Szinergikus katalízis: „Polimer mikrozimek és szervetlen nanozimek”: Az 1 + 1> 2 hatás a peptidek intramolekuláris ciklizálására

Zhiliang Chen

1 Kulcsfontosságú Környezetvédelmi és Egészségügyi Laboratórium, Oktatási Minisztérium és Környezetvédelmi Minisztérium, valamint Környezetegészségügyi (inkubációs) állami laboratórium, Közegészségügyi Iskola, Tongji Orvosi Főiskola, Huazhong Tudományos és Műszaki Egyetem, Wuhan, Kína

Börje Sellergren

2 Orvostudományi Tanszék, Egészség- és Társadalomtudományi Kar, Malmö Egyetem, Malmö, Svédország

Xiantao Shen

Absztrakt

Ebben a munkában kidolgoztunk egy hatékony „molekulárisan lenyomatozott polimer mikrozimokat és szervetlen mágneses nanozimeket” szinergikus katalízis stratégiát a diszulfidkötések kialakulásához a peptidekben. A polimer mikrozimek kiváló szelektivitást mutattak a templát peptiddel, valamint a fő reaktánssal (lineáris peptid) szemben, a Fe3O4 mágneses nanorészecske (MNP) nanozimek pedig gátolták az intermolekuláris reakciót a peptidekben lévő diszulfidkötések kialakulása során. Ennek eredményeként a két különböző mesterséges enzim egy folyamatba történő integrálása megkönnyíti az intramolekuláris ciklizációt nagy termékhozamokkal (59,3%), kiváló szelektivitással. A mechanizmus vizsgálata azt jelzi, hogy a szinergikus hatás egy „fordított szilárd fázisú szintézis” stratégia alkalmazásával történt, a reakcióegyensúly fokozottabb elmozdulásával a termékgenerálás felé. Úgy gondoljuk, hogy a jelen munkában bemutatott „polimer mikrozimek és szervetlen nanozimek” szinergikus katalízise új lehetőségeket nyithat a multifunkcionális enzimmimikumok létrehozásában az érzékelés, a képalkotás és a gyógyszerbeadás érdekében.

Bevezetés

Növekedési hormon gátló hormonként a tetradekapeptid szomatosztatin (SST) széles körben megtalálható az állatok testszerveiben (például az agyszövetben, a gyomor-bélrendszerben és a hasnyálmirigyben; Brazeau és mtsai., 1974). A diszulfidkötés jelenléte miatt az SST stabilabb diszulfidban gazdag ciklikus peptidként ismert, különféle fiziológiai funkciókkal és orvosi értékekkel, mint a lineáris peptidek (Ginj et al., 2006). Általában az SST gátolhatja a gyomor és a hasnyálmirigy szekrécióját, stimulálhatja a nyálka szekrécióját, csökkentheti a portális vénás nyomást, ellazíthatja az epe záróizomzatot, a mononukleáris makrofág rendszer stimulálásával enyhítheti az endotoxémiát, gátolhatja a thrombocyta-aktiváló faktor felszabadulását, közvetlenül vagy közvetetten szabályozhatja a citokin láncot védi a sejtet (Hocart et al., 1998). Ezért az SST mesterséges szintézise vegyi üzemben különösen érdekes a gyógyszerészeti alkalmazásokban (Wu et al., 2001).

A szakirodalom szerint a diszulfidhidakkal ellátott SST-t általában folyadékfázisú vagy szilárdfázisú módszerrel szintetizálják (Martín-Gago et al., 2014). Mindkét módszerben az utolsó lépés a peptidek intramolekuláris ciklizálása a két stratégiailag kiválasztott ciszteincsoport (Cys) között. Ennek az utolsó lépésnek az általános módszerei (a Cys diszulfid-hidakká történő oxidációja) azonban a következő problémát vetették fel: a lineáris peptidek könnyen képezhettek melléktermékeket, például dimerizációt vagy oligomerizációt. Az oxidációs folyamat szabályozása és így a kívánt termékek megszerzése érdekében a lineáris peptid koncentrációjának csökkentése és az oxidációs állapot beállítása volt a fő módszer a peptidek ciklizációjának hozamának javítására (Cheneval et al., 2014).

A lineáris peptid koncentrációjának csökkentése hatékony módszer a melléktermék-képződés csökkentésére. Ez a módszer azonban csökkentette a termék mennyiségét is. A közelmúltban bemutattunk egy interfaciális katalízis rendszert, amely molekulárisan nyomott polimer (MIP) mikrogéleket (MG) stabilizált Pickering emulziókat használt. Ez a Pickering emulziós rendszer fokozta a termelékenységet, miközben elnyomta a melléktermékek képződését az SST szintézise során. A MIP MG-k, amelyek a kiválasztott „templát” molekulához való affinitással rendelkeznek a polimer mátrix üregeivel, szelektíven elősegítették az SST intramolekuláris ciklizációját (Shen és mtsai, 2016). Jelen munkánkban az oldatban lévő peptidek intramolekuláris ciklizálását folytatjuk le azáltal, hogy enzimutánzóként (polimer mikrozimek) használjuk a beillesztett MG-ket. A melléktermékek képződésének elnyomása mellett ebben a munkában további előnyöket mutatunk be a peptidek MIP-ek alkalmazásával történő ciklizálásában.

Az oxidációs feltétel beállítása a diszulfidkötések kialakulása során a lineáris peptidek dimerizációjának vagy oligomerizációjának csökkentésének második módja. Hagyományosan a levegőt, a kálium-ferricianidot, a jódot, a hidrogén-peroxidot (H2O2), a dimetil-szulfoxidot (DMSO) és a tallium-trifluor-acetátot gyakran használták oxidálószerként a Cys diszulfid-hidakká történő oxidációja során (Bulaj, 2005). Úgy tűnik azonban, hogy ezek az oxidálószerek nagyon kemények a természetes oxidázokhoz képest, bár a lineáris peptidek koncentrációja nagyon alacsony. Ezért egy enzim-utánzó nanokatalizátort (nanozimeket), amely oxidációs körülményeket képes biztosítani a természetes oxidázokhoz képest, szintén be kell vezetni a diszulfidkötések kialakulásába a peptidekben a jelen tanulmányban.

Ezeknek a munkáknak az inspirációjaként a szervetlen Fe3O4 MNP-k peroxidáz-szerű aktivitását fogjuk használni, hogy új peroxidáz-szerű anyagként működjön a lineáris peptid ciklizálásához. A diszulfid hídképződés hagyományos oxidáló reagenseivel összehasonlítva az MNP nanozimek inkább hasonlítanak egy természetes oxidázra, és az enzimszerű oxidáló reakció közel fiziológiai körülmények között megkönnyíti az SST képződését. Másrészt az L-SST oxidációs állapota szabályozható, mivel a rendszer oxidáló képessége a H2O2 MNP-ken történő adszorpciójától függ.

Ezért ebben a munkában egy új módszert javasolunk az SST alacsony költségű és hatékony ciklizálására a MIP mikrozimek és az MNP nanozimek integrálásával. A polimer mikrozimek és a szervetlen nanozimek különböző előnyökkel járnak a lineáris peptidek diszulfidkötéseinek kialakulásában. A ciklizálás során a lineáris peptideket két különböző mesterséges enzim egyszerre aktiválja egyetlen kémiai átalakulás végrehajtása céljából. Ez a szinergikus katalízis tovább javítja a reakció aktivitását és a katalitikus szelektivitást.

Anyagok és metódusok

Anyagok

A monomereket, az N-izopropil-akrilamidot (NIPAm), az N-terc-butil-akrilamidot (TBA), az akrilsavat (AA) és az N, N'-metilén-bisz (akrilamidot) (MBA) a Sigma-Aldrich-től szereztük be. Az N, N, N ', N'-tetra-metil-etilén-diamint (TEMED), az ammónium-perszulfátot (APS) és a ditiotreitolt (DTT) a Sigma-Aldrich szállította. FeCl3 • 6H2O, FeSO4 • H2O, NH3 • H2O (25%) és olajsavat a Tianjing Chemical Reagent Company cégtől kaptunk. SST (H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, molekulatömeg: 1638) és lineáris szerkezete (molekulatömeg: 1640) és dezmopresszint (Mpr-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2, molekulatömeg: 1069) és lineáris szerkezetét (molekulatömeg: 1071) a WuHan Moon Biosciences Co., Ltd. Referencia szomatosztatin (rSST, Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr -Ser-Cys, molekulatömeg: 2375) szintén a WuHan Moon Biosciences Co., Ltd. cégtől kapta.

Fe3O4 MNP-k szintézise (szervetlen nanozimek)

A szervetlen nanozimeket ugyanezen módszer szerint állítottuk elő korábbi munkánkban (Tang et al., 2012). Röviden: 4,86 g FeCl3 • 6H2O és 3,34 g FeSO4 • 7H2O, valamint 40 ml desztillált vizet homogenizálunk és 90 ° C-ra melegítünk. Ammónium-hidroxid (12 ml) és olajsav (0,8 ml) hozzáadása után a reakciórendszert mágneses keverés közben 3 órán át 90 ° C-on tartjuk. A kapott olajsavval bevont MNP-ket etanollal, illetve desztillált vízzel mossuk. Amikor a mosóoldat semleges elválasztású volt, az MNP-ket 24 órán át vákuumban szárítottuk. Az MNP-ket üvegpalackban tárolták (amelyet a fény megvilágításának elkerülése érdekében alumínium papírral borítottak).

MIP mikrogélek (polimer mikrozimek) szintézise

A polimer mikrozimeket az előző cikkünkben ismertetett módszerrel szintetizáltuk (Shen et al., 2016). Röviden: először egy homogén oldatot kaptunk 20,7 μl AA, 217,3 mg NIPAm, 61,0 mg TBA és 46,3 mg MBA, 6,8 mg SST templát és 20 ml PBS puffer (pH 7,4, 20 mM) összekeverésével. A reakciórendszerben lévő részecskéket 0,45 μm-es szűrőn távolítottuk el. Miután hozzáadtunk 20 μL APS-oldatot (10%) és az O2-t nitrogénbuborékoltatással eltávolítottuk a rendszerből, a reakciórendszert rázás közben 3 órán át 50 ° C-on tartottuk. A második lépésben 120 μL APS-oldatot (10%) és 60 μl TEMED-et adunk a reakcióoldathoz. Az iniciátor-kiegészítés befejezése után a polimerizációs rendszert ismét rázás közben 1 órán át 50 ° C-ra helyeztük. A polimer MG-ket dialízissel tisztítottuk 1 liter tiszta víz alkalmazásával 3 napig, 1 liter vízzel, amely 3 ml 4 M sósavat tartalmazott 3 napig, és 1 liter tiszta vizet 2 napig egymás után. A mosóoldatot naponta több mint négyszer cserélték.

A MIP MG-kből származó peptid szivárgását szobahőmérsékleten spektrofluorométerrel mértük (F-97 Pro, Shanghai Lengguang Technology Co. Ltd., Kína). Az SST gerjesztési és emissziós hullámhossza 280, illetve 356 nm volt. A mosási lépés akkor fejeződött be, amikor a felülúszóban nem mértünk SST-t. A MIP MG oldatot vízzel 9,0 mg ml-1-re hígítottuk (száraz polimer) további alkalmazás céljából. A szintézis során sablonok hiányában a NIP MG oldatot is előállítottuk.

Jellemzés

Az MNP nanozimek mágneses tulajdonságait rezgő mintamagnetométerrel (ADE 4HF VSM) teszteltük. A polimer MG-k morfológiáját pásztázó elektronmikroszkóppal mértük (Inspect SEM F50, FEI Company). Az MNP-k és a nedves MG-k méreteloszlását dinamikus fényszórás (DLS) alkalmazásával értékeltük Coulter LS230 készülékkel (Beckman-Coulter Co. Ltd.). Az MNP-k és az MG-k részecskekoncentrációja a tesztelés során 0,1 mg mL -1 volt.

Kötés és szelektivitás teszt

A MIP MG molekuláris felismerési képességét úgy is megvizsgáltuk, hogy a polimer (5,4 mg száraz MG-t tartalmazó) MG-oldatot és az SST-t (különböző koncentrációban) 1,5 ml-es Eppendorf-csőben inkubáltuk. 16 órás szobahőmérsékleten történő inkubálás után a polimer MG-ket 15 percen át 14 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással izoláltuk. A felülúszó SST-koncentrációját ezután spektrofluorométerrel elemeztük. A gerjesztés és az emisszió hullámhossza 280, illetve 356 nm volt. A polimer MGS-hez kötött SST mennyiségét a fluoreszcencia intenzitás csökkenésével számítottuk a kötés előtti oldathoz képest. Az SST egyensúlyi adszorpciós kapacitását (qe, mg g −1) a polimer MG-k segítségével a következő egyenlet segítségével számítják ki:

ahol C0 és Ce az SST egyensúlyi koncentrációja (mg mL -1) az adszorpció előtt (kezdeti) és után. v és m az SST oldat térfogata, illetve a száraz MG tömegmennyisége.

A MIP MG-k szelektivitásának teszteléséhez a referencia-peptidek (köztük az L-SST, rSST, DDAVP és MSH) kötődését vizsgáltuk. Az L-SST, rSST és MSH koncentrációit ugyanazon módszerrel mértük az SST-hez. A DDAVP koncentrációját HPLC alkalmazásával határoztuk meg diódasoros detektorral (Chen és mtsai., 2016). A DDAVP HPLC-módszere egy korábbi munkát követett (Christophersen et al., 2014).

Katalízis vizsgálat

Eredmények és vita

Az anyagok jellemzése

A csapadékpolimerizáció programozott iniciátorcsere-stratégiával hatékony módszer volt a MIP MG szintézisére (Meng et al., 2009). A száraz MG-k morfológiáját pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) figyeltük meg. Az 1. ábrán látható, hogy a száraz MIP és a NIP MG egyaránt gélszerű polimer volt. A SEM és DLS mérések felhasználásával korábbi munkánk kimutatta, hogy a MIP MG-k száraz átmérővel rendelkeznek

100 nm és nedves átmérője

280 nm, ill. Ha a részecskék gömb alakúak, a MIP MG duzzadási aránya megegyezik

20. Ez a magas duzzadási karakter elegendő csatornát biztosít a MIP MG-k számára a peptid diffúzióhoz.

MEM MG-k SEM képei a) és NIP MG-k b) üvegcsúszdára öntve.

Korábbi munkánk kimutatta, hogy az MNP nanozimek 10 és 20 nm között mozogtak TEM elemzés segítségével (Tang et al., 2012). Itt ezt a méreteloszlást a 2A 2A. Ábrán látható DLS-méréssel igazolták (

12 nm). Az MNP nanozimek mágneses jellemzőit VSM méréssel rögzítettük. A 2B 2B ábrán látható, hogy az MNP nanozimek szuperparamágneses aktivitásokat tártak fel, az MNP nanozimek telítettségi mágnesezettségének (Ms) értékei

60 emu g −1. A 2C 2C ábra azt mutatja be, hogy az MNP nanozimákat könnyen el lehet különíteni egy külső mágneses mezővel.

(A) MNP nanozimek DLS elemzése metanolban; (B) Az MNP nanozimek VSM mérése; (C) A vízben szuszpendált MNP nanozimek fényképei külső mágneses tér hiányában (balra) és jelenlétében (jobbra).

A polimer mikrozimek kötési profiljai

A polimer mikrozimok SST felismerését fluoreszcencia spektrometriával vizsgáltuk. A 3. ábra a 3. ábra mutatja az SST kötési izotermáját (15 és 120 μmol L -1 között) a MIP MG-ken. Kontrollként az SST kötő izotermáját is elvégeztük a NIP MG-k és az MNP nanozimek esetében. Látható, hogy az SST kötését az MNP nanozimok elhanyagolták. Mindkét polimer MG esetében az SST kötési képessége az SST koncentráció növekedésével nőtt. A NIP MG-khez képest azonban a MIP MG-k sokkal nagyobb sablonfelvételt mutattak.

Az SST kötő izotermái MIP mikrozimeken, NIP MG-k és MNP nanozimek. A részecskekoncentráció 5,4 mg mL -1 volt .

Korábbi munkánkban négy peptidet választottak ki referenciának, beleértve az L-SST-t, a referencia-szomatosztatint (rSST), a dezmopresszint (DDAVP) és a melanocita-stimuláló hormont (MSH) a polimer mikrozimek szelektivitásának vizsgálatára. Megjegyezzük, hogy az L-SST és az rSST az SST sablon analógja, míg a DDAVP és az MSH nem. Ezért a négy különböző szerkezeti hasonlóságú kontroll peptid kiválasztása megfelelő volt a MIP MG-k felismerési szelektivitásának vizsgálatához. A kísérleti adatok azt mutatták, hogy a polimer mikrozimek nagyobb kötési kapacitást mutattak az SST, L-SST és rSST felé, mint a NIP MG-k. A polimer mikrozimek szelektivitásának tendenciája az SST> L-SST> rSST> DDAVP> MSH sorrendben volt, ami ezen peptidek szerkezeti hasonlóságának köszönhető (Shen és mtsai, 2016). Meg kell jegyezni, hogy a polimer mikrozimák szelektivitást mutattak az L-SST (a termék fő reaktánsai) iránt is, amelyek jelentős szerepet játszanak az L-SST ciklizálása során.

Szinergikus katalízis vizsgálat

A „polimer mikrozimek és szervetlen nanozimek” szinergetikus katalízisét a lineáris peptidek diszulfidképződése szempontjából hajtották végre. Először is, a lineáris peptidek ciklizálása során a melléktermék képződést MALDI analízissel vizsgáltuk. Korábbi munkánkban bebizonyítottuk, hogy az oxidáló reagens L-SST oldathoz való hozzáadásával végzett keverékrendszerek polimer MG jelenlétében/hiányában magas peptid dimer hozamot mutattak (Shen és mtsai, 2016). Ezt a 4A 4A ábra is megerősítette, amikor jód helyett H2O2-t alkalmaztak oxidáló reagensként (a H2O2 + MIP mikrozimokkal megegyező tiszta H2O2 adatait itt nem mutattuk be). Amikor azonban MNP nanozimeket vezettek be az oxidáló rendszerbe, a peptid dimereket nem figyelték meg a H2O2 + MNP nanozimek (4B ábra (4B ábra) 4B) és H2O2 + MNP nanozimek + MIP mikrozimek (4C ábra) rendszerekben. ). Megjegyezzük, hogy a peptid dimereket a H2O2 + MNP nanozimek + NIP MG-k rendszerében sem találtuk (az adatokat itt nem mutattuk be). Ezért arra a következtetésre jutunk, hogy az MNP nanozimek alkalmazása hatékony módszer az intermolekuláris reakció gátlására a peptidekben diszulfidkötések kialakulása során.

Az SST és a melléktermékek MALDI-analízise 30 perces H2O2 reakció után, (A) H2O2 + MNP nanozimek, (B) és H2O2 + MNP nanozimek + MIP mikrozimek. (C) A peptidkoncentráció a vízfázisban 120 μM volt. m/z 1639: SST + H +; m/z 1491: SST elveszett Cys maradék; m/z 1660 és 1661: SST + Na +; m/z 3278: SST dimer + H + .

Az L-SST koncentráció időbeli lefolyása (A) és az L-SST ciklizációs kinetikája (B) MNP nanozimek jelenlétében polimer mikrozimákkal vagy anélkül. Az MNP nanozimeket 30 perc egyensúlyi idő után adtuk a polimer mikrozimekhez. A H2O2 + MNP nanozimek (1), a H2O2 + MNP nanozimek + NIP MG-k (2) és a H2O2 + MNP nanozimek + MIP mikrozimek (3) ál-elsőrendű állandói 0,048, 0,058 és 0,084 perc -1, illetőleg.

Harmadszor, az S-termék L-SST-ből származó hozamát vizsgálták. Kontrollként a lineáris DDAVP-ből származó DDAVP-termék hozamát is tanulmányoztuk (1. táblázat). Az L-SST esetében a H2O2 + MNP nanozimek + MIP mikrozimek rendszerének termékhozama 59,3% volt, ami jóval magasabb volt, mint a H2O2 + MNP nanozimek + NIP mikrozimek (42,2%) és a H2O2 + MNP nanozimek rendszere (35,6%). Amikor azonban lineáris DDAVP-t alkalmaztunk lineáris peptidreaktánsként, a H2O2 + MNP nanozimek + MIP mikrozimek rendszere a H2O2 + MNP nanozimek + NIP mikrozimekkel azonos termékhozamot mutatott (nincs szelektivitás). Ezek a kísérleti eredmények azt mutatják, hogy a lenyomott üregek szelektíven fokozták az L-SST ciklizációját.