Újszerű gyulladáscsökkentő szerep a lépből származó interleukin-10 esetében az elhízás okozta gyulladásban a fehér zsírszövetben és a májban

Társított adatok

Absztrakt

Ezen eredmények alapján feltételezik, hogy az elhízás elnyomja az IL-10 szintézisét, és krónikus gyulladást eredményez a WAT-ban és a májban. Adataink azt mutatják, hogy az elhízás csökkentette az IL-10 expresszióját a lépben, és hogy a lépből származó IL-10 megvédte a gyulladásos válaszokat a WAT-ban és a májban elhízott egerekben.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Hím C57Bl/6J egerek (vad típusú egerek, 22–25 g; KBT Oriental, Saga, Japán) és IL-10-hiányos egerek (IL-10KO egerek, 002251-B6.129P2-Il10 tm1Cgn/J, ajándék Sandy Morse-t, a Jackson Laboratóriumot, Bar Harbor, ME) az Oita Egyetem egyik szobájában helyezték el, 12 órás világos/sötét ciklus alatt, 0700 és 1900 óra között. Az egyetemen fenntartott IL-10KO egereket alkalmaztuk a visszakeresztezéshez. Az 5'-CCACACGCGTCACCTTAATA-3 '(mutáns előre), az 5'-GTTATTGTCTTCCCGGCTGT-3' (vad típusú fordított) és az 5'-CTTGCACTACCAAAGCCACA-3 '(általános) PCR-primereket használták a genotipizáláshoz. Valamennyi tanulmány az Oita Egyetem irányelveinek megfelelően készült, a Nemzeti Egészségügyi Intézet által kiadott, a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató alapján. Valamennyi egeret 5 percen keresztül kezeltük a kísérlet előtti 4 egymást követő napon (13).

Kísérleti protokoll

1. kísérlet.

A vad típusú egereket a két csoport egyikébe soroltuk (n = 6 mindegyik csoportban) az alábbiak szerint: az 1. csoportba tartozó egereket standard chow-val etettük (standard; 20% zsír, 56% szénhidrát, 24% fehérje; Clea, Tokió, Japán) 8 hétig, majd színlelt műveletnek vetették alá (színlelt); A 2. csoportba tartozó egereket standard héten etettük 8 hétig, majd splenectomián (SPX) estek át. Ezután az érzéstelenítést nátrium-pentobarbitál (50 mg/kg) intraperitoneális injekciójával váltották ki, a hasüreget megnyitották és a lépet gondosan eltávolították. A hasat kinyitották, de a lépet a színlelt csoportban nem távolították el.

2. kísérlet.

A vad típusú egereket az öt csoport egyikébe soroltuk (n = 6 mindegyik csoportban) az alábbiak szerint: az 1. csoportba tartozó egereket standard héten etettük 8 hétig, és egér szérum albumint (m-albumint) adtunk be, a 2. csoportba tartozó egereket magas zsíros étrendet (HF; 60% zsír, 20% szénhidrát, 20% fehérje; Research Diets, New Brunswick, NJ) 8 hétig, majd m-albumint adva a 3. csoportba tartozó egereknek SPF után 8 hétig HF-et adtak, majd m -albumint, a 4. csoportba tartozó egereket 8 hétig HF-vel etettük SPX után, majd rekombináns egér IL-10-et (r-IL-10; 0,5 ng/nap; Wako Chemicals, Osaka, Japán) és az 5. csoportba tartozó egereket kaptunk csoport) az SPX-kezelt csoport által elfogyasztott élelmiszer mennyiségét 8 hétig etettük, majd m-albumint adtunk.

3. kísérlet.

A vad típusú és az IL-10KO egereket a három csoport egyikébe soroltuk (n = 6 az egyes csoportokban) az alábbiak szerint: az 1. csoportba tartozó egereknek 8 hétig HF-et adtak és m-albumint adtak be, a 2. csoportba tartozó egereknek 8 hétig HF-et adtak. SPX és m-albumin beadása után, valamint a 3. csoportba tartozó egereket 8 hétig HF-vel etettük SPX után, és r-IL-10-et adtunk be (0,5 ng/nap; Wako Chemicals). A 24 órás táplálékfelvételt a maradék étel lemérésével számoltuk, és a testtömeget minden nap 1700 és 1800 óra között határoztuk meg. A táplálékfelvételt a testsúly normalizálta. Az összes egeret további 4 hétig tartottuk a beavatkozások befejezése után.

A lépokin, a WAT, a máj és a szérum citokinszintje.

ELISA kiteket (Invitrogen, Carlsbad, CA) használtunk a TNF-a, IL-1β, MCP-1 és IL-10 szintek mérésére a lépben, az epididymális WAT-ban, a májban és a szérumban. Az egyes szervek fehérjekoncentrációit Lowry módszerrel elemeztük. Az IL-10 és a TNF-a arányát a fenti mérések alapján számítottuk ki.

Western blottolás.

A fagyasztott szövetkészítményeket mintapufferrel homogenizáltuk, centrifugáltuk és felforraltuk. A szövet teljes fehérjekoncentrációját Bradford módszerrel számszerűsítettük. Ugyanolyan mennyiségű teljes fehérjét töltöttünk 8% SDS-PAGE-ra, majd elektroforetikusan átvittük polivinilidén-difluorid membránokra (Bio-Rad, Richmond, CA). A membránokat 5% zsírmentes tejjel blokkoltuk 1 órán át, egy éjszakán át inkubáltuk primer antitestekkel 4 ° C-on, majd inkubáltuk a szekunder antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten. Az elsődleges antitestoldat az F4/80 nyúlra specifikus poliklonális antiszérumból állt (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia). Az F4/80-at fokozott kemilumineszcenciával detektáltuk (Amersham Life Sciences, Piscataway, NJ), és mennyiségileg meghatároztuk a Quantity One képalkotó szoftverrel (Bio-Rad).

Szövettani és immunhisztokémiai elemzések.

Az epididymális WAT és a májmintákat Mayer hematoxilin-eozinnal (H-E) (Wako Chemicals) vizsgáltuk. A májmintákat olaj-vörös-O festéssel is megvizsgáltuk, és enyhén festettük hematoxilinnel (Wako Chemicals). Az F4/80 immunhisztokémiai festéséhez a tárgylemezeket primer antitestekkel inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on nyúl anti-egér F4/80 antitesttel (Santa Cruz Biotechnology). A tárgylemezeket biotinnal konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel (ABC reagens; Vector Laboratories, Burlingame, CA) inkubáltuk. Az egyes minták immunreaktivitását diaminobenzidin-tetrahidrokloriddal (Nacalai Tesque, Kyoto, Japán) tettük láthatóvá. Ezenkívül normális nyúlszérumot használtunk a fent említett antitestek helyett, és negatív kontrollként további szekunder antitesttel történő inkubálást hajtottunk végre. Ezek a tesztek negatív festést eredményeztek.

Trigliceridtartalom a májban és a WAT-ban.

Az epididymális WAT és a májminták triglicerid (TG) tartalmát egy kereskedelemben kapható készlet (Wako Chemicals) segítségével határoztuk meg.

Szérum TG, szabad zsírsav, teljes koleszterin, alanin-transzamináz és adiponektin szint.

A szérum TG, a szabad zsírsav (FFA), az összkoleszterin (TC) és az alanin-transzamináz (ALT) koncentrációját a kereskedelemben kapható készletek (Wako Chemicals) segítségével határoztuk meg, a szérum adiponektin szinteket pedig egy adiponectin ELISA készlettel (Otsuka Pharmaceutical, Tokió) mértük., Japán).

Glükóz tolerancia teszt.

Egy éjszakán át tartó böjt után egereknek intraperitoneálisan injekcióztak glükózt (2,0 g/testtömeg-kg), és vérmintákat vettünk 0, 15, 30, 60 és 120 percnél. A vércukor-koncentrációt glükóz-oxidáz módszerrel és glükózanalizátorral (MS-GR101; Terumo, Tokió, Japán) mértük. A szérum inzulin koncentrációt inzulin ELISA kit segítségével határoztuk meg (Shibayagi, Gunma, Japán).

V o 2 mérése .

A V o 2 értékét közvetett kalorimetriás rendszerrel számoltuk (Oxymax; Columbus Instruments, Columbus, OH). A V o 2 és a V co 2 értékeket 24 órás periódus alatt mértük szobahőmérsékleten, és testtömegre normalizáltuk. A légzési hányados (RQ) a V co 2 és a V o 2 aránya. A teljes V o 2 és V co 2 értékeket 24 óra alatt határoztuk meg a V o 2 és V co 2 görbe alatti területek (AUC V o 2 és AUC V co 2) integrálásával a trapéz alakú szabály szerint. Az AUC RQ-t is kiszámolták.

A zsigeri és a szubkután zsír mérése.

A zsigeri és a szubkután zsírterületeket hasi komputertomográfiás (CT) vizsgálatokkal (RmCT; Rigaku, Tokió, Japán) számszerűsítettük. CT szelvény felvételeket készítettünk az L4 csigolya alsó szélén fekvő helyzetben lévő egerekkel, hogy a zsigeri és a szubkután zsír mennyiségét egyetlen szinten mérjük. Meghatároztuk az L4 csigolya szintjét, mint a csípőcímer két legmagasabb pontja közötti egyeneset. A képeket az i-Dixel-R kereskedelmi szoftverrel kompatibilis fájlokká konvertálták (J. Morita Corporation, Kiotó, Japán).

Statisztika.

ASZTAL 1

A HF által kiváltott elhízás csökkenti az IL-10 szérumszintjét, de a TNF-α, IL-1β vagy MCP-1 szintjét nem.