Xantin urolithiasis: A xantin kristályosodásának gátlói

Szerepek Konceptualizálás, vizsgálat, módszertan, felügyelet, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Vese-lithiasis kutatás laboratóriuma, Természettudományi Kar, Egyetemi Egészségtudományi Kutató Intézet (IUNICS-IdISBa), Baleár-szigeteki Egyetem, Palma de Mallorca, Spanyolország

Szerepek Konceptualizálás, vizsgálat, módszertan, felügyelet, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Vese-lithiasis kutatás laboratóriuma, Természettudományi Kar, Egyetemi Egészségtudományi Kutató Intézet (IUNICS-IdISBa), Baleár-szigeteki Egyetem, Palma de Mallorca, Spanyolország

Szerepek vizsgálata, írása - eredeti vázlat

Vese-lithiasis kutatás laboratóriuma, Természettudományi Kar, Egyetemi Egészségtudományi Kutató Intézet (IUNICS-IdISBa), Baleár-szigeteki Egyetem, Palma de Mallorca, Spanyolország

Felix Grases,
Antonia Costa-Bauza,
Joan Roig,
Adrian Rodriguez

Publikálva: 2018. augusztus 29
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198881
>> Lásd az előnyomást

Ábrák

Absztrakt

Célkitűzés

A xantin kristályosodás in vitro gátlóinak azonosítása, amelyek képesek gátolni a xantin kristályok képződését a vizeletben és megakadályozni a vesekövek kialakulását xanthinuriában szenvedő betegeknél.

Mód

A xantin-kristályok képződését a szintetikus vizeletben és a 10 potenciális kristályosodás-gátló hatását kinetikus turbidimetrikus rendszer és fotométer segítségével értékeltük. Az egyes vegyületek maximálisan vizsgált koncentrációja a következő volt: 20 mg/l 3-metil-xantin (3-MX) esetében; 40 mg/l 7-metil-xantin (7-MX), 1-metil-xantin (1-MX), teobromin (TB), teofillin, paraxantin és koffein esetében; 45 mg/l az 1-metilurinsavhoz; 80 mg/l 1,3-dimetil-savsavhoz; és 200 mg/l hipoxantin esetén. Pásztázó elektronmikroszkóppal vizsgáltuk a gátló hatások észlelésekor keletkező kristályok morfológiáját.

Eredmények

Csak a 7-MX, a 3-MX és az 1-MX gátolta szignifikánsan a xantin kristályosodását a vizsgált koncentrációknál. Az inhibitorok keverékei inkább additív, mintsem szinergetikusan hatottak a kristályosodásra.

Következtetés

Az itt azonosított inhibitorok közül kettő - a 7-MX és a 3-MX - a TB fő metabolitja. Különösen a TB fogyasztása után 20% ürül a vizelettel TB-ként, 21,5% 3-MX-ként és 36% 7-MX-ként. Így a teobromin fogyasztása megvédheti a xanthinuriában szenvedő betegeket a vese xantin kalkulumainak kialakulásától. Klinikai vizsgálatokra van szükség ezen hatások in vivo bizonyításához.

Idézet: Grases F, Costa-Bauza A, Roig J, Rodriguez A (2018) Xantin urolithiasis: A xantin kristályosodásának inhibitorai. PLoS ONE 13 (8): e0198881. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198881

Szerkesztő: Fernando Rodrigues-Lima, Universite Paris Diderot, FRANCIAORSZÁG

Fogadott: 2018. május 25 .; Elfogadott: 2018. augusztus 15 .; Közzétett: 2018. augusztus 29

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: A szerzők nem kaptak külön támogatást ehhez a munkához.

Versenyző érdeklődési körök: Elolvastam a folyóirat politikáját, és a kézirat szerzőinek (FG, AC-B és AR) a következő versengési érdekeik vannak: Ezek a szerzők kijelentik, hogy a folyamatban lévő szabadalom feltalálói e munka egyes szempontjai alapján. Ez egy nemzeti (spanyol) szabadalom, amelyet még nem engedélyeztek. (Szabadalmi név: A xantin kristályosodásának gátlói. Szabadalmi szám: P201830385). Ezek a szerzők megerősítik, hogy ez a szabadalom nem változtatja meg az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek betartását.

Bevezetés

A xantin urolithiasis a vesekő képződésének ritka típusa, amelyet ritka örökletes rendellenesség, a xanthinuria okoz. Az érintett betegnek xantin-oxidáz-hiánya van, ami hypouricémiát és hypouricosuria-t eredményez [1, 2]. A tünetek bármely életkorban jelentkezhetnek. A klasszikus örökletes xanthinuriában szenvedő betegek körülbelül 50% -ában húgyúti fertőzések, hematuria, vese kólika, akut veseelégtelenség és urolithiasis fordul elő. A betegek egy részénél veseelégtelenség, arthropathia, myopathia vagy nyombélfekély is kialakul [1, 2].

Az örökletes xanthinuriát a xantin-dehidrogenáz/-oxidáz (XDH/OX) hiánya okozza, ami a hipoxantin és a xantin húgysavdegradációjának csökkenéséhez vezet, és e két húgysav-prekurzor felhalmozódásához vezet. Klasszikusan az I. típusú xanthinuriát az XDH/XO gén mutációja okozza, amely a 2p23.1 kromoszómára van feltérképezve, míg a II. ) a 18q12.2 kromoszómán lokalizálódik [3–6]. Ezek a különböző mutációk klinikailag megkülönböztethetetlen típusokhoz vezetnek.

Egy harmadik klinikailag elkülönülő entitást, az A típusú molibdén-kofaktor-hiányt (OMIM 252150) az XDH, AOX és szulfit-oxidáz hármas hiánya jellemez. Ezt a ritka letális autoszomális recesszív rendellenességet, amelyet a MOCS1 gén mutációi okoznak (6p21.1), csecsemőkorban korai megjelenés jellemzi.

Hagyományosan az örökletes xanthinuria típusát allopurinol-terhelési teszttel vagy májbiopsziával sikerült megállapítani, mivel az emberekben a xantin-dehidrogenáz/xantin-oxidáz (XDH/XO) aktivitás csak a vékonybélben és a májban fejeződik ki. A xanthinuria diagnosztizálásának és meghatározásának modern megközelítése háromlépcsős algoritmus [7]. Első lépésként a xanthinuriát a rendkívül alacsony szérum/vizelet húgysav diagnosztizálja, amelyet xantin helyettesít. Másodszor, a xanthinuriát a vizelet metabolomikája segítségével tipizálják: az N1-metil-2-piridon-5-karboxamid (2PY) és az N1-metil-4-piridon-5-karboxamid (4PY) a nikotinamid katabolizmusában a vizelettel kiválasztott végtermékek és ezek a termékek az N1-metil-nikotinamid aldehid-oxidáz (AO) általi oxidációjának eredményei. Végül az eredményeket a molekuláris genetika is megerősíti.

A xanthinuriában szenvedő betegek számára az egyetlen javasolt kezelés az alacsony purintartalmú étrend és a magas folyadékbevitel. Mivel a xantin oldhatósága viszonylag független a vizelet pH-jától, a vizelet lúgosításának nincs hatása (ellentétben a húgysav lithiasisban szenvedő betegekkel) [8, 9].

Szükség van olyan új szerek azonosítására, amelyek megakadályozhatják a xantinuri kristályok kialakulását a xanthinuriában szenvedő betegek vizeletében.

Anyagok és metódusok

Reagensek és oldatok

Xantin (X), 1-metilxantin (1-MX), 3-metilxantin (3-MX), 7-metilxantin (7-MX), hipoxantin (HX), teofillin (TP), paraxantin (PX), teobromin (TB) ), a koffeint (CF), az 1-metil-savat (1-MU) és az 1,3-dimetil-savat (1,3-DMUA) a Sigma-Aldrich-től (St Louis, MO, USA) szereztük be. Szintetikus vizeletvegyületeket a Panreac-tól (Montcada i Reixac, Barcelona, Spanyolország) szereztünk be. Az analitikai/reagens minőségű tisztaságú vegyi anyagokat Milli-Q rendszerből származó ultratiszta ionmentes vízben oldjuk, és felhasználás előtt 0,45 μm pórusszűrőn vezetjük át. Naponta xantin törzsoldatot készítünk, 0,5 g xantint 0,1 liter 1 M NaOH-ban oldva. Az egyéb vegyületek, például a kalcium-oxalát vagy a foszfátok kicsapódásának elkerülése érdekében a kristályosítási reakciókat egyszerűsített szintetikus vizeletben hajtották végre, amelyet 5,60 g Na2HPO4 · 12H2O, 2,41 g NaH2PO4 · 2H2O és 13,05 g NaCl 1 L H2O-ban való oldásával készítettek.

Turbidimetriás vizsgálat

Kinetikus turbidimetriás rendszer alkalmazásával értékelték a szintetikus vizeletben a xantin kristály képződését és a potenciális kristályosodás gátlók hatását. Ez egy fotométerből (Metrohm 662), egy száloptikás fényvezető mérőcellából állt, amelyhez csatlakoztatott reflektor volt (fényút: 2 × 10 mm), és egy monokromatikus fényforrásból (550 nm). A kristályosodást állandó hőmérsékleten (37 ° C) mágneses keveréssel (300 rpm) értékeltük.

Szintetikus vizeletet (180 ml) adunk egy kristályosító lombikhoz, majd xantin-oldatot (20 ml) adunk 500 mg/l végső xantin-koncentrációhoz. Egy inhibitor tesztelése során a kívánt mennyiséget feloldottuk ebben az oldatban. Amikor a kapott oldat eléri a 37 ° C hőmérsékletet, majd 3,6 ml 6 M sósavat adunk hozzá, hogy a pH 6,0 legyen (normális vizelet-pH), és az időzítőt bekapcsoljuk. A végső oldat pH-ját minden kísérlet elején mértük, és az oldat abszorbanciáját (550 nm) rögzítettük a teljes kinetikai vizsgálat során.

A 10 vegyület mindegyikének tesztelt maximális koncentrációja: 20 mg/l 3-MX esetében; 40 mg/l 7-MX, 1-MX, TB, TP, PX és CF esetében; 45 mg/l 1-MU esetében; 80 mg/l 1,3-DMU esetében; és 200 mg/l HX esetén.

A kristályfejlődés elemzése

100 ml-es szintetikus vizeletet, amely 400 mg/l xantint (pH 6,0) tartalmaz, 7 kristályosító edényhez adtunk: 1 inhibitorok nélkül, 2 20 és 40 mg/l 3-MX-el; 2 20 és 40 mg/l 7-MX-tel; 1 20 mg/l 3-MX és 20 mg/l 7-MX keverékével; és 1 20 mg/l 3-MX és 40 mg/l 7-MX keverékével. Az edényeket parafilmmel lefedtük, és 24 órán át 37 ° C-on rázás nélkül inkubáltuk. A kristályokat gondosan összegyűjtöttük, szárítottuk és pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) vizsgáltuk.

Eredmények

Tíz vegyület hatását vizsgáltuk a szintetikus vizelet xantin kristályosodására (1. ábra). Ezen vegyületek közül hárman - 1-MX, 3-MX és 7-MX - jelentősen gátolták a xantin kristályosodását, a többieknek a legmagasabb tesztelt koncentrációnál enyhe vagy semmilyen hatása nem volt (2A. Ábra). Megvizsgáltuk a 3-MX és a 7-MX lehetséges szinergetikus hatásait is (2B. Ábra). Ezeket a termékeket azért választottuk ki, mert a TB fő metabolitjai, míg az 1-MX csak a CF metabolitja [10]. Az eredmények additív, nem szinergikus hatásokat jeleztek.

(A) 500 mg/l xantin kristályosítási görbéi szintetikus vizeletben (1) inhibitorok hiányában és 20 mg/l (2) paraxantin, (3) koffein, (4) teobromin (5) jelenlétében ) teofillin, (6) 1,3-dimetil-savsav, (7) hipoxantin, (8) 1-metil-savsav, (9) 1-metil-xantin, (10) 3-metil-xantin és (11) 7-metil-xantin (T = 37). ° C; pH = 6,0). (B) A 3-metil-xantin + 7-metil-xantin-keverékek hatása a xantin kristályosodására. Indukciós idő ± SD különböző koncentrációjú 3-metilxantin és (1) 7-metilxantin hiányában, (2) 10 mg/L, (3) 20 mg/L és (4) 30 mg/L 7 jelenlétében -metil-xantin.

A SEM segítségével megvizsgáltuk a kristályok képződését 3-MX, 7-MX és ezek keverékeinek hozzáadásával és anélkül (3. ábra). A hosszú időn át (24 óra) végzett kísérletek azt mutatják, hogy a 3-MX és 7-MX jelenlétében nyert kristályok a xantin túltelítettségének változásai nélkül lényegesen nagyobbak, mint azok hiányában. Ez a tény a gócképződés egyértelmű gátlását bizonyítja, mivel minél kisebb a képződött magok száma, annál nagyobb a kristályok mérete egy adott túltelítettség és hosszú ideig tartó kísérletek esetén (vagyis amikor az egyensúly elérte).

400 mg/l xantint tartalmazó szintetikus vizeletben nyert xantin kristályok pásztázó elektronmikroszkópos képei, amelyeket 24 órán át 37 o C-on inkubáltunk különböző inhibitorok jelenlétében, az alábbiak szerint: (A) inhibitorok nélkül; (B) 20 mg/l 3-MX-rel; (C) 40 mg/l 3-MX-rel; (D) 20 mg/l 7-MX-rel; (E) 40 mg/l 7-MX-tel; (F) 20 mg/L 3-MX és 20 mg/L 7-MX és (G) és (H) 20 mg/L 3-MX és 40 mg/L 7-MX.

Eredményeink tehát egyértelműen bizonyítják három vegyület (1-MX, 3-MX és 7-MX) hatékonyságát a xantin kristályosodásának gátlóiként in vitro kísérletekben.

Vita

Eredményeink azt mutatják, hogy az 1-MX, 7-MX és 3-MX jelentősen gátolta a xantin kristályosodását in vitro. Ezenkívül a kristályosodás indukciójának késleltetése az egyes inhibitorok koncentrációjától függ. Fontos megjegyezni, hogy a HX, TP, PX, TB, CF, 1-MU és 1,3-DMU nem gyakorolt jelentős hatást a xantin kristályosodására. Figyelemre méltó a xantin kristályosodásának ezen szelektív gátlása ezen szerkezeti szempontból hasonló vegyületek között. Így a vizsgált xantinok közül csak a metil-xantinok épülnek be a xantin kristályos hálózatába. E három inhibitor bármelyikének beépítése a xantin kristályrácsba módosítja egyes rétegek szerkezetét, ezáltal növeli a Gibbs-féle szabad energiát, és lassítja a kristály növekedését. Mivel a xantin oldhatósága viszonylag érzéketlen a vizelet pH-jára, minden gátlási vizsgálatot 6,0 pH-n hajtottunk végre. Érdekes módon a TB a húgysav kristályosodásának nagyon hatékony gátlója [11], bár a CF, PX és TP nincs hatással a húgysav kristályosodására. Ez bizonyítja a metilcsoport pozíciójának fontosságát az inhibitor hatékonyságában.

Fontos figyelembe venni, hogy az in vitro xantin-kristályosodás itt azonosított inhibitorai közül kettő a teobromin fő metabolitja. Különösen a TB fogyasztása után 20% TB-ként, 21,5% 3-MX-ként és 36% 7-MX-ként választódik ki [10]. Ezzel szemben az 1-MX nem a TB metabolitja; ehelyett a koffein fogyasztása után 19% kiválasztódik 1-MX-ként [10]. A TB nagy mennyiségben van jelen a csokoládéban és a kakaóban [12], de kevésbé tanulmányozták, mint a többi metilxantin, mert kevésbé befolyásolja a központi idegrendszert, mint más xantinok. A korábbi in vivo adatok [10,12] extrapolálása azt a becslést eredményezi, hogy a napi csak 200 mg TB bevitele 43 mg 3-MX és 72 mg 7-MX kiválasztódásához vezetne. Ezek a mennyiségek, az itt bemutatott eredményekkel összhangban, jelentősen gátolhatják a vizeletben a xantin kristályok képződését, és ezért megakadályozhatják a xanthinuriában szenvedő betegeknél a vese xantin kalkulumok kialakulását.

Eredményeink azt mutatják, hogy a TB két metabolitja - a 7-metilxantin és a 3-metilxantin - gátolhatja a xantin kristályosodását, ezért nagy klinikai potenciállal rendelkezik a nephrolithiasis megelőzésében xanthinuriában szenvedő betegeknél. A xanthinuriában szenvedő betegek klinikai vizsgálata szükséges a tuberkulózis fogyasztásának in vivo hatásainak dokumentálásához.