Osteogén programok a zebrafish uszony regenerációja során

Claire J Watson

1 Ortopédiai és Sportorvosi Osztály, Washingtoni Egyetem, Seattle, WA, USA

Ronald Y Kwon

1 Ortopédiai és Sportorvosi Osztály, Washingtoni Egyetem, Seattle, WA, USA

Absztrakt

A genomikai, szűrési és képalkotási technológiák legújabb fejleményei új lehetőségeket kínáltak az emberi fiziológia és betegség hátterében álló molekuláris és sejtes táj megvizsgálására. A csontvázkutatás összefüggésében a rendszergenetika, a nagy áteresztőképességű szűrés és a nagy tartalmú képalkotás technológiái elősegíthetik az elfogulatlan megközelítést az új biológiai, kóros vagy terápiás utak keresésekor. Ezek a megközelítések azonban olyan speciális modellrendszerek alkalmazását teszik szükségessé, amelyek gyorsan létrehoznak egy fenotípust, könnyen kezelhetők és alkalmasak optikai vizsgálatokra, mind az emlősök csontfiziológiáját képviselik molekuláris és sejtszinten. A zebrafish (Danio rerio) megjelenése az emberi betegség modellezésében rávilágít arra, hogy felgyorsítja az emlős csontváz terápiás és utak felfedezését. Ebben az áttekintésben a zebrafish fin ray regeneráció potenciális értékét (gyors, genetikailag kezelhető és optikailag átlátszó intramembranos csontosodás modelljét) vesszük figyelembe ilyen vizsgálatok transzlációs modelljeként.

Bevezetés

A nagyszabású biológiai kutatások technológiai fejlődése (beleértve az egész genom gyors szekvenálását, a nagy áteresztőképességű kémiai felfedezést és a nagy tartalmú képalkotást) ígéretet tesz arra, hogy erőteljes új utakat nyit meg a csont biológiai felfedezéséhez. E technológiák előnyeinek kihasználása közvetlenül összefügg a nagyszabású megközelítésekhez megfelelő modellrendszerek elérhetőségével. A zebrafish (Danio rerio) a genetikai rugalmasság, az alacsony költség, az optikai átlátszóság, a kis méret és a vegyületek vízen keresztüli adagolásának egyszerű kombinációját képviseli. Ezek a tulajdonságok teszik a zebrafish-t vonzó modellvé az orvosbiológiai kutatások számára, mivel megkönnyítik az erőteljes kísérleti megközelítéseket, amelyek nagy kihívást jelentenek a többi gerinces modellrendszerben. Ezek a megközelítések magukban foglalják a genom léptékű genetikai szűrőket, 1 nagy tartalmú sejtszintű képalkotást, 2 in vivo kismolekula felfedezést3 és az emberi mutáns génfunkció gyors kihallgatását.4

A csontszövet és a sejtdinamika in vivo képalkotása a zebrafish uszony regenerációja során. (Balra) A zebrafish farokúszó kettős fluorokróm címkével rendelkezik. A regenerált csont alizarinvörössel jelölt, de a kalceinnel nem jelzett régiói az amputációt követő 7–14 nap között új csontot jeleznek (d.p.a.). (Bal oldali betét) A dobozos régió nagyítása feltárja a kinövés utáni csontmeghatározást. (Jobbra) EGFP expresszió sp7-ben: Az EGFP zebrafish az oszteoblasztokat fedi fel mind a natív, mind az újonnan regenerált csontszövetben.

Számos kiváló értékelés írta le az uszonyos regeneráció értékét, mint a regeneratív biológia traktálható modelljét, 18,23,24, valamint a halmodellek szélesebb körű hasznát a csontbiomedikai kutatásban. 5,8,10,24 a csontnövekedés és az ásványosodás modelljeként az uszonyok regenerálódásának lehetséges alkalmazásai hiányoztak. Ebben az áttekintésben a zebrafish uszonyos regeneráció és az emlős oszteogén fiziológiái közötti genetikai és útvonal-hasonlóság bizonyítékait vizsgáljuk. Megvitatjuk azokat a feltörekvő képalkotási technológiákat is, amelyek elősegíthetik ennek a modellnek az előrehaladását gyors és nagy tartalmú modellként a csontvázkutatásban. Végül megvizsgáljuk a zebrafish csontváz genetikai és kémiai szűrésének egyedülálló kísérleti követelményeit, és megvitatjuk az innováció lehetőségeit, amelyek elősegíthetik a gyors és nagy tartalmú elemzések új megközelítésének előmozdítását ebben a modellrendszerben.

Osteoblast differenciálás és aktivitás

Blastema képződés és a csontsejtek differenciálódása

Az olyan kulcsfontosságú események vizsgálata, amelyek lehetővé teszik a függelék regenerálódását (zebrafish uszonyokban, valamint más gerinces szerkezetekben, például szalamandra végtagokban és egér számjegyekben), a blastema kialakulására összpontosítottak. Ezenkívül mind a pluripotenciát, mind a blastema progenitor sejtjeinek forrását megkérdőjelezték (hipotézisekkel kezdve a forgalomban lévő sejtektől, a rezidens őssejtektől vagy a dedifferenciált sejtektől). A legújabb vizsgálatok rámutatnak arra, hogy a dedifferenciált oszteoblasztok jelentősen hozzájárulnak a blasztemális progenitorokhoz a zebrafish fin regenerációjában, 28,30, valamint a zebrafish uszony és koponya törésgyógyulásában.34 Ezek a tanulmányok azt sugallják, hogy a dedifferenciáció nem folyamatspecifikus (regeneráció vs törés), és nem is lokalizáció. specifikus (uszony koponya). Fontos, hogy a blastema dedifferenciálódott oszteoblasztjainak sorsa korlátozott marad, és a regeneratív kinövés során kizárólag osteoblastokká differenciálódnak.

Emlősökben egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arról, hogy a csontképződést a sorskorlátozott progenitorok többféle összefüggésben is közvetíthetik. Az egér számjeggyel, amely képes regenerálni a P3-, de nem a P2-szintű amputációkat (hasonlóan a kisgyermekek számjeggyel ellátott tippjeihez), bebizonyosodott, hogy a proliferatív sejteket a sorskorlátozott sejtek helyi csoportja alkotja. egereken végzett vonalkövetési vizsgálatok arra utalnak, hogy mind a csontfenntartást, mind a regenerációt (legalább részben) az osteolineage-korlátozott progenitor sejtek közvetítik (35,37), ami azt jelzi, hogy az emlősök csontregenerációjának egyes eseteiben nem szükséges pluripotens sejtpopuláció bevonása.

Jelenleg nem megoldottak azok a folyamatok, amelyek során az emlős csontsejtjei dedifferenciálódhatnak. A differenciálódásról elsősorban azt gondolták, hogy a nagy regenerációs potenciállal rendelkező szervezetekre jellemző. A csontchipekből izolált egérsejtek azonban bizonyítékot szolgáltattak az oszteociták sorskorlátozott progenitorokká történő differenciálódására.38 Érdekes módon ezek a sejtek in vivo beültetéskor újból differenciálódnak érett csontsejtekké. A vizsgálatok dokumentálták az érett egér csontsejtek oszteoblasztokká történő átalakulását a PTH kezelés eredményeként mind in vivo39, mind a tenyészetben.40 Ezzel szemben felnőtt egerekben a vonalkövetési vizsgálatok azt sugallják, hogy a csont fenntartását/átalakítását közvetítő oszteoblasztok többsége nem dedifferenciálás útján származnak, és a rezidens, sors által korlátozott mezenkimális őssejt-progenitorok egy részhalmaza az oszteoblasztos sejtek forrása a törés gyógyulása során.37 A pre-amputációs szövet sejtjei szintén szerepet játszanak oszteoblaszt-progenitorként az egér számjegyű regenerációjában, de hogy ezek dedifferenciálás útján származnak-e, vagy a felnőtt progenitorok helyi készletéből származnak, nem világos.35,36

E kontextusfüggőség ellenére egy közelmúltbeli tanulmány, amely két szalamandrafaj (axolotl és gőte) végtag-regenerálódását hasonlította össze, feltárja, hogy a vázizom progenitorok forrása eltér a kettő között.41 A szerzők azt találják, hogy a gólyák progenitor sejtjei myofiber dedifferenciációból származnak, míg az axolotl a progenitorok rezidens műholdas sejtekből származnak, arra következtetve, hogy bár az őssejtek forrása eltérhet, e sejtek végső képessége érett szövetké differenciálódni nem. Ebben az összefüggésben azt kell megvizsgálni, hogy a dedifferenciálódásból származó csontsejt-progenitorok is részt vehetnek-e a blastema által közvetített csontregenerációban.

Osteogén jelátviteli utak

Az oszteoblasztok differenciálódása a fin regenerációja során az oszteoblaszt differenciálódás kanonikus markereinek hasonló paneljét vonhatja maga után, mint emlősöknél, és felveti azt a kérdést, hogy az ezeket a tényezőket szabályozó utak milyen mértékben konzerválhatók. Például a BMP-k központi szerepet játszanak a csontképződés és fejlődés szabályozásában, valószínűleg az oszteoblaszt-differenciálódás közvetítésével. 42,43 A kanonikus BMP-jelátvitel a csontban (lásd Chen és mtsai. 44 áttekintést) függ a SMAD1/5/8 foszforilációtól és a transzkripciós faktorok downstream szabályozása, beleértve a RUNX2, OSX és DLX5. A zebrafish-ban kifejezetten kimutatták, hogy a bmp2b expresszálja és szabályozza a csontvázképződést a regeneráló fin 19,29-ben, más BMP-kkel együtt, beleértve a bmp429,45-t és a bmp6.29-et. Emlősöknél a BMP2 és a BMP4 elvesztése vázhibákat is eredményez, amelyek néha súlyos osteogén kettős Bmp2/Bmp4 feltételes kiütésnél látható károsodást.43 Aktivált Smad1/5/8-at detektáltak a regeneráló zebrafish fin19,46-ban, és jelezték a BMP-jelátvitel irányításában a differenciálódó osteoblastoknál.19 Végül a dlx5 uregulációja látható a zebrafish fin46 regenerálásában, bár pontos szerepe az uszony csontképződésének modulálásában kevésbé egyértelmű.

A Wnt szignálozásnak központi szerepe van az emlősök osteogenezisében, 47 és a regeneráló zebrafish finnél is. 19,20,48 Ortológok expresszióját detektáltuk fontos emlős osteogén molekuláris szereplők, például LRP5, β-catenin és AXIN2 számára a regeneráló fin19-ben, 20,46, az ortológusok mellett olyan downstream célpontoknál, mint a CX43,46,49 BAMBI20,46 és a TWIST2,19. Ezenkívül a dkk1b-ről kiderült, hogy gátolja a Wnt jelátvitelt és csökkenti az oszteoblaszt prekurzorok számát a regeneráló fin-ben. a kanonikus Wnt jelátvitel jól megalapozott, hogy elengedhetetlen az oszteoblasztok differenciálódásához. A differenciált osteoblastok csontképződésének szabályozásában betöltött szerepe azonban sokkal korlátozottabbnak tűnik. A differenciálódott oszteoblasztokban stabilizált β-catenin jelátvitellel rendelkező egérmutánsokról kiderült, hogy a reszorpció megváltoztatása helyett a képződés miatt oszteopéniát mutatnak. a jelátvitel térben a blastema51-re korlátozódik, és nem figyelhető meg az újonnan képződött csontszövetben.

Érdekes, hogy a Wnt jelátviteli inhibitor Sost, amely szinte kizárólag az emlősök csontjában található oszteocitákban található, a korai fin regeneráció során a blasztemában fejeződik ki. 20 Míg a zebrafish csontváz többi csontja rendelkezik osteocytákkal, az uszony csont sugarai nem. faj, oszteocita és nem oszteocita csontot figyeltek meg az uszony csontos sugaraiban, és felvetették, hogy az oszteocita cellularitás mértéke a csontsugár szegmens vastagságától függ.53 Ebben az összefüggésben fontos kérdés, hogy az expresszió a zebrafish uszonyban lévő sost vagy más osteocytás gének száma tükrözi a divergens funkciót vagy a konzervált funkciót a különböző sejttípusokban.

Bizonyíték a konzervált génfunkcióra

Az oszteogenezis során az utak és a fiziológiák regeneráló uszonyokban való részvételével kapcsolatos jelenlegi ismereteink nagy része a génexpressziós adatokra korlátozódik. Bár ezeknek a géneknek a funkcionális szerepét a legjobban a knockout/knockdown modellek segítségével lehet megvizsgálni, a legtöbb esetben ezeknek a géneknek a regeneráló uszonyban lévő mutáns fenotípusait még nem vizsgálták. Számos zebrafish mutáns jellemezte azonban az emberi csontrendszeri rendellenességeket, amelyek precedenst teremthetnek a zebrafish gén expressziójának és funkcióinak adatainak az emlősök ismert fiziológiájához való összekapcsolására. A csontváz betegségéhez molekulárisan kapcsolódó zebrafish mutánsokat azonosítottak10, és nagy csoportokba sorolhatók: (i) a koponya-arc fejlődésének megzavarása, (ii) a porc vagy a kollagén képződésére gyakorolt hatások és (iii) az mineralizáció és a csontsűrűség megváltozása.

Párhuzamok a végtagok fejlődésével

Neuromuszkuláris-csont áthallás

A zebrafish fin regeneráció osteogenezis modelljeként való alkalmazásának egyik lehetséges előnye, hogy párhuzamot vonhatunk az azonosított csontvázhiányok és az ismert regeneratív jelátviteli utaknak tulajdonított fenotípusok között. Például a BTx modellünkben számos fenotípusos hasonlóságot figyeltünk meg, mint amelyeket korábban a ciklopaminnal kezelt halaknál azonosítottak16 (például a korai regenerációra gyakorolt hatás hiánya, a késői regeneráció során a növekedés károsodása és a csontsugár bifurkációinak csökkenése). Ezt követően azt tapasztaltuk, hogy a BTx-re adott válaszként jelentkező regeneratív deficiteket megelőzte a hedgehog/gli útvonal gli1 és ptch1 gének túlzott expressziója. Ez utóbbi a Shh szignalizáció ismert represszora, ami szerepet játszik ennek az útnak a késői stádiumú osteogén funkciók (például a csont érése és az ásványi felhalmozódás) neuromuszkuláris szabályozásának közvetítésében.

Kvantitatív csontképalkotás a regeneráló zebrafish Fin

A csontásványok felhalmozódásának látható fényalapú számszerűsítése Rotopol képalkotással. (a) Rotopol mikroszkóppal nyert regenerált uszony (8 d.p.) birefringence képe. (b) Ugyanazon uszony MicroCT képe in a. (c) Az intenzitásprofilok pixelenkénti összehasonlítása egyetlen sugárban magas összefüggést mutat a Rotopol és a microCT mérések között (kivéve az ízületeket, ahol a szegmensek közötti ínszalag miatt további kettős törés van; a részleteket lásd a szövegben).

Multimodális képalkotó platform a gyors és nagy tartalmú képalkotáshoz a regeneráló zebrafish uszonyban. (a) Teljesen motorizált mikroszkóp, fluoreszcencia és Rotopol képalkotó képességekkel. (1) 1. kamera (fluoreszcencia); (2) 2. kamera (polarizált fény); (3) Motoros szűrőkerék; (4) XY fokozat piezo motoros hajtásokkal; (5) Motoros forgó polarizátor. (b) A nagy tartalmú szűréshez használt képalkotási folyamat vázlatos bemutatása.

Genetikai és kémiai szűrés a fin regenerálás során

Következtetés

Összegzésképpen elmondható, hogy a zebrafish csont strukturális, sejtes, molekuláris és genetikai szinten fenntartja az emlős csont bonyolultságának nagy részét, ugyanakkor fontos különbségekkel is rendelkezik. A fajok közötti útvonal-feltérképezésre vonatkozó új stratégiák új lehetőségeket kínálnak a zebrafish és emlős csontfiziológiák hatékony transzlációjára, valamint a transzlációs szakaszok azonosítására a transzlációban, nagy transzlációs haszonnal. Ezeknek az utaknak a gyors, genetikailag kezelhető és optikailag átlátszó rendszerben történő vizsgálatával a zebrafish fin regeneráció új paradigmákat tehet lehetővé a gyors áteresztőképességű és nagy tartalmú elemzéshez, amely javíthatja az osteogenezis megértését és felgyorsíthatja a csont terápiás felfedezését.

Köszönetnyilvánítás

Elismerjük az NIH AR066061 támogatás, az UW Royalty Research Fund A88052 támogatás és a Washingtoni Egyetem Ortopédiai és Sportorvosi Tanszékének támogatását.