Az osteomyelitis (BCO) baktériumok chondronecrosisával társult baktériumközösségek molekuláris felmérése brojlerekben

Baromfitudományi tagozat, Arkansasi Egyetem, Fayetteville, Arkansas, Amerikai Egyesült Államok

Baromfitudományi tagozat, Arkansasi Egyetem, Fayetteville, Arkansas, Amerikai Egyesült Államok

Baromfitudományi tagozat, Arkansasi Egyetem, Fayetteville, Arkansas, Amerikai Egyesült Államok, Sejt- és molekuláris biológiai program, Arkansasi Egyetem, Fayetteville, Arkansas, Amerikai Egyesült Államok

Jelenlegi cím: US Food and Drug Administration (USFDA) Élelmiszer-biztonsági és Alkalmazott Táplálkozási Központ (CFSAN), College Park, Maryland, Amerikai Egyesült Államok

Társulási sejt és molekuláris biológiai program, Arkansasi Egyetem, Fayetteville, Arkansas, Amerikai Egyesült Államok

Tagság Cobb-Vantress Inc., Siloam Springs, Arkansas, Amerikai Egyesült Államok

Tieshan Jiang,
Rabindra K. Mandal,
Robert F. Wideman Jr.,
Anita Khatiwara,
Igal Pevzner,
Fiatal Min Kwon

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Jiang T, Mandal RK, Wideman RF Jr, Khatiwara A, Pevzner I, Min Kwon Y (2015) Molekuláris felmérés a baktériumok közösségeiről, amelyek társulnak a bakteriális kondronekrózissal az oszteomyelitissel (BCO) brojlerekben. PLoS ONE 10 (4): e0124403. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0124403

Akadémiai szerkesztő: Gabriel Moreno-Hagelsieb, Wilfrid Laurier Egyetem, KANADA

Fogadott: 2014. augusztus 6 .; Elfogadott: 2015. március 13 .; Közzétett: 2015. április 16

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: A projekt finanszírozását a Cobb-Vantress Inc. biztosította, Siloam Springs, Arkansas, USA. A finanszírozó támogatást nyújtott fizetés formájában a szerzői IP-hez, de semmilyen további szerepe nem volt a tanulmány tervezésében, adatgyűjtésében és elemzésében, a közzététel döntésében vagy a kézirat elkészítésében. Ezeknek a szerzőknek a konkrét szerepei a „szerzői hozzájárulások” részben vannak megfogalmazva.

Versenyző érdeklődési körök: Az IP a Cobb-Vantress Inc. alkalmazottja, amelynek cége finanszírozta ezt a tanulmányt. Nincsenek szabadalmak, fejlesztés alatt álló termékek vagy forgalmazott termékek. Ez nem változtatja meg a szerzőknek az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek betartását.

Bevezetés

Korábban a kórokozók azonosításának módszerei túlnyomórészt táptalaj-technikákra támaszkodtak, majd ezt követően biokémiai tesztek végeztek félautomata platformokkal a klinikai laboratóriumban [11]. Kultúrától független megközelítések, például a 16S rRNS génszekvenciák molekuláris profilozása, hatékony technikát nyújtanak a mikrobiális közösségek szerkezetének és sokféleségének átfogó elemzéséhez [12]. A 16S rRNS génszekvenciák hiper-változó régiókat tartalmaznak, amelyek átfogó információt nyújthatnak a baktériumok közösségéről, ideértve a sokféleséget, az összetételt és a közösség szerkezetét is [13]. A következő generációs szekvenálás, a 454 piroszekvenálás, a SOLID és az Illumina platformok fejlesztése jelentős előrelépést jelentett azáltal, hogy több százezer szekvenciát gyűjtöttek össze több mintából. Ezt az erőteljes technikát alkalmazták a komplex mikrobaközösségek összetételének vizsgálatára különféle környezetekben [14–18]. A mikrobiális közösség elemzéséhez leggyakrabban használt két platform a 454 FLX és az Illumina. A 454 FLX műszer generál

1 millió olvasás műszerenként, az olvasási hossz 250–400 bp, és az Illumina platform futásonként akár 1,5 milliárd leolvasást produkál, az olvasási hossz 50–150 bp. Az Illumina rövidebb leolvasása csökkentheti a filogenetikai felbontást, mind az operatív taxonómiai egységek (OTU-k) kiválasztása, mind az OTU-k közötti filogenetikai távolságok meghatározása szempontjából. Az Illumina platform leolvasásonkénti bázispárjainak száma megduplázható a páros végű (PE) megközelítéssel, ahol az egyes molekulák mind az 5 ’, mind a 3’ végből szekvenálódnak [19,20]. A 16s rRNS gén régiói, a V1-V2 és a V4, hosszabbak, mint 200 bp, amelyet a PE átfedés nem képes könnyen lefedni. Ugyanakkor a V3 [13] és a V6 [21,22] régiókat könnyen lefedhetik az átfedő PE olvasások.

A brojlereknél a BCO sántaság vizsgálatának egyik akadálya az alacsony előfordulási gyakorisága, ami megnehezíti a BCO sántaság szisztematikus és megbízható vizsgálatát. Nemrégiben Wideman és mtsai. drótpadlós modellt dolgozott ki, amelyben a drótpadlón emelt brojlerek megbízhatóan kiváltják a BCO magas előfordulását, következetesen anélkül, hogy a madarakat céltudatosan kitennék patogén baktériumok elé [4]. A huzalpadló által létrehozott instabil lábazat felgyorsítja az osteochondroticus mikrotörések és hasadékok kialakulását a femora és a sípcsont proximális epifízis-fizealis növekedési lemezein. A huzal padlózása (vagy az alomhoz való hozzáférés hiánya) szintén fiziológiai stresszt vált ki, amely immunszuppresszióhoz és fokozott baktérium transzlokációhoz vezethet a gyomor-bél traktusból a szisztémás keringésbe [3–5,23].

Ebben a tanulmányban az Illumina páros végű szekvenálási módszert alkalmaztuk a 16S rRNS gén V6 hiper-variábilis régiójára, a BCO sántaság drótpadlós modelljével együtt a BCO-val társult baktériumközösségek átfogó vizsgálatához.

Anyagok és metódusok

Állatkísérlet és mintagyűjtés

A madarakat minden kamrában „sétálták”, és a 15. naptól kezdve két naponta megfigyelték a sántaságot. A klinikai sántaságot mutató madarakat emberileg elpusztították és boncolták. Az elhullott és béna madarak boncolásának megfigyelését nap/dátum, nem és tollszám szerint rögzítettük. Az 56. napon az összes túlélő madarat elpusztították, lemérték és boncolták. Összesen 1372 csontmintát gyűjtöttünk 343 brojlerből (madáronként 4 minta: jobb és bal combcsont és sípcsont) a kísérlet során. Ebből a hatalmas mintatározóból 97 egyedi mintát gondosan kiválasztottak elemzésre, amelyek mind a 6 diagnosztikai kategóriát [normál proximális combcsontfej (Normal Femur)] képviselik; proximális combcsontfej-elválasztás vagy epiphyseolysis (FHS); proximális femorális fej nekrózis (FHN); normál proximális sípcsontfej (Normal Tibia); tibialis fej nekrózis (THN); tibialis fej nekrózis súlyos vagy kazeusos (THNsc)], mind a 7 korosztály, mindkét padlótípus (alom vs. huzal), mindkét genetikai vonal és mindkét testrész (jobb és bal) (S1 táblázat).

Az elváltozások makroszkopikus osztályozása

A combcsontokat és a sípcsontokat makroszkopikus megjelenés szerint kategorizálták a következő diagnosztikai kategóriák szerint: Normál combcsont; FHS; FHN; Normális sípcsont; THN; THNsc. Valamennyi kísérletben a proximális femoralis fejelváltozásokat külön kategorizáltuk (FHS vagy FHN), és a tibialis fej nekrózisának két szintjét külön (THN vagy THNsc), hogy hangsúlyozzuk a BCO elváltozások progresszív súlyosságát [4], ahogyan ezt ábrázoljuk. az 1. ábrán.