeleztük, hogy vannak-e regionális különbségek az ásványi HCO3 - és a foszfát krónikus metabolikus acidózisra adott válaszában. Ez a tanulmány egyértelműen demonstrálja a csont krónikus acidózis modelljére adott válaszának regionális különbségeit; a további protonok kimerítik a keresztmetszetet, a felületet, a csontfoszfátot és a karbonátot nem.

Korábban tanulmányoztuk az akut acidózis hatását a felszíni és keresztmetszeti HCO3 - és foszfátra (34). Megállapítottuk, hogy a kontrollhoz képest 3 órás savas táptalajban történő inkubálás után a felület HCO3-ja - a C2 és a CN vonatkozásában - a keresztmetszeti HCO3 változása nélkül jelentősen csökkent. A kontrollhoz képest 3 órás savas közegben történő inkubálás után a keresztmetszeti foszfát jelentősen csökkent a C2-hez és a CN-hez képest is, a felszíni foszfát változása nélkül. A csontfelületen a HCO3 négyszeres kimerülése következik be - a foszfát és keresztmetszetében a foszfát hétszeres kimerülése a HCO3-hoz viszonyítva. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a csont által végzett akut H + pufferelés a felszíni HCO3 - és a keresztmetszeti foszfát előnyös oldódását jelenti.

Nem váratlan, hogy az újszülött egér csontjának krónikus vizsgálata során a foszfát sav által kiváltott mennyisége túlsúlyban lenne a HCO3 kimerülésével szemben. Raman vibrációs mikrospektroszkópia segítségével Tarnowski és mtsai. (63) megállapította, hogy a karbonát és a foszfát aránya az egér kalvariáiban 3 és 7 nappal a szülés után ~ 0,12, ami azt jelzi, hogy sokkal több foszfát van, mint a HCO3 - lehetséges protonpufferként. Mindegyik felszabaduló PO4 elfogadja a protont négy HPO4 2 arányban - egy H2PO4-hez pH = 7,4 mellett. Minél alacsonyabb a pH, annál nagyobb a H2PO4 aránya - a HPO4 2-hez viszonyítva. A CO3 2 csont - a H + -val egyesülve HCO3-t képez - majd további H + -val H2CO3 képződik, amely gyorsan disszociál H2O -vá és CO2-vé.

Más vizsgálatok kimutatták, hogy az in vitro (7, 8, 25, 28) és az in vivo (51, 59, 62) metabolikus acidózis során a csont ásványi fázisai pufferolni látszanak a további protonok egy részét, ami a tápközeg növekedését eredményezi. vagy a szisztémás pH-érték (10, 14, 20). A tenyésztett csontban korábban kimutattuk, hogy a közepes pH-érték akut csökkenése összefügg a H + csontba áramlásával (7, 8, 25), a nátrium és a kálium kiáramlásával a csontból (22, 22, 28, 36, 37), és ásványi karbonát veszteség (26, 27). A nátrium- és káliumcsere H + -ra csökkenti a környezeti H + -koncentrációt. Mivel a csont túlnyomó része kalcium-foszfát-komplexekből áll, a krónikus metabolikus acidózis során bekövetkező sav által kiváltott, sejtek által közvetített csontfelszívódás (11, 22, 30, 48) ásványi foszfát felszabadulást eredményez. Mi és mások kimutattuk a csont-karbonát veszteségét a metabolikus acidózis során (4, 30), és bebizonyítottuk, hogy az in vivo metabolikus acidózis az ásványi HCO3 - és foszfátcsökkenést okozza (15).

Jelen tanulmányunkban nagy felbontású pásztázó ion mikropróbát alkalmaztunk szekunder ion tömegspektroszkópiával a csont HCO3 - és foszfát változásainak lokalizálására a krónikus metabolikus acidózis modelljére reagálva. Megállapítottuk, hogy a krónikus acidózis a keresztmetszeti HCO3 - és a foszfát csökkenését váltotta ki, a felület HCO3 változása nélkül - és a foszfátot, és hogy a foszfát csökkenése túlsúlyban volt a HCO3 csökkenésével szemben. Ezeknek a protonpuffereknek, a HCO3 - és a foszfátnak a fogyasztása segít csökkenteni a pH csökkenését a krónikus acidózis során a csont ásványianyag-tartalmának rovására.

Ezt a munkát részben az AR-46289 és a DK-56788 egészségügyi intézmények támogatták.