Új perspektívák a Candida albicans növekedési sebességét befolyásoló táplálkozási tényezőkről cukorbetegeknél. In vitro vizsgálat

Adrian Man

1 Orvosi és Gyógyszerészeti Egyetem, Mikrobiológiai Tanszék, Marosvásárhely, Románia

Cristina Nicoleta Ciurea

2 Orvosi és Gyógyszerészeti Egyetem, Marosvásárhely, Románia

Dan Pasaroiu

2 Orvosi és Gyógyszerészeti Egyetem, Marosvásárhely, Románia

Ana-Ioana Savin

2 Orvosi és Gyógyszerészeti Egyetem, Marosvásárhely, Románia

Felicia Toma

1 Orvosi és Gyógyszerészeti Egyetem, Mikrobiológiai Tanszék, Marosvásárhely, Románia

4 Sürgősségi Klinikai Megyei Kórház, Marosvásárhely, Románia

Floredana Sular

3 Orvosi és Gyógyszerészeti Egyetem, Laboratóriumi Orvostudományi Tanszék, Marosvásárhely, Románia

4 Sürgősségi Klinikai Megyei Kórház, Marosvásárhely, Románia

Luigi Santacroce

5 Bari Egyetem Aldo Moro, Policlinico Egyetemi Kórház, Jóniai Tanszék és Mikrobiológiai és Virológiai Szolgálat, Bari, Olaszország

Anca Mare

1 Orvostudományi és Gyógyszerészeti Egyetem, Mikrobiológiai Tanszék, Marosvásárhely, Románia

Az AMan, a CNC, a DP, az AIS és az AMare megtervezte a vizsgálatot és elvégezte az adatok elemzését; FS és LS hozzájárultak a statisztikai elemzéshez és áttekintették a kéziratot; AMan, FT és AMare elkészítette a kéziratot; AMan, FT, FS, LS és AMare kritikusan átdolgozták a szellemi tartalom kéziratát. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Absztrakt

HÁTTÉR

A Candida albicans és a diabetes mellitus közötti kapcsolat jól elismert, de hiányosan tisztázott.

CÉLKITŰZÉSEK

Ennek a vizsgálatnak a célja a C. albicans (CA) növekedési ütemének felmérése különböző koncentrációjú glükóz és fruktóz jelenlétében, amelyek a cukorbetegségben szenvedő betegek két fő kórélettani és táplálkozási szempontból releváns cukorai, annak érdekében, hogy jobban megértsék a a tápanyagszerzési stratégia és annak lehetséges kapcsolata a cukorbetegek hiperglikémiás állapotával.

MÓD

A glükóz és a fruktóz különböző koncentrációinak (1000 mg%, 500 mg%, 250 mg% és 100 mg% w/v) hatását a CA növekedési sebességére áramlási citometriával vizsgálták.

MEGÁLLAPÍTÁSOK

Megállapítottuk, hogy a glükózkoncentráció közvetlenül összefügg a CA növekedésével, amely összefüggésben lehet a nem kontrollált cukorbetegeknél előforduló gyakori élesztőfertőzésekkel; azt is megmutatjuk, hogy a fruktóz gátolja a CA növekedési sebességét.

FŐKÖVETKEZTETÉSEK

Hipotézisünk eredményeként a tanulmány bebizonyítja, hogy a fruktóztartalmú ételek megakadályozhatják a candidiasis kialakulását, legalábbis az orális helyeken.

Köztudott, hogy a diabetes mellitus az egyik legelterjedtebb krónikus állapot az egész világon, 56 millió eset becslésével, 2013-ban Európában 8,5% -os prevalenciával és növekvő mértékben (Tamayo et al. 2014). A magas morbiditás többnyire krónikus makrovaszkuláris és mikrovaszkuláris szövődményekhez kapcsolódik, mint például nephropathia, neuropathia, retinopathia, szívbetegségek, kapcsolódó elhízás, de fertőző szövődmények is, a hiperglikémiás környezet miatt (Casqueiro et al. 2012, Tamayo et al. 2014, Gregg et al., 2016). Az élesztőfertőzések cukorbetegeknél gyakoriak, a kandidózist a fő fertőző patológia részeként írják le: orális és nyelőcső candidiasis, pyelonephritis vagy cystitis (Casqueiro et al. 2012). Ezenkívül a legutóbbi áttekintések az orális mikrobaflóra, a szájhigiénia és a glikémiás kontroll közötti összefüggésekre összpontosítottak cukorbetegeknél (Santacroce et al. 2010, Monea et al. 2017).

Bár a Candida albicans (CA) és a diabetes mellitus közötti kapcsolat jól ismert, még mindig nem teljesen tisztázott (Soysa et al. 2006). Az orális kandidózist gyakran albicans fajok okozzák, és számos klinikai formája van (pseudomembranosus candidiasis, Candida-val kapcsolatos leukoplakia, szögletes cheilitis, glossitis vagy stomatitis). Candida spp. gyenge glikémiás kontrollban szenvedő betegeknél gyakran előfordul, és már kimutatták, hogy a megemelkedett nyál glükózszint megnövekedett orális Candida szállításhoz vezet (Al-Maskari et al. 2011, Kumar et al. 2014).

Ez az in vitro kísérleti vizsgálat megpróbálja tovább meghatározni az összefüggéseket a cukorban szenvedő betegek magas vércukorszintje és a váladék (beleértve a nyálat is), valamint a candidiasis kialakulása között ezekben a betegkategóriákban, kombinálva eredményeinket az irodalmi hivatkozásokkal . E tanulmány célja a CA növekedési ütemének felmérése különböző koncentrációjú glükóz és fruktóz jelenlétében, a cukorbetegségben szenvedő betegek két fő fiziopatológiai és táplálkozási szempontból releváns cukora között, annak érdekében, hogy jobban megértsük a tápanyag-felvételi stratégiát és lehetséges összefüggése a cukorbetegek hiperglikémiás állapotával. A Candida viselkedésének in vitro vizsgálata glükóz jelenlétében kísérlet arra, hogy újjáteremtse a gomba egyik feltételét egy cukorbeteg szervezetben. Továbbá tanulmányoztuk a CA viselkedését fruktóz környezetben, annak érdekében, hogy jobban megértsük a cukorbeteg élelmiszerekből származó tápanyagszerzési stratégiát és ennek a glükózszubsztituensnek a Candida replikációs ráta vonatkozását.

Feltételezzük, hogy a fruktóz, amely cukor általában lassabban metabolizálódik, mint a glükóz, negatívan befolyásolja a CA növekedését. A mikrobák növekedésének meghatározására általában a standard lemezszám (SPC) és az optikai sűrűség (OD) méréseket használják (Biesta-Peters et al. 2010). Korábbi kísérleteink (publikálatlan adatok) azt mutatták, hogy az SPC nem megbízható módszer a CA növekedési sebességének követésére, a replikátumok közötti nagy eltérések miatt. A következetesebb eredmények elérése érdekében az élesztősejt-populáció dinamikáját a kifejezetten kis biológiai részecskék számlálására tervezett Apogee A50-Micro flow-citométerrel (Apogee Flow Systems, UK) értékeltük, annak jobb fényszórási teljesítménye miatt (Foladori et al. 2010).

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Valamennyi minta CFU/ml értékét normalizáltuk a H0-n kapott értékekhez és Δ-indexként fejeztük ki, ami kompenzálta az oltóanyag és a minta előkészítésével kapcsolatos hibákat (a CFU-szám a H0 kiindulási pontnál). A második normalizálást a minták Δ-indexe és a kontrollok Δ-indexe között (hozzáadott cukrot nem tartalmazó minták CFU/ml értékei), és ΔΔ-indexként fejeztük ki, amely kompenzálta a külső vagy ill. egyéb, nem azonosítható tényezők, ezáltal jobb növekedési markerként. Az egynél magasabb ΔΔ-index értéke egyenértékű a növekedés fokozásával, míg az egynél kisebb érték a növekedés gátlásával egyenértékű a kontrollhoz képest.

A normalizált indexekkel kiegészítve értékeltük az óránkénti növekedési sebességet (r) és a generációs időt (g) percekben, amelyeket a H3-nál leolvasott CFU/ml abszolút számának felhasználásával számítottunk a következő képlet alapján:

Magyarázat: r - növekedési sebesség; T1 - a minta leolvasásának ideje (órában); T0 - kezdeti idő (0 óra olvasás)

Az összes statisztikai értékelést táblázatkezelő szoftverben és a GraphPad InStat3 programban végeztük. A szignifikancia küszöbértéket 0,05-nél kisebb p-érték esetén vettük figyelembe.

EREDMÉNYEK

A glükóz és a fruktóz jelenléte ellentétes hatást gyakorolt a CA növekedési sebességére. Összességében a glükóz stimuláló hatást fejtett ki, míg a fruktóz gátló hatást gyakorolt a CA növekedésére 9 óra inkubálás után (1. ábra). Abszolút értékekben az összes minta exponenciális, szignifikáns növekedést mutatott (2. ábra). A növekedési ráta közvetlenül kapcsolódik a generációs időhöz. A glükóz jelenléte több mint 20 perccel csökkentette a generációs időt, míg a fruktóz jelenléte hozzávetőlegesen 15 perccel növelte. Abszolút értékekben a növekedési sebesség/óra arány magasabb volt glükóz jelenlétében (r = 0,45-0,48), mint fruktóz jelenlétében (r = 0,25-0,27). A generációs idő 87-92 perc glükóz és 154-166 perc között változott a fruktóz esetében (3. ábra).

Az áramlási citometria egy élesztőpopulációt mutatott, amely H0-nál volt látható, és a H1-nél nem volt szignifikánsan eltérő morfológia, amely kezdett jobban meghatározni, de még mindig nagyban elterjedt H2-nél, és kondenzált és jól definiált 9 óra inkubálás után (H3). Az összes mintában észleltek egy második törzsből és valószínűleg a táptalajból származó részecskékből álló populációt, amelyet figyelmen kívül hagytak. Ezeket a tendenciákat mindkét cukor esetében észrevették. A glükóz esetében még abban a koncentrációban is, amely a legkevésbé stimulálta a CA növekedési sebességét, a sejtpopuláció láthatóan megnőtt a H2 és H3 hőmérsékleten, összehasonlítva a megfelelő fruktóz szóródási ábrákkal. A kis élesztősejtek (fiatal CA sejtek) glükóz jelenlétében láthatók a kapu területének bal alsó sarkában a H2-nél (4. ábra).

VITA

Az élesztőgombákról és gombákról gyakran beszámolnak, hogy felelősek az immunrendellenességben szenvedő betegek és a cukorbetegek nyaki és arcterületét érintő súlyos állapotokért (Giudice és mtsai 2016), valamint a Candida spp. a leggyakoribb opportunista gombás kórokozók, a CA az esetek több mint 50% -át teszi ki (Minea et al. 2015).

A candidiasis könnyen felismerhető, még akkor is, ha más klinikai képek is szimulálhatják ugyanazt a szempontot, mint egyes szindrómás állapotok (Marrelli et al. 2012), néhány onkológiai elváltozások (Santacroce és mtsai 2005, Petrovan és mtsai 2017) vagy agresszív bakteriális fertőzések. immunhiányos betegeknél vagy idegen testektől származó fertőzések eredményeként (Inchingolo et al. 2011).

A CA patogenitási mechanizmusai korlátozottak a baktériumokban jelenlévőkhöz képest, így ez az élesztő egy kommensális és opportunista kórokozó, amely a szájüregben a populáció körülbelül 75% -ában van jelen, és aktív a gazdaszervezethez kapcsolódó egyensúlyhiány, például bakteriális zavar esetén., immunrendellenességek vagy helyi patológiák (Jenkinson & Douglas 2002). A magas invazivitású hifális formák, a nagy disszeminációs kapacitású blasztospórák, az adhezinek, az invazinok, a biofilmképződés, a környezeti tényezők érzékelése és a metabolikus adaptáció a CA kórokozó tényezőinek részei (Mayer és mtsai 2013). A metabolikus adaptációnak kulcsszerepe lehet olyan cukorbetegeknél, ahol a glükózszint magasabb, mint a nem diabéteszes populációkban, ami helyi vagy disszeminált candidiasisra utalhat.

A cukrok legalább az in vitro potenciális táplálékforrásokat jelentenek az élesztők számára; a glükóz, a fruktóz és a galaktóz fiziológiailag releváns az emberben. Mindazonáltal úgy tűnik, hogy ezek a cukrok nem egyedüli tápanyagforrások, mivel a lipidek, fehérjék és aminosavak értékes alternatív források, különösen az alacsony glükózkoncentrációjú szövetekben (Mayer et al. 2013). A glükóz és a fruktóz fokozza a CA virulenciát azáltal, hogy stimulálja a blasztoszpórákról a hifákra való átmenetet in vivo (Sabina & Brown 2009). A szájüregben a glükózkoncentráció magasabb, de változó (az étkezési szokások és a szájhigiéné miatt), mint a vérben, és úgy tűnik, hogy nem elsődleges szerepe van a szájnyálkahártya Candida terhelésében, hanem fokozza a Candida terhelését szisztémás fertőzésekben (Ene és mtsai 2012). Ennek ellenére a cukorbetegeknél, ellentétben a nem diabéteszesekkel, a nyálmirigyek bazális membránjának permeabilitása befolyásolja, ami glükóz „szivárgáshoz” vezet a nyálba (Kumar et al. 2014). Ez megmagyarázza, hogy a cukorbetegeknél miért fordul elő magas orális candidiasis.

A növekedés fellendülését 1000 mg% glükóz jelenlétében észleltük az inkubáció első 3 órájában, ami részben megfelel a lag fázisnak. Ez a táplálékforrás-bőséggel magyarázható, amely akut energiát szolgáltatott a CA-sejteknek, de időben kedvezőtlenebb ozmotikus hatása volt. Ehelyett a glükóz kényelmesebb koncentrációja (100 mg%) jobb környezetet biztosított a CA hosszú távú növekedéséhez. Nem értékeltük a glükóz alacsonyabb koncentrációinak a CA növekedésére gyakorolt hatását, de gyaníthatjuk, hogy ez hasonlóan stimulálhatja azt. Ezt a hipotézist számos tanulmány alátámasztja, amelyek azt mutatják, hogy nem kontrollált cukorbetegeknél, ahol a nyál glükózszintje magasabb, mint 12-13 mg/dL, a szájüregi Candida hordozás gyakoribb (Kumar et al. 2014, Satish et al. 2014) . Más vizsgálatok 25-30 mg/dl nyál glükózszinttel rendelkező betegeket azonosítottak, amelyek szintén korreláltak a magas Candida hordozással (Balan et al. 2015). Ezenkívül a nyál glükózszintje 2 órán át magas marad az étkezés és/vagy a cukor bevétele után, és a normál szintre történő helyreállítási arány lassabb a cukorbetegeknél, mint a nem cukorbetegeknél (Jurysta et al. 2009). Az étel típusa szintén fontos szerepet játszik a cukor kiürülésében (Nirmala et al. 2016), így a nyál glükóz magas szintje valóban elérhető és elősegítheti a Candida kolonizációt.

Tudjuk, hogy a cukorbetegségben szenvedő betegeknél jelentett Candida fertőzés kockázatának többtényezős oka van. A cukorbetegség mellett a magas cukorbevitel, a rossz étkezési szokások vagy a rossz szájhigiénia olyan tényezők, amelyek hozzájárulnak a nyál glükóz magas szintjéhez, és kedvező tényezők a szájüregi candidiasis számára. Ennek ellenére tanulmányunk ebben az összefüggésben további bizonyítékot szolgáltat a glükózkoncentráció és a candidiasis közötti közvetlen kapcsolatra vonatkozóan.

Ezenkívül eredményeink információt nyújtanak a gomba fitneszképességéről egy fruktózban gazdag környezetben, ami felveti a kérdést, hogy a fruktóz-diéta védő tényező-e a szájüregi candidiasis ellen. A cukorbetegségben a diétás ételek (cukorpótló szerek) részeként a fruktóz bevitele védő szerepet játszhat ezeknél a betegeknél a szájüregi candidiasis ellen. A PubMed („candida/metabolizmus”) és „fruktóz” kifejezések keresése 40 eredményt mutatott, amelyek mindegyike az albicans kivételével más Candida fajokra vonatkozik. Ez a kísérleti tanulmány új információkat hoz a C. albicans fruktózzal és a fruktóz bevitelével kapcsolatos anyagcseréjéről, amely különösen a cukorbetegeknél teljesül. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a cukorbetegség kényelmesen kiváltható patkányokban (Scridon és mtsai 2015), így ezek a kísérleti modellek lesznek a jövőbeni in vivo kísérletek célpontjai a CA növekedési sebességét és fertőző potenciálját illetően. Ezt szem előtt tartva ez a tanulmány a cukorbetegek megfelelő klinikai megközelítésének fontosságát hivatott kiemelni, a szájápolás szempontjából is: fontos a szájüregi állapot mély ismerete a szisztémás szövődmények csökkentése érdekében. néhány patogenetikai mechanizmus (Santacroce et al. 2010).

Összegzésképpen elmondható, hogy a CA növekedési sebességének in vitro analízise áramlási citometriával új alternatíva más általánosan alkalmazott módszereknél, például az optikai sűrűség mérése vagy a standard lemezszám, amely lehetővé teszi az élesztősejt-populációk differenciálását. Eredményeink azt mutatták, hogy pozitív összefüggés van a CA-sejtek száma és a hiperglikémiás környezet között, így további bizonyítékot szolgáltatunk a CA-fertőzések magas előfordulási gyakoriságára a rossz glükózkezelésű betegeknél. Ezenkívül megmutattuk, hogy a fruktóz növeli a CA keletkezési idejét, és ezáltal gátolja annak növekedési sebességét. Bár bizonyítottan kölcsönös függőség van a fruktózkoncentráció és a CA növekedési üteme között, az értékek közötti kapcsolat továbbra is vita tárgyát képezi. Ez a tanulmány erőteljesen hozzájárul a szájüreget és annak mikrobiotáját befolyásoló számos út megismeréséhez: rámutat a szóbeli patológiák multidiszciplináris megközelítésének fontosságára is (Mangini et al. 2006). Valójában a szisztémás betegségek és a szájüregi megnyilvánulások közötti összefüggéseknek számos összefüggésük van, amelyeket valójában még nem teljesen értenek, tehát érdemes a tudományos közösség további vizsgálataira (Santacroce et al. 2008).