Specifikus tápanyagokban gazdag szintetikus étrendek hatása a Drosophila fejlődésére, a testzsírra és az élettartamra

Tânia Reis

Orvostudományi Tanszék, Endokrinológiai, anyagcsere és cukorbetegség osztály, Colorado Egyetem Orvostudományi Egyetem, Anschutz Medical Campus, Aurora, Colorado, Amerikai Egyesült Államok

A kísérletek megtervezése és megtervezése: TR. Végezte a kísérleteket: TR. Elemezte az adatokat: TR. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemzési eszközök: TR. Írtam a dolgozatot: TR.

Társított adatok

Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Absztrakt

A gén-diéta interakciók döntő, de rosszul ismert szerepet játszanak az elhízásra való hajlamban. Ennek megfelelően a jelenlegi kutatások középpontjában az elhízásra hajlamos genetikai hátterű diéták hatásának tanulmányozására szolgáló, genetikailag kezelhető modellrendszerek kifejlesztése áll. Itt bemutatok egy módosított szintetikus Drosophila étrendet, amely optimalizálták a lárvák időben történő fejlődését, az energiatárolásnak szentelt szakaszt. Az egyes makrotápanyagok - szénhidrát, lipid vagy fehérje - szintjének emelése kifejezetten eltérő organizmális hatásokat eredményezett. A magas szénhidráttartalmú étrend hátrányosan befolyásolta a fejlődés időzítését, méretét, korai élettartamát és testzsírját. Feltűnő, hogy az étrendi lipidek mennyiségének megnégyszereződésével ezek a hatások nem voltak. A fehérjében gazdag étrendek tűntek a legelőnyösebbnek, mivel a lárvák gyorsabban fejlődtek, méretváltozás nélkül, hosszú életű felnőttekké. Úgy gondolom, hogy ez a szintetikus étrend jelentősen megkönnyíti a gén-diéta kölcsönhatások tanulmányozását a szervezet energiaegyensúlyában.

Bevezetés

Az elhízás aránya magas, és továbbra is emelkedik. Egyértelműen genetikai tényezők játszanak szerepet, de azt is tudjuk, hogy az étrendi trendek hozzájárulnak a betegség kialakulásához. Több állatmodellt fejlesztettek ki annak érdekében, hogy jobban megértsék az elhízás és az abból eredő anyagcserezavarok kialakulását és kialakulását, amelyek összetettsége mély kihívásokat jelent a kutatás számára. A gén-diéta interakciók (azaz, hogy a genetikai háttér hogyan befolyásolja az egyén reakcióját az adott étrendre) még bonyolultabbak, ezt mutatja az intervenciós étrend kimenetelének előrejelzésének nehézsége [1]. A testsúly-szabályozás szempontjából releváns étrend-összetevők általában a lipidek, szénhidrátok és fehérjék. Ezen komponensek relatív és abszolút mennyiségének manipulálása a modell organizmusok étrendjében számos egyéb hatással jár a testtömegre, a testzsírra, az általános anyagcserére és a hosszú élettartamra, más biológiai paraméterek mellett [1]. A genetikai háttér egyidejű változtatása az alapul szolgáló molekuláris útvonalak azonosításához azonban csak elfogulatlan genetikai szűrőknek megfelelő modellekben valósítható meg.

Asztal 1

a Vitaminok, ásványi anyagok és nukleinsavak

b gélképző szer

c Tartósítószerek stb.

d A nőstények átlagos élettartama.

e „n.d.”, nincs meghatározva.

f Hunt táptalaja Sang „meghatározott” táptalajából származik, de a kazein helyett egyes aminosavakat használ.

g az egyes összetevők tápanyagtartalma alapján, a gyártók által megadottak szerint; lásd a Bloomington Stock Center webhelyét (http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm).

Ebben a tanulmányban kidolgozok egy szintetikus Drosophila étrendet, amelyen a lárvák olyan ütemben fejlődnek, amely megközelíti a gazdag étrenden megfigyelteket. Meghatározom a specifikus makrotápanyagok (szénhidrátok, lipidek vagy fehérjék) növekedésének, fejlődésének, méretének, teljes testzsírszintjének, táplálkozási viselkedésének és élettartamának hatásait. Szénhidrátban gazdag étrenden a lárváknak megemelkedett a triacil-gliceridje (TAG), lassabban fejlődnek kisebb bábokká, és felnőttként megváltoznak az életkorral összefüggő mortalitás. Ezzel szemben a fehérjében gazdag étrenden a lárvák nem halmoznak fel extra TAG-okat, és gyorsabban fejlődnek méretváltozás nélkül, összehasonlítva a normál étrendet tápláló testvér-kontrollokkal. Ezek az eredmények hangsúlyozzák a kiegyensúlyozott étrend követelményét az optimális fejlődés, növekedés és élettartam érdekében.

Anyagok és metódusok

Légykészletek és tartás

A Wildtype Oregon R legyeket eredetileg a Bloomington Stock Center-től szerezték be (készletszám: 4269), és több generáció óta fenntartják őket a laboratóriumban. A kifejlett legyek 25–6 ° C-on 25 ° C-on hagytak tojást tojni szőlőlé-lemezekre, élesztőpéppel. 24 órával a kikelés után 50 első stara lárvát vittünk át minden egyes szintetikus táptalaj injekciós üvegbe. Az összes kísérleti állatot 25 ° -os inkubátorban tartottuk.

Szintetikus tápanyagok

99% -ban azonos; a termék így 87–94% fehérjét tartalmaz, amelynek aminosav-összetétele

99% meghatározott. A táptalajokat folyadékciklus segítségével 30 percig autoklávoztuk, és a Tegoseptet csak autoklávozás után adtuk hozzá. A kazein ülepedésének megakadályozása érdekében a táptalajt hűtés közben és öntés előtt kevertük.

Triglicerid és fehérje mérések

Az egyes kísérleti állapotokból származó 25 Oregon R lárvát mozsárban mikrocentrifuga csőben homogenizáltuk és 5 percig centrifugáltuk 13.200 fordulat/perc sebességgel. 8 μl felülúszót átvisszünk egy friss csőbe, és újra centrifugálunk 5 percig 13 200 fordulat/perc sebességgel. Ebből a mintából 5 μl-t használtunk fel a TAG-tesztben egy triglicerid-reagens készlet (Sigma, T2449) felhasználásával, a gyártó utasításai szerint. 1 μl mintát használtunk fel a Protein Assay Kit II-ben (BioRad, 500–0002), a gyártó ajánlása szerint. A TAG-szinteket az oldható fehérje szintjére normalizáltuk. Három független vizsgálatot (egyenként 25 lárvából) hajtottak végre minden kísérleti körülményhez. A statisztikai tesztek elvégzéséhez a Graphpad Prism v6 szoftvert használtuk.

Nílus vörös festés

A lárvákat megfordítottuk, hogy a zsírtestek megjelenjenek, és 8% paraformaldehiddel rögzítettük (Electron Microscopy Sciences, 15710) 45 percig. A boncolt testeket háromszor mostuk 0,1% -os PBTritonnal, és 0,25 μg/ml Nile Red-rel (Molecular Probes, N1142) PBS-ben festettük 30 percig. Háromszoros 0,1% -os PBTriton-os mosás után a testtesteket SlowFade szerelőközegben (Molecular Probes, S36936) csúsztatták a tárgylemezekre a fehérítés csökkentése érdekében. A képeket konfokális mikroszkóp segítségével nyertük.

Méretek

A meghatározott étrenden nevelt lárvákból származó bábokat féknyereggel mértük. Minden kísérleti körülményhez 54 bábot mértünk. A Graphpad Prism v6 szoftvert használták a szokásos egyirányú ANOVA teszt elvégzésére.

Az eclózió mértéke

Az eclóziós értékeket minden egyes fiolához mértük, annak időtartamát (napokban), amíg az első felnőttek kizárták a pupilla eseteit. Az értékeket naponta rögzítették reggel és este. Legalább 230 állat (7 injekciós üveg

Mindegyik 50 állatot) elemeztük minden kísérleti körülményhez.

Táplálékbevitel

A lárvák táplálékfelvételét a korábban leírtak szerint mértük [3], azzal a különbséggel, hogy a kísérleti étrenden nevelt lárvákat 30 percig ugyanazon étrendnek tettük ki, amelyhez színes festéket adtunk. Három független vizsgálatot végeztek összesen 60 állaton kísérleti körülmények között, és a Graphpad Prism v6 szoftvert alkalmazták a szokásos egyirányú ANOVA teszt elvégzésére.

Élettartam-elemzés

A specifikus étrendre beoltott lárvákat 24 órán át hagyták lezárni, majd 48 órán át párosodni. A nőstényeket friss fiolákba helyezték ugyanazon étrenddel, amelyen nőttek. A haláleseteket naponta rögzítették. Legalább 300 legyet elemeztek kísérleti körülmények között, a Graphpad Prism v6 szoftver segítségével statisztikai elemzést (Log-rank (Mantel-Cox) és Gehan-Breslow-Wilcoxon tesztek). A legyeket 2-3 naponta friss táptalajú fiolákba helyeztük. A régi fiolákat tartották, és a termékenység felmérése érdekében értékelték a beléjük rakott petékből kizáródó állatokat.

Eredmények

Első lépésként az étrendi összetételnek az organizmusok energiamérlegében betöltött szerepének boncolgatása felé dúsított étrendeket dolgoztam ki a szintetikus légyételek receptje alapján [16] (lásd: Anyagok és módszerek). Sang „meghatározott” táptalaja a Drosophila kultúrához jelentős késleltetést idéz elő a fejlődésben - akár 2 napos késést is okozhat a lárvák vándorlásában a laboratóriumi állomány táplálékához képest - és alacsony az eklózió mértéke (az adatokat nem közöljük). Észrevettem, hogy Sang meghatározott étrendjének egyetlen alkotóeleme (azaz szénhidrát, lipid vagy fehérje) koncentrációjának növelése felgyorsítja a lárvák fejlődését és az eklózió mértékének növekedését (publikálatlan megfigyelések). Ennek megfelelően feltételeztem, hogy ezek az összetevők némileg korlátozzák Sang „meghatározott” étrendjét, és módosított recepteket teszteltem, amelyek során az összes összetevő koncentrációját különböző mértékben (1,33–2,67-szeresére) növelték az eredeti recepthez képest. Ezek a táptalajok szilárdabb konzisztenciájúak voltak a csökkent vízkoncentráció miatt, ezért csökkentettem a gélképző szer (agar) koncentrációját (1. táblázat). Megállapítottam, hogy míg a lárvák 2,67x több szacharózt és 2x több egyéb összetevőt tartalmazó étrenden fejlődtek a leggyorsabban, diétával

1,75x több szacharóz és

1,33x több a többi komponensből (1. táblázat), a vándorlás időtartama összehasonlítható volt a melasz/élesztő alapú alapételekkel, és az eklózió mértéke a legmagasabb (az adatokat nem mutatjuk be, és lásd alább).

Ezután konkrétan növeltem a lipidek, szénhidrátok vagy fehérjék relatív bőségét, és figyeltem az energia homeosztázis különböző paramétereire gyakorolt hatásokat lárvákban és felnőttekben. A vad típusú első instar (L1) lárvákat négy különböző étrenden növesztették: normál (N) és N-származékok, amelyekben egy adott makrotápanyag – lipidek (4L), szénhidrátok (4C) vagy fehérjék (4P) koncentrációja megnégyszereződött. . Az embriókat szőlőlemezekre gyűjtöttük, hagytuk kikelni és az L1-eket a megfelelő táptalajra helyeztük, és hagytuk fejlődni vándorlásig vagy felnőtt szakaszig.

A lárvákat kiegyensúlyozott (N), szénhidrátban gazdag (4C), lipidekben gazdag (4L) vagy fehérjében gazdag (4P) táplálékkal etették. (A-C) A lárva kivonatokat elemeztük (A) összes TAG-ra, (B) összes oldható fehérje vagy (C) összes TAG-ra normalizálva az oldható fehérje szempontjából. (D) A lárvák zsírtartalmát utólag rögzítettük a zsírspecifikus Nile Red (vörös) festék után. A 4C és 4L étrendben növesztett lárvák zsírtestjei sejtenként magasabb zsírszintet mutatnak (nyíl), és általában a zsír „szivárgását” mutatják az izolált szövetből (nyílfej). A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek (P 0,05) a diéták között, míg a Welch-korrigált t teszt csak az N-4C összehasonlításban talált szignifikanciát (P = 0,0218).

Más állatokhoz hasonlóan a gyümölcslegyek is ízlés alapján táplálkozási preferenciákat mutatnak [20], amelyeket az étrendi összetétel jelentősen megváltoztathat. Ezenkívül bizonyos étrendek könnyebben kiválthatják a jóllakottságot, mint más étrendek. A szénhidrátban gazdag étrendet fogyasztó állatoknál megfigyelt megnövekedett zsír így az étrend bevitelének növekedését vagy alternatívaként az étrendi energia fokozott tárolását tükrözheti. Lárvákban mértem az élelmiszer-fogyasztást. A kísérleti étrenden kikelt lárvákat 30 percig ugyanazon étrendnek tettük ki, amelyhez színes festéket adtak [3]. Az ételfesték mennyiségének mérésével a lárva homogenátumában [3] megállapítottam a P-tartalmú táplálékkal etetett állatok etetésének csökkenési tendenciáját, de ez a különbség statisztikailag nem volt szignifikáns (2. ábra). Ezek az eredmények összhangban vannak más rendszerekben végzett vizsgálatok eredményeivel, amelyekben az étrend fehérjetartalma úgy tűnik, hogy jóllakottsági jeleket vált ki [10, 21, 22]. Nem tapasztaltunk különbséget az N, 4C vagy 4L étrendben elfogyasztott élelmiszer mennyisége között (2. ábra). A lárvák táplálékfogyasztásában a fő különbségek hiánya arra utal, hogy az etetési magatartás legfeljebb kis mértékben járul hozzá a különböző étrendet tápláló lárvák megfigyelt metabolikus változásaihoz (1. ábra).

A jelzett étrenden nevelkedett állatoknak meghatározott ideig vörös színű táplálékkal etetniük kellett. A homogénben lévő vörös ételfesték mennyiségét abszorbanciaként mértük 520 nm-en. Étrendenként 20 lárvát elemeztek 30 perces etetési periódus után a jelzett szintetikus étrenden. Nincs szignifikáns különbség, ha azt a szokásos egyirányú ANOVA észleli. Hibasávok, szórás.

(A) A tojásrakástól a felnőtt legyek eklóziójáig tartó időtartam (napokban) a jelzett étrenden. 7 független kísérletet hajtottak végre (összesen ≥ 230 állat kísérleti feltételenként). (B) Az (A) pontban szereplő átlagértékeket kivontuk az N-diétán mért átlagos időtartamból. (C) A legkülönbözőbb étrenden növesztett legyeknek (n = 54 állapotonként) a bábfázisokig hagytak fejlődni, ekkor féknyerget használtak testhosszuk mérésére. A csillagok jelentős különbségeket jeleznek (P 4A ábra). A 4C diétával táplált legyek szokatlan bimodális eloszlást mutattak, rövid életű és hosszú életű populációból (4B. Ábra). Nem tapasztaltunk különbséget az N és a 4L étrend között. Az N és 4P étrend összehasonlításával azonban azt tapasztaltam, hogy a legyek később kezdenek elpusztulni egy 4P étrenden, a medián túlélés két nappal meghosszabbodott az N étrendhez képest (4. ábra), és a teljes túlélésben statisztikailag szignifikáns különbség volt (Gehan-Breslow -Wilcoxon-teszt P = 0,0013). A Drosophila és a legtöbb más faj esetében a szaporodás korlátozza az élettartamot, ami látszólagos „kompromisszumot” jelent [27]. Különösen azt figyeltem, hogy új felnőtt állatok záródtak-e be az ampullákba, amelyekben a legyek tojást raktak le 2-3 napos időszak alatt, és nem találtam nyilvánvaló különbséget a termékenységben ezen szintetikus étrendek között (az adatokat nem közöltük).

A felnőtt legyek hosszú élettartama a jelzett étrendet etette. étrendenként n ≥ 352. (A) Túlélési görbék. A log-rank (Mantel-Cox) teszt azt mutatja, hogy a görbék jelentősen eltérnek (P = 0,0048). Medián élettartam (nap); N, 63; 4C, 69; 4L, 63; 4P, 65. (B) Az egyes élettartamok hisztogramjai.

Vita

A Drosophila energia-anyagcserére összpontosító tanulmányok gyakran dúsított étrendet alkalmaznak, amelyet úgy hoznak létre, hogy meghatározott összetevőket adnak hozzá egy nem meghatározott étrendhez. Ennek a megközelítésnek jelentős korlátai vannak. Emlős rendszerekben például a különböző szénhidrátok és zsírok arányának teszteléséhez gyakran szükség van egyetlen összetevő szintjének csökkentésére a „szokásos” étrendben található mennyiség alatt, miközben az egyéb összetevők standard szintje megmarad [28]. Bár még nem vizsgáltam az étrendi összetevők csökkentésének hatásait, az itt leírt étrendek megkönnyítik ezt a fajta megközelítést Drosophila-ban.

Sőt, lehetetlen meghatározni az étrendi komponens végső koncentrációját, ha egy adott összetevőt egyszerűen hozzáadnak egy meghatározatlan étrendhez. Az étrend által kiváltott szívbetegségek Drosophila-modelljében az étrendi lipidtartalom kókuszolaj, lipidekben gazdag (meghatározatlan) összetevő hozzáadásával növekedett [9]. Minimális szervezeti hatásokat figyeltek meg 30% kókuszolaj alatti koncentrációknál [9]. Figyelembe véve, hogy az étrendi lipidtartalmat négyszeresére tudtam emelni anélkül, hogy az élettartamra vagy a fejlődési időzítésre gyakorolt észrevehető káros hatások lennének, becsülhető, hogy a „magas zsírtartalmú”/„magas zsírtartalmú” lipidtartalomban megfigyelhető változások kiváltása érdekében ”A 30% kókuszolajon alapuló étrend, az étrendi lipidtartalomnak lényegesen több mint négyszeresére kell emelkedni, és/vagy a hozzáadott lipidforrásnak nagyobb arányban tartalmaznia kell a specifikus tárolást elősegítő molekulákat (pl. TAG-ok). Az emberi populációk magas zsírtartalmú/magas lipidtartalmú étrendje valószínűleg nem képes ekkora zsírdúsulást elérni.

A meghatározatlan étrenddel végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az élesztő arányos kalóriabevitelének növelése sovány legyeket eredményezett, míg amikor ugyanannyi kalóriát biztosítottak elsősorban cukorból, a triacil-gliceridek növekedtek [10]. Azt is megállapították, hogy az élesztő: szacharóz arány fontos volt az optimális élettartam szempontjából, mivel ennek az aránynak a növelése csökkentette az élettartamot [10, 23], de megnövelte a termékenységet [10]. Az étkezési élesztő fehérjéjénél önmagában valaminek kell lennie a releváns komponensnek ebben az arányban, mivel a 4P étrendem megnövelte az élettartamot, a magas fehérje: szacharóz arány ellenére. Ugyanakkor a magas fehérjetartalmú, alacsony szénhidráttartalmú étrend megnövekedett élettartama szintén nem felel meg az egerek [29] és az emberek [30] közelmúltbeli eredményeinek. Mások kimutatták, hogy az egyes aminosavak bőségesen hozzájárulnak a hosszú élettartamhoz [31], és ezáltal fontos változó a jövőbeli vizsgálatok során is. Például az itt közölt étrendekben lévő kazein helyettesíthető az egyes aminosavak specifikus kombinációival.

A 4C-vel táplált felnőttek élettartamának szokatlan bimodális megoszlása az egyének két csoportját tükrözheti: az egyik populáció a fejlődés és a korai felnőtt élet során tapasztalt megnövekedett zsír káros hatásainak engedelmeskedett, míg mások, akik elég sokáig éltek túl, bizonyos öregkori az extra tárolt energia életkori sajátosságai. A legújabb, emberen végzett vizsgálatok szerint az étrendre vonatkozó követelmények az életkor előrehaladtával jelentősen megváltoznak [30].

Összefoglalva, az itt ismertetett étrendek további lehetőséget kínálnak a Drosophila szervezetben zajló anyagcsere különböző paramétereire gyakorolt makrotápanyagok hatásának elemzésére.

segítő információ

S1 ábra

20 nőstére rakott tojások 4 órás időközönként. Minden étrendre vonatkozóan az adatok három független petesejt-gyűjteményt mutatnak, mindegyik felnőtt két független (8–10 napos) populációból. A csillagok jelentős különbségeket jeleznek (P (40K, jpg)

Köszönetnyilvánítás

Szeretnék köszönetet mondani Iswar Hariharannak és a Hariharan Laboratóriumnak, ahol ez a munka elkezdődött, valamint Michael McMurray-nak a kézirat szerkesztésében nyújtott segítségért.

Finanszírozási nyilatkozat

Ezt a munkát az Országos Egészségügyi Intézetek (1F32DK077401 és NIDDK K01DK095932) és az American Heart Association (12BGIA11930014) támogatásai támogatták.

Adatok elérhetősége

Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.