A víz-labirintus eljárás hatása az idős patkányok agyrészeinek redox mechanizmusaira

Absztrakt

Bevezetés

Az ilyen kísérletek azért is fontosak, mert az állatképzési eljárások felhasználhatók a fejlett virtuális médiatechnológiák kifejlesztésére az ember korral az életkorral összefüggő kognitív hanyatlás kezelésére (Foster et al., 2012). Ezeknek a technológiáknak azonban valószínűleg figyelembe kell venniük az úgynevezett átvitelhatásokat, amelyek akkor jelentkeznek, amikor az előzetes képzés befolyásolja a továbbképzés eredményeit. Guidi M. és társszerzői a vízi labirintus feladat két változatában fontolóra vették az átvitel hatásainak szerepét az epizodikus és referencia memória életkorral összefüggő károsodásának meghatározásában. Vizsgálatuk kimutatta, hogy az előzetes Cue diszkriminációs tréning és a kezdeti térbeli diszkriminációs tréning hatással volt az epizodikus és a referencia memória romlására. Meg kell jegyezni, hogy az epizodikus térbeli memória tesztjei megbízhatóbbak voltak, mint a referencia memória a kognitív hanyatlás kimutatására (Guidi et al., 2014). Így a vizsgálati eljárás kísérheti az agy működésének változásait, és hatással lehet a kognitív szférára.

Úgy tűnik, hogy az átviteli hatások előfordulása hasznos lehet az életkorral összefüggő hiányokkal küzdő betegek képzésében. Az elmúlt években a komoly játékokon alapuló új technológiákat dolgoztak ki az Alzheimer-kórban és az ahhoz kapcsolódó rendellenességekben (ADRD) szenvedő betegek értékelésére. Megállapították, hogy a Súlyos Játékok használata nemcsak a funkcionális zavarok felmérésében segíthet, hanem az ADRD kezelésében is (Robert et al., 2014). Különösen a kognitív játékok javíthatják a figyelmet és a memóriát. Az ilyen játékok után az enyhe kognitív károsodásban szenvedő betegek javították a memória pontszámát és a hippocampus aktiválódását (Rosen et al., 2011). Az Alzheimer-kórban szenvedő betegek fizikai játékai (Wii Sports) nemcsak javították a pontszámokat, hanem normalizálták a beteg egyensúlyát és járását (Legouverneur et al., 2011). Ezért a képzési technológiák terápiás módszerként használhatók. Ezzel meg kell tisztázni azokat a funkcionális változásokat, amelyek az agyban történnek a képzési folyamat során.

Az agyi aktivitások számos funkcionális változása összefügg a progresszív oxidatív stresszel, amely neurodegeneratív betegségeket vált ki (Sandhu és Kaur, 2002). Általánosságban elmondható, hogy az oxidatív stresszt a prooxidáns/antioxidáns homeosztázis egyensúlyhiányaként értelmezik, amely a prooxidánsok felé tolódik el (Dalle-Donne et al., 2003 áttekintése). A prooxidánsok és az antioxidánsok különféle molekuláris mechanizmusokat képviselnek. Az oxidatív stressz szintje és állapota a pro- és antioxidánsok aktivitásától és kölcsönhatásuktól függ. A korral járó idegsejtek diszfunkciójának alapja az agyszövet adott mintájának prooxidáns és antioxidáns kapacitásának integrált meghatározásával tárható fel. Ez felvázolja az oxidatív stressz specifikus molekuláris célpontjainak további vizsgálatának irányát, amely segíthet terápia kidolgozásában az idős agy kognitív károsodása ellen.

Munkánk célja a víz-labirintus eljárás hatásának feltárása az oxidatív stressz szintjére idős patkányok különböző agyi részeiben. Az oxidatív stressz szintjét az agyszövet homogenizátumaiban a pro- és antioxidáns kapacitás arányából értékeltük kemilumineszcencia módszerrel. Fiatal felnőtt (3 hónapos) és idős (11 hónapos) hím patkányokat képeztek ki a vízi útvesztőben. Referencia csoportként a megfelelő korú ép állatokat használtuk.

Anyagok és metódusok

Állatok és kísérleti tervezés

Minden állatkísérlet összhangban volt az Európai Közösségek Tanácsának 1986. november 24-i irányelvével (86/609/EGK), amelyet a Tomszki Állami Egyetem Biológiai és Biofizikai Intézetének Állatkutatási Etikai Bizottsága hagyott jóvá.

2 és 10 hónapos hím Wistar patkányokat az Orosz Orvostudományi Akadémia szibériai osztályának Farmakológiai Intézetének óvodájából vásároltak. A patkányokat a Tomszki Állami Egyetem Biológiai és Biofizikai Intézetének viváriumában egy elszigetelt és szellőző helyiségben tartottuk. A helyiségben 20 ± 2,0 ° C hőmérsékletet és 60% -os páratartalmat tartottak 12 órás fény: 12 órás sötét nappali ciklus mellett. Minden állat ad labium hozzáférést kapott az élelemhez és a vízhez (standard patkánytáplálék). A patkányokat 4 hetes periódus alatt figyeltük meg.

Karanténperiódus után az egyes korú patkányokat véletlenszerűen 2 csoportba osztották: 3 hónapos és 11 hónapos patkányok, minden csoportban 10 állat, így 4 csoportot alkotva, minden korosztályból 2 csoportot. Az első és a második csoportba tartozó állatokat az MWM-ben képezték ki („3 hónapos kiképzett patkányok” és „11 hónapos kiképzett patkányok”). A harmadik és negyedik csoportba tartozó állatokat („nem képzett 3 hónapos patkányok” és „nem képzett 11 hónapos patkányok”) használtuk referenciaként. A betanított patkányokról kapott adatokat összehasonlítottuk a nem képzett, azonos korú állatok megfelelő adataival.

Víz-labirintus (MWM)

Az összes tesztállatot 60 másodpercig medencében engedték úszni. Az edzéseket szokásos eljárással 1,5 m átmérőjű és 0,6 m magasságú medencével végeztük, 10 cm átmérőjű rejtett emelettel és három különböző geometriai ábrával a medence falain tereptárgyként. Az ilyen tereptárgyak elrendezése és a kiindulási pont mindig állandó volt. Minden edzéspróba 60 másodpercet vett igénybe. Ha a kísérlet nem sikerült, és a patkány 60 másodperc alatt nem találta meg a rejtett emelvényt, az állatot 10–15 másodpercre a platformra helyezték. Minden patkány négy egymást követő napon át (1., 2., 3. és 7. nap) négy edzéspróbát kapott naponta. Értékelték az egyes állatok sikeres vizsgálatának idejét és az egyes csoportok sikeres kísérleteinek százalékos arányát. A betanított és nem betanított állatokat ugyanazon a napon feláldozták.

Az eutanázia előtt megmértük a patkányokat, megmértük a testmag hőmérsékletét, és értékeltük az izom állóképességét (1,5 × 1,5 mm szembőségű fémrácsra akasztás ideje, átlagosan három kísérlet). Az eutanázia előtt a patkányok könnyű inhalációs érzéstelenítést kaptak. A femorális vénából vért vettünk a vérplazma előállítása céljából.

Szövet-homogenizátumok

Közvetlenül az eutanázia után az agyat összegyűjtötték a szaglógumó, a kisagy, a pons + medulla oblongata, a frontális lebeny kéreg, a mesencephalon és a thalamencephalon izolálására. Az izolált agyrészek mintáit (legfeljebb 150 mg tömegű) lemértük, 1 mol hideg normál sóoldatba helyeztük, és a vizsgálat előtt -20 ° C hőmérsékleten tároltuk (Vincek et al., 2003). A vérplazma mintákat szintén –20 ° C hőmérsékleten tároltuk. A vizsgálat napján a szövetmintákat leolvasztották, normál sóoldattal 50 mg szövet/1 ml koncentrációba helyezték és homogenizálták. A homogenizátumokat 25 percig 8000 g-vel centrifugáltuk. A kapott felülúszókat használtuk az antioxidánsok és az oxidánsok meghatározására minden vizsgált szövetben. A vizsgálatot páros módszerrel hajtottuk végre, ugyanazon mintákkal fiatal felnőtt és idős patkányoktól.

Oxidánsok és antioxidánsok kemilumineszcencia elemzése

A vizsgálatot egy Lumat LB 9507 (Berthold Technologies) kétlombikú, nagy felbontású kemiluminométerrel végeztük, spektrális érzékenységgel a 390–620 nm hullámhossz-tartományban. A kemilumineszcencia (CL) intenzitását relatív fényegységekben (RLU) rögzítettük. RLU = [(az impulzusok mért száma)/10] × a fényszorzó-katód érzékenységének stabilizációs tényezője. A luminol-függő CL intenzitását 5 percig mértük.

Antioxidánsok

A szövetminták antioxidáns kapacitását módosított módszerrel határoztuk meg (Muller et al., 2012), ahol a gyökök forrását - a torma peroxidáz konjugátumát kecske antiegér immunglobulinnal - a Fenton-reakció által termelt gyökök helyettesítették. lúgos pH. A gyököket termelő rendszerben 1 ml H2O 30 μl 0,01 M luminol-oldatot tartalmaz 8,5 pH-jú foszfátpufferben, 20 μl 0,05 M FeSO4-oldatot és 10 μl 0,1 M H2O2-t tartalmaz. 1 ml gyökképző rendszert vezettünk be mindkét Lumat LB 9507 lombikba, az első lombikot ezután 10 μl H2O-val, a második lombikot pedig 10 μl vizsgálandó minta felülúszóval egészítettük ki. A CL intenzitást az első és a második lombikban 5 perc alatt mértük. A gyökképző rendszer (1. lombik) és a vizsgálati minta felülúszójával kiegészített gyöktermelő rendszer (2. lombik) CL intenzitása közötti különbséget alkalmaztuk az antioxidáns kapacitást (AC) jellemző CL intenzitás görbe ábrázolására. A CL AC fényösszegét (Sm) a görbe alatti területként találtuk meg a Microsoft Excel program segítségével. Az Sm CL AC méreteit egység/g szövetben adtuk meg, ahol egységek = RLU · 10 9 .

Oxidánsok

Az oxidánsokat (reaktív oxigénfajok, ROS) azonos CL körülmények között az aktivált luminol kemilumineszcenciából határoztuk meg. A ROS mérésére szolgáló rendszer 1 ml H2O-ja 30 μl 0,01 M luminol-oldatot tartalmaz 8,5 pH-értékű foszfátpufferben. A rendszer ml-ét egy Lumat LB 9507 -es lombikba tesszük, és 10 μl vizsgálandó minta felülúszóval egészítjük ki; A CL intenzitást 5 percig mértük. A CL intenzitásgörbe ROS-jellemzésre való ábrázolása után a Sm Excel ROS-t találtuk a görbe alatti területként a Microsoft Excel program segítségével. Az Sm CL ROS méreteit egység/g szövetben adtuk meg, ahol egységek = RLU · 10 9 .

Statisztikai analízis

Asztal 1

Képzett és nem képzett 3 hónapos és 11 hónapos patkányok testtömege, a testmag hőmérséklete és az izomállóképesség.

JellegzetesA vizsgálat idejeAz eutanázia előtt egy héttelAz eutanázia előttAz MWM előttMWM után

Nem képzett 3 hónapos patkányok		Három hónapos patkányok képezték az MWM-et
Testtömeg (g)	278,4 ± 9,1	311,5 ± 10,7	280,9 ± 4,4	306,6 ± 6,1
Testhőmérséklet (° C)	38,0 ± 0,1	37,1 ± 0,1	38,4 ± 0,1	37,2 ± 0,1
Izomállóképesség (a fémrácsra akasztás ideje)	5,78 ± 1,67	9,50 ± 2,50	4,70 ± 0,83	11,60 ± 3,00 *
Nem képzett 11 hónapos patkányok		Tizenegy hónapos patkányok képezték az MWM-et
Testtömeg (g)	576,0 ± 21,4	571,4 ± 22,6	600,9 ± 16,6	593,5 ± 17,4
Testhőmérséklet (° C)	37,4 ± 0,1	37,1 ± 0,1	37,8 ± 0,1	37,4 ± 0,2
Izomállóképesség (a fémrácsra akasztás ideje)	1,10 ± 0,05	1,25 ± 0,17	1,07 ± 0,04	1,70 ± 0,23 *

A sikeres vizsgálatok 30% -a (szemben 3 hónapos patkányok 90% -ával). A 7. napon azonban az idős patkányok pontszáma megközelítette a fiatal felnőtt patkányok pontszámát (90, illetve 98%, a különbség jelentéktelen). A 11 hónapos patkányok által alkalmazott vizsgálati stratégia különbözött a fiatal felnőtt állatok stratégiájától. Egy sikeres kísérlet során az idős patkányok, miután a vízbe merültek, körülnéztek a medence falain, megtalálták a tereptárgyakat, és átúsztak a medence közepén, közvetlenül a rejtett emelvényre. Tehát a 11 hónapos patkányok sikeres kísérleteinek átlagos ideje 25,9 ± 8,2 volt az első napon, és a 7. napon nem volt szignifikáns különbség az első naptól, 14,8 ± 2,5 másodperc volt (ábra (1A ábra) 1A). Épp ellenkezőleg, a fiatal felnőtt patkányok gyorsan úsztak a falak mentén, hogy megtalálják a rejtett platformot. Átlagos sikeres kísérleti idejük az első napon 34,4 ± 4,2 s volt, a következő napokban szignifikánsan csökkent: a 2. napon 1 ± 3,5 s; 3. nap: 10,6 ± 1,3 s és a 7. nap: 10,7 ± 1,3 s (ábra (1A ábra 1A).

A Morris vízi labirintus képzés hatása az antioxidánsokra és az oxidánsokra 3 hónapos patkányok agyrészeiben és vérplazmájában

Három hónapos fiatal felnőtt patkányokban a Morris vízi labirintusos képzés nem gyakorolt hatást Sm CL AC de jelentősen csökkent Sm CL ROS az összes vizsgált agyrészben, összehasonlítva a nem képzett fiatal felnőtt patkányokkal (ábra (2. ábra 2).