Módszer-szabványosítás a veleszületett színpreferencia-vizsgálatok elvégzésére különböző zebrafish törzsekben

Petrus Siregar

1 Biotudományi Tanszék, Csung Jüan Keresztény Egyetem, Csung-Li 320314, Tajvan; [email protected] (P.S.); [email protected] (S.J.); moc.oohay@ariduatreblig (G.A.)

Stevhen Juniardi

1 Biotudományi Tanszék, Csung Jüan Keresztény Egyetem, Csung-Li 320314, Tajvan; [email protected] (P.S.); [email protected] (S.J.); moc.oohay@ariduatreblig (G.A.)

Gilbert Audira

1 Biotudományi Tanszék, Csung Jüan Keresztény Egyetem, Csung-Li 320314, Tajvan; [email protected] (P.S.); [email protected] (S.J.); moc.oohay@ariduatreblig (G.A.)

2 Kémiai Tanszék, Csung Jüan Keresztény Egyetem, Csung-Li 320314, Tajvan

Yu-Heng Lai

3 Kémiai Tanszék, Kínai Kulturális Egyetem, Taipei 11114, Tajvan; wt.ude.uccp.evilu@12hyl

Jong-Chin Huang

Kelvin H.-C. Chen

Jung-Ren Chen

5 Alkalmazott Kémiai Tanszék, Nemzeti Pingtung Egyetem, Pingtung 900391, Tajvan

Csung-Der Hsziao

1 Biotudományi Tanszék, Csung Jüan Keresztény Egyetem, Csung-Li 320314, Tajvan; [email protected] (P.S.); [email protected] (S.J.); moc.oohay@ariduatreblig (G.A.)

2 Kémiai Tanszék, Csung-jüan Keresztény Egyetem, Csung-Li 320314, Tajvan

6 Nanotechnológiai Központ, Csung Jüan Keresztény Egyetem, Csung-Li 320314, Tajvan

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A színészlelésről, amely fontos tulajdonság, amely lehetővé teszi az állatok számára az élelem, a ragadozók, a siklás, a párzási döntések és a rejtekhelyek felismerését, beszámoltak arról, hogy befolyásolja a zebrafish tanulási viselkedését és memória kialakulását [1,2]. A legújabb vizsgálatok azt mutatták, hogy a zebrafish viselkedés felhasználható a gyógyszerek neurotoxicitásának értékelésére [3,4]. Számos transzgenikus zebrafish modellt [5,6] fejlesztettek ki a viselkedés értékelésére különféle színjelek és vizuális ingerek alapján, mint például a T-labirintus [3,7], a passzív elkerülés [8,9], az Y-labirintus [10] és keresztlabirintus [6]. Az állatok és az alsó gerincesek fotoreceptor és a színspektrum-felismerés közötti út evolúciós szempontból konzervált [6]. A zebrafish-nak négy különböző kúpja van az UV és a látható hullámhosszak megkülönböztetésére. Pontosabban, az UV-kúp csúcsérzékenysége 362 nm-nél, az S-kúp csúcérzékenysége 417 nm-nél, az M-kúp csúcérzékenysége 480 nm-nél, az L-kúpja pedig 556 nm-nél csúcsérzékenységgel rendelkezik [ 11]. A zebrafish lárva a megtermékenyítés utáni 3,5 napon (dpf) reagál a fényre, 5dpf-től kezdve mobilitást mutat, és képes felismerni a színt 5 dpf korai életkorától kezdve [6].

A zebrafish-ban számos színpreferenciát szoktak bemutatni; az eredmények azonban néha ellentmondásosak voltak (az A3. táblázat foglalja össze). Például vagy vörösről [11,12] vagy kékről [1,3,6,7,13,14] számoltak be a zebrafish-ban a legmagasabb színpreferencia-rangsorban. A különböző laboratóriumok által közölt eltérő színpreferencia-rangsorolási eredmények oka lehet a fényforrás helyzetének (felső vagy alsó helyzetből adódó), a színintenzitás (különböző megvilágítási lux) és/vagy fizikai paraméterek, például a halak életkora és neme [1]., 2,3,6,7,11,13,14]. A vizsgálatok változékonyságát a kísérleti körülmények egységesítésével lehet leküzdeni az egyenletes eredmények biztosítása és az egyszerű értelmezés érdekében. Ebben a tanulmányban arra törekszünk, hogy szabványosítsuk a veleszületett színpreferencia teszt állapotát a felnőtt zebrákban a fényforrás helyzetének és intenzitásának, a társadalmi interakciónak, a nemnek, az életkornak és a tesztelt hal törzsének potenciális hatásának értékelésével. Ezenkívül az optimalizált protokollt alkalmaztuk az etanolnak kitett felnőtt zebrák színpreferencia-különbségének értékelésére, hogy feltárjuk ennek a beállításnak a toxicitási értékeléshez való lehetséges felhasználását.

2. Anyag és módszerek

2.1. Állatetika és a tanulmányban használt állatok

2.2. Színpreferencia-vizsgálat

A vizsgálatot 21x21x10 cm méretű akriltartályban végeztük, és 1,5 liter szűrt vízzel töltöttük fel. A 10,5 × 10,5 méretű tartály területének mindkét felét lux intenzitású színtábla kombinációval borítottuk be, az A1 táblázatban felsoroltak szerint. Az ebben a vizsgálatban elvégzett összes színpreferencia-vizsgálat szobahőmérsékleten történt, ami 26–28 ° C körüli. A hőmérsékleti viszonyok megegyeznek a zebrafish fenntartási körülményekkel. Négy 30 W-os LED-es lámpát helyeztek el fent (SerRickDon, Shenzhen, Kína), és egy 60 × 60 cm-es 24 W-os LED-lemezt (Lumibox, Shenzhen, Kína) helyeztek el a haltartályok alatt, hogy a megvilágítási pozíciók és intenzitások különböző kombinációit biztosítsák (1. ábra Ábra A1). Kiváló minőségű, páros töltésű (CCD) kamera, maximális felbontással 3264 × 2448 képpont és 30 képkocka/másodperces (fps) képsebességgel (ONTOP, M2 modul, Shenzhen, Kína) és infravörös (IR) kamerával (700) –1000 nm detektálási ablak), maximális felbontással 1920 × 1080 pixelnél és 30 fps képsebességgel (3206_1080P modul, Shenzhen, Kína) használtuk a halak mozgási aktivitásának rögzítésére. Megmértük az összes színtábla reflexióját is (1. B ábra és A2. Táblázat).

Kísérleti beállítás a színpreferencia vizsgálatra zebrafish-ban. (A) A kísérleti beállítások vázlata és kép a kísérleti beállításokról, amelyeket a zebrafish színpreferenciájának mérésére használtak ebben a tanulmányban. (B) A luminométer helyzetének sematikus ábrázolása a felső és az alsó fényerősség mérésére. (C) A normál páros töltésű eszközről (CCD) (felül) és az infravörös CCD kamerákról (alul) gyűjtött képek összehasonlítása. (D) Kísérleti tervezés és a tanulmány konkrét céljai. (E) A tartály területét szemléltető vázlat színes lemezkombinációval és színes üres kialakítással.

A tartályméret-összehasonlító kísérletet egy 20 × 20 × 10 méretű, 1,5 literes és egy 30 × 30 × 10 méretű, 4,2 literes tartály összehasonlítására végeztük, amelyek azonos magasságúak: a vízzel töltött arány. A társadalmi interakció színpreferenciákra gyakorolt hatásának összehasonlításához összehasonlítottuk az egyetlen zebrafish halak úszási aktivitását egy tartályban, és egy zacskóból hat zebrafish-t, amelyek egy tartályban voltak. A nemi hatást az 5 hónapos hím és nőstény zebrafish színpreferenciák külön mérésével értékeltük. Az életkorfüggő színpreferencia-vizsgálatban használt zebrafish kor 3, 5 és 12 hónapos volt, és minden korcsoportban összesen 24 halat használtak. Az összes színpreferencia-vizsgálat során a zebrafish-okat a víztartályba helyeztük, és infravörös vagy hagyományos kamera segítségével 30 percig azonnal videofelvételt készítettünk. A kísérleti tartályban nem végeztek szoktatási időt, és ebben a vizsgálatban a zebrafish mozgást 30 percig elemezték. A Total Recorder szoftvert (High Criteria Inc., Richmond Hill, ON, Kanada) 1920 × 1080 pixel felbontású felvételre használták IR vagy hagyományos kamera segítségével.

2.3. Adatelemzés

A felvett videótól számított 30 percen belül a halak mozgását egy nyílt forráskódú idTracker szoftver segítségével elemeztük (Ver. 2.1, Cajal Institute, Madrid, Spanyolország) [23]. Az idTracker szoftver által kapott XY koordinátákat használtuk a zebrafish különböző partícióiban a megjelenési idők kiszámításához a Microsoft Excel segítségével. A választási index egyenletet használtuk a zebrafish színpreferenciák beállításainak kiszámításához [24,25].

2.4. Statisztika

3.2. 1. kísérlet: Fényforrás helyzete a Zebrafish színbeállításain

3.3. 2. kísérlet: A tartály mérete (állatsűrűség) a Zebrafish színbeállításain

Azt is felmértük, hogy a tesztelt állatok sűrűsége játszik-e fő szerepet a színpreferenciákban, ami az adatok megismételhetetlenségét okozhatja. E cél elérése érdekében a zebrak halakat különböző méretű konténerekben helyezték el, különböző hal/tartály terület arányban. Vagy a 20 × 20 × 10 cm-es tartályban (a hal/tartály aránya 1: 103, 3. ábra G) vagy a 30 × 30 × 10 cm-es tartályban (a hal/tartály arány 1: 224, 3. ábra H) mértük és hasonlítottuk össze. A felső és az alsó fényforrásokat egyaránt alkalmazták, hogy megszabaduljanak a megvilágítás esetleges következetlen tényezőitől. A hal/tartály arányt ImageJ szoftverrel mértük, relatív pixelterületük alapján. Megállapítottuk, hogy nem volt szignifikáns különbség sem a színpreferencia-rangsorban, sem az indexben, ha 20 × 20 × 10 cm-es vagy 30 × 30 × 10 cm-es tartályt használtunk a tesztelt összes színkombinációban (3. ábra A – F).

A különböző tartályméretek hatása a zebrafish úszási tevékenység választási indexére. (A) Zöld és kék kombináció,B) zöld és sárga kombináció,C) piros és kék kombináció,D) zöld és piros kombináció,E) piros és sárga kombináció,F) kék és sárga kombináció. (G,H) Vázlatok, amelyek két beállítást mutatnak be, különböző hal/tartály arányokkal a halsűrűség-hatás értékeléséhez. Az adatokat átlag ± SEM-ként adjuk meg, n = 24 minden csoportra. A különbséget egyirányú ANOVA-val teszteltük. n.s. = nem szignifikáns.

3.4. 3. és 4. kísérlet: Szociális interakció és nem a zebrafish színpreferencián

A mai napig a zebrafish színpreferenciájára gyakorolt lehetséges nemi hatással nem foglalkoztak megfelelően [11]. Ennek érdekében ivarérett hímeket és nőstényeket használtunk 6–8 hónapos korban a nemekkel kapcsolatos lehetséges színpreferencia-különbségek vizsgálatára (4. J ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy az ebben a vizsgálatban tesztelt hím és nőstény zebrak között nem volt szignifikáns különbség a színpreferenciában. A veleszületett színpreferencia rangsor és index nem mutatott szignifikáns különbséget a nemek között (4. B ábra). Ezért a későbbi kísérletek során vegyes nemű zebrakokat használtak színpreferencia-kísérletek elvégzésére.

3.5. 5. kísérlet: Age Effect on Zebrafish Color Preferences

A különböző korosztályok hatása a zebrafish színpreferenciára a tetején lévő fényforrás használatával. (A) Zöld és kék kombináció,B) zöld és sárga kombináció,C) piros és kék kombináció,D) zöld és piros kombináció,E) piros és sárga kombináció,F) kék és sárga kombináció. (G) Három beállítást bemutató vázlatok 3, 5 vagy 12 hónapos korú zebrakkal. A kísérletet hat zebrakkal hajtották végre egy tartály belsejében. Az adatokat átlag ± SEM-ként adjuk meg, n = 24 minden csoportra. A különbséget egyirányú ANOVA-val teszteltük, és a szignifikancia szintet * p A3 táblázatban állítottuk be. Néhány korábbi jelentés a helyi állatkereskedésből származó zebrafish-t használt, és a halak genetikai hátterének változása hozzájárulhat az irodalomban látható inkonzisztens színpreferencia-eredményekhez. Itt teszteltük a hipotézist azzal, hogy megvizsgáltuk a veleszületett színpreferenciát hat különböző zebrafish törzs, nevezetesen az AB, az abszolút, az arany, a TL, a PET és a WIK között. Az ebben a tanulmányban megállapított optimalizált állapot felhasználásával felfedeztük, hogy mind a hat zebrafish törzs azonos színpreferenciát mutat, és a rangsor a legkevésbé a piros> kék> zöld> sárga közé esik. Az egyes törzsek színpreferencia-indexe azonban szignifikáns különbséget mutatott az AB törzs megfelelőihez képest (6. ábra A – F).

3.7. 7. kísérlet: Az etanol hatása a zebrafish színpreferenciára

Beszámoltak arról, hogy a rhesusmajmok, a csirkék, a pulykák és az egerek elkerülik a vörös és a sárga színt. Ezeket a színek figyelmeztető jelként ismerhetik fel [41]. Beszámoltak arról, hogy a takarmány színe befolyásolhatja a zebrafish viselkedését [12]. A jelen tanulmányban felfedezett sárga elkerülése összhangban van a korábbi tanulmányokkal, amelyek azt mutatják, hogy a zebrafish általában elkerüli a sárgát [1,7,14]. A sárga fényintenzitása nagyobb, mint a többi színé, ami hozzájárulhat az elkerüléshez ebben a tanulmányban. Eközben azt tapasztaltuk, hogy a vörös hal a legelőnyösebb a zebrafish színpreferencia tesztünk alapján. Tanulmányok kimutatták, hogy az állatok gyakran a környezethez hasonló vagy azzal ellentétes színt részesítik előnyben [42,43]. Az állatok hajlamosak olyan közös színeket megközelíteni, amelyek segíthetnek a bőséges táplálék megtalálásában, míg a háttérrel kontrasztos szín előnyben részesítése segíthet az állatokban a pár minőségének felmérésében vagy a kevésbé gyakori erőforrások felkutatásában [44]. Ezenkívül a pirossal szembeni preferencia összefüggésben lehet az étrend színével (vörös színű pellet és artémia). Egy másik tanulmány azt is kimutatta, hogy a zebrafish veleszületett és viszonylag rugalmatlan színpreferenciákkal rendelkezik a vörös felé [2].

A depressziót és a szorongást összefüggésbe hozták az emberek színpreferencia-változásaival, és ezeket a változásokat már fiziológiai vizsgálatok során is használták a mentális állapot meghatározására [66]. Az etanollal kezelt halak csökkenték a választási indexet a kék-sárga kombinációban, hasonlóan a korábban közölt zebrafish depressziós viselkedéshez [14]. Megállapítottuk azt is, hogy az etanollal kezelt halaknál csökken a választási index a zöld-sárga kombinációban. Ismert, hogy az etanol szorongást és depressziót okoz hosszú távú használat esetén [67]. Ebben a tanulmányban bemutattuk a színpreferencia-vizsgálat lehetséges alkalmazását a kémiai toxikológia szempontjából egy viselkedési vizsgálatban.

5. Következtetések

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Candy Chennek a halgondozásban nyújtott segítségét, valamint a tajvani zebrafish core létesítményt az Academia Sinica (TZCAS) számára a zebrafish-ellátásért. Nagyra értékeljük Marri Jmelou Roldan-t, a Santo Tomasi Egyetem angol nyelvű szerkesztését a papír minőségének javítása érdekében.