A Brassica integrált membrán S-locus receptor kináza szerin/treonin kináz aktivitással rendelkezik membrános környezetben, és spontán oligomereket képez planta

Közli: Roland Douce, Grenoble Egyetem, Grenoble, Franciaország

integrált

Rekombináns SRK3 fehérjék expressziója rovarsejtekben. (A) A három rekombináns SRK fehérje, az SRK3HA, az SRK3His és az m SRK3His sematikus ábrázolása. Megjelenik a különböző epitópok és címkék helyzete. A rekombináns fehérjék N és C vége balra, illetve jobbra található. A fehér téglalap az S-domént (S), a fekete függőleges sáv a membránt átívelő (tm) domént jelöli, a kikelt téglalap jelzi a citoplazmatikus domént (kin), a világos és sötétszürke színű téglalapok pedig a HA epitópot és a hexahistidin címkét ill. Különböző antitestek által felismert epitópokat és a Ni-NTA kötődési helyét jelzik. Az L SR-553 helyettesítését argininnel (K-> R) az m SRK3His konstrukcióban függőleges nyílhegy jelzi. (B) SRK rekombináns fehérjék immunblottozása. A szülői bakulovírus (C) (1. és 3. sáv) által fertőzött Sf21 sejtekből vagy az SRK3HA (HA) (HA) (2., 4., 6. és 7. sáv) vagy SRK3His (His) expresszióját vezető bakulovírussal fertőzött Sf21 sejtekből kivont fehérjék (az 5. és 8. sávot) SDS/PAGE-vel elválasztottuk és elektroblotoltuk. Bizonyos esetekben az elektroforézist Ni-NTA agaróz gyöngyökkel végzett tisztítás előzte meg, a jelzések szerint.

Rekombináns SRK autofoszforilátok szerin és treonin maradványokon membrános környezetben. (A) Nem fertőzött Sf21 sejtekből (C) vagy SRK3HA-t (HA), SRK3His (His) vagy kinázhibás m SRK3His-t (m His) expresszáló Sf21-sejtekből származó mikroszómákat radioaktívan jelöltünk [y-32P] ATP-vel. Bizonyos esetekben a fehérjéket (4. és 5. sáv) rádiójelzés után Ni-NTA agaróz gyöngyökön tisztítottuk. A fehérjéket SDS/PAGE-vel elválasztottuk és autoradiográfiával detektáltuk. (B) A radioaktívan jelzett SRK3His-t Ni-NTA agaróz gyöngyökön tisztítottuk és hidrolizáltuk. A szabad aminosavakat két dimenzióban választottuk el kromatográfiával és elektroforézissel a jelzésnek megfelelően, és a radioaktívan jelölt aminosavakat autoradiográfiával detektáltuk. A foszfoaminosavakat (P-ser, P-thr és P-tyr foszfozerin, foszfotreonin és foszfotirozin esetében) úgy helyeztük el, hogy az elválasztás előtt hozzáadott, nem radioaktívan jelölt foszfoaminosavakat nihidrinnel festettük. Pi jelentése szervetlen foszfát.

Rekombináns SRK fehérjék intermolekuláris foszforilációja. SRK3HA-t (HA) vagy kinázhibás m SRK3His-t (m His) expresszáló Sf21 sejtek mikroszómáit, vagy m SRK3His-t és SRK3HA-t együtt expresszáló Sf21 sejtek mikromoszómáit radioaktívan jelöltük, és a hexahistidin-taget tartalmazó fehérjéket Ni-NTA-n tisztítottuk. agaróz gyöngyök. A 4. sávban bemutatott mintához az m SRK3His-t expresszáló sejtek jelöletlen mikroszómájának kivonatait adtuk hozzá, mielőtt Ni-NTA agaróz gyöngyökön tisztítottuk volna. A Ni-NTA agaróz gyöngyökből eluált fehérjéket SDS/PAGE-val elválasztottuk és autoradiográfiával elemeztük. A csonka rekombináns SRK3 és a szennyező polipeptideket szürke nyílhegyek, a foszforilezett SRK-t pedig nyíl jelzik.

SRK oligomer komplexek azonosítása stigma kivonatban. (A) A fehérjéket az S3 haplotípust expresszáló stigmákból extraháltuk Triton X-100 tartalmú pufferben, és vagy térhálósító reagenssel, glutáraldehiddel kezeltük (+) vagy nem (-). Ezután a fehérjéket SDS/PAGE-vel elválasztottuk, és immunoblotként 85-36-71 mAb-vel készítettük. Az SRK3-at tartalmazó 161 és 233 kDa komplexeket nyilak jelzik. A monomer SRK3 és eSRK3 csillaggal, illetve nyílhegyrel vannak jelölve. (B) Sebesség ülepedés szacharóz gradienseken. A fehérjéket oktil-glükozidot tartalmazó pufferben extraháltuk, és a stigma kivonatokat vagy SDS-sel egészítettük ki 0,5% (tömeg/térfogat) (+ SDS) koncentrációban, vagy nem (-SDS). Az SRK3 (SRK), az eSRK3 (eSRK) és az SLG3 (SLG) jelenlétét a különböző frakciókban 85-36-71 monoklonális antitesttel és anti-SLG3 antitestekkel végzett immunblottozással vizsgáltuk. A molekulatömeg-markerek (66, 150 és 200 kDa) eloszlását az egyes panelek alján mutatjuk be.

Két modell az SRK-n keresztüli jelátvitel molekuláris mechanizmusához az SI válaszban. (A) Ez a modell azt javasolja, hogy az SRK (nyitott téglalap) spontán asszociálódjon dimerként a stigmatikus papilláris sejtek plazmalemmájában a beporzás előtt. Az ön pollen által hordozott ligandummal (kitöltött kör) való kölcsönhatás az SRK konformációs változását váltja ki, amely lehetővé teszi az SI választ közvetítő citoplazmatikus célpontok (nagy kikelt körök) toborzását. Az itt bemutatott példában a citoplazmatikus célpontok felismerik az SRK fehérje foszforilezett maradványait (kis köröket). (B) A második modellben az SRK konstitutívan képződött dimerként is jelen van, de a SI-válasz pollen-ligandum általi aktiválásához (fekete) mind az SRK-hoz való allél-specifikus kötődésre van szükség, majd a másodikhoz való kötődésre még ismeretlen coreceptor (kikelt téglalap), amelynek nem kell semmiféle allélspecificitást mutatnia. A szignáltranszdukció ezután magában foglalhatja a második receptor interakcióját a citoszolos célpontokkal, hasonlóan az állatok szerin/treonin receptor kinázainak leírásához.