A Cathepsin K knockout enyhíti az öregedés okozta szívműködési zavarokat

Gyógyszerésztudományi Osztály és Kardiovaszkuláris Kutatási és Alternatív Gyógyászati Központ, Gyógyszerészeti Iskola, Egészségtudományi Főiskola, Laramie, WY, 82071 USA

WWAMI orvosi oktatás, Egészségtudományi Főiskola, Wyomingi Egyetem, Laramie, WY, 82071 USA

Matematikai Tanszék, Indiana University of Pennsylvania, Indiana, PA, 15705 USA

Orvosi Osztály, Brigham és Női Kórház, Harvard Medical School, Boston, MA, 02115 USA

Gyógyszerésztudományi Osztály és Kardiovaszkuláris Kutatási és Alternatív Gyógyászati Központ, Gyógyszerészeti Iskola, Egészségtudományi Főiskola, Laramie, WY, 82071 USA

Dr. Sreejayan Nair, Kardiovaszkuláris Kutatási és Alternatív Gyógyászati Központ, Gyógyszerészeti Iskola, Egészségtudományi Főiskola, Wyomingi Egyetem, Laramie, WY 82071, USA. Tel .: (307) 766 6138; fax: (307) 766 2953; email: [email protected]

Gyógyszerésztudományi Osztály és Kardiovaszkuláris Kutatási és Alternatív Gyógyászati Központ, Gyógyszerészeti Iskola, Egészségtudományi Főiskola, Laramie, WY, 82071 USA

WWAMI orvosi oktatás, Egészségtudományi Főiskola, Wyomingi Egyetem, Laramie, WY, 82071 USA

Matematikai Tanszék, Indiana University of Pennsylvania, Indiana, PA, 15705 USA

Orvosi Osztály, Brigham és Női Kórház, Harvard Medical School, Boston, MA, 02115 USA

Gyógyszerésztudományi Osztály és Kardiovaszkuláris Kutatási és Alternatív Gyógyászati Központ, Gyógyszerészeti Iskola, Egészségtudományi Főiskola, Laramie, WY, 82071 USA

Dr. Sreejayan Nair, Kardiovaszkuláris Kutatási és Alternatív Orvostudományi Központ, Gyógyszerészeti Iskola, Egészségtudományi Főiskola, Wyomingi Egyetem, Laramie, WY 82071, USA. Tel .: (307) 766 6138; fax: (307) 766 2953; email: [email protected]

Összegzés

Bevezetés

A szív- és érrendszeri betegségek a halandóság legfőbb oka a fejlett világban, és az életkor fontos meghatározója a szívműködésnek. A szív- és érrendszeri betegségekkel összefüggő morbiditási és halálozási arány az időseknél lényegesen magasabb, mint a fiatalabb generációké. A szív öregedése egy komplex patofiziológiai folyamat, amelyet számos biológiai esemény kísér, beleértve a szív átalakulását és diszfunkcióját (Lakatta, 1999; Boengler et al., 2009). Az öregedéssel összefüggő szívműködési rendellenességek a diasztolés szívműködési zavarokban, a szív hipertrófiájában és fibrózisában, valamint a kontraktilis funkció károsodásában nyilvánulnak meg (Yang et al., 2005; Taneike et al., 2010; Hua et al., 2011). Bár a szív öregedését elősegítő pontos mechanizmusok korántsem egyértelműek, számos posztulátumot javasoltak. Ide tartoznak az öregedés által kiváltott mitokondriális károsodások, a reaktív oxigénfajok felhalmozódása, az intracelluláris Ca 2+ homeosztázis megszakadása és a gerjesztés-összehúzódás szétkapcsolásának károsodása (Yang et al., 2005, 2006). A legújabb vizsgálatok szerint a kaszpázfüggő és a kaszpázfüggetlen apoptózis fontos szerepet játszik a szív öregedésében (Chiong et al., 2011).

Eredmények

A Cathepsin K knockout csökkenti a testtömeget, a szívtömeget és a máj súlygyarapodását az öreg egereknél

Amint az 1. táblázat mutatja, a vad típusú (WT) idős egerekben a testtömeg, a szívtömeg és a máj súlya megnőtt a fiatal egerekhez képest, és ezeket a növekedéseket a katepszin K knockout egerekben csillapították.

Paraméterek WT ‐ young WT ‐ old Ctsk-/- -fiatal Ctsk-/- -régi

Testtömeg (g)	23,55 ± 0,68	27,1 ± 1,27a a P	24,39 ± 0,79	25,96 ± 0,57
Szívtömeg (g)	0,125 ± 0,007	0,182 ± 0,006a a P	0,134 ± 0,008	0,158 ± 0,006b b P -/- - Fiatal csoport. , c c P
Májsúly (g)	1,359 ± 0,051	1,602 ± 0,037a a P	1,557 ± 0,084	1,409 ± 0,080
Vese súlya (g)	0,279 ± 0,011	0,438 ± 0,020a a P	0,381 ± 0,026	0,423 ± 0,027
Léptömeg (g)	0,088 ± 0,006	0,11 ± 0,009a a P	0,099 ± 0,005	0,096 ± 0,015
HW/BW (mg g −1)	5,440 ± 0,146	6,741 ± 0,302a a P	5,512 ± 0,292	6,093 ± 0,211
LW/BW (mg g −1)	59,211 ± 0,656	59,378 ± 0,347	63,996 ± 3,340	54,646 ± 3,619

Az értékek átlag ± SEM, n = 6-10 egér csoportonként.
aPbP-/- - Fiatal csoport.
cP

A Cathepsin K knockout enyhíti az öregedéssel járó károsodást a szívteljesítményben

Az echokardiográfiai elemzések eredményei a szívteljesítmény romlását mutatták a WT-öreg egerekben, amit a bal kamrai end-diastolés dimenzió (LVEDD), a bal kamra end-szisztolés dimenziójának (LVESD) növekedése, valamint a csökkent frakcionális rövidülés (FS) bizonyít ( 1B – D). A Cathepsin K knockout egyeztette az LVEDD és az FS változását anélkül, hogy az LVESD-t jelentősen megváltoztatta volna (1B – D ábra).

A Cathepsin K kiütés csillapítja az öregedéssel összefüggő egyetlen kardiomiocita kontraktilis diszfunkciót

A katepszin K kiütésnek az öregedéssel társuló szívizom diszfunkcióra gyakorolt hatásának további vizsgálatához értékelték az egyes kardiomiociták összehúzódási funkcióját. Bár a nyugalmi sejthosszat sem az életkor, sem a genotípus nem befolyásolta (2A. Ábra), az öregedés a csúcs rövidülésének (PS), a rövidülés/megerõsödés maximális sebességének (± dL/dt), az idõtõl a csúcsig rövidülésének ( TPS), valamint az erősítésig eltelt idő (TR90). A katepszin K genetikai ablációja megakadályozta a PS és a TR90 korral járó változásokat (2B, F ábra) anélkül, hogy befolyásolta volna a ± dL/dt és a TPS értékeket (2C – E ábra).

A katepszin K kiütés javítja az öregedéssel összefüggő intracelluláris Ca 2+ -tal való rossz kezelést egyetlen kardiomiocitában

Mivel az intracelluláris Ca 2+ kulcsfontosságú ion a szív összehúzódó funkcióiért, igyekeztünk értékelni a kardiomiocita Ca 2+ kezelését az öregedés hatására. Amint az várható volt, az öregedés a kardiomiociták károsodott intracelluláris Ca 2+ kezelésével járt együtt (Támogató információ, S1. Ábra). Ezt bizonyította a nyugalmi intracelluláris Ca 2+ szint emelkedése, valamint az intracelluláris Ca 2+ bomlási sebesség növekedése. Érdekes módon ezeket a változásokat az idősebb katepszin K knockout egereknél is megfigyelték (S1A, C és D ábra). Ezzel szemben a katepszin K kiütése egyeztette az intracelluláris Ca 2+ felszabadulás korral járó csökkenést (S1B ábra).

A Cathepsin K knockout gátolja a korral összefüggő kardiomiocita hipertrófiát, a fibrózis megváltoztatása nélkül

A megnövekedett szívtömeggel összhangban a WT egerek kardiomiocitáinak mérete megnőtt az öregedés hatására, amit a búzacsíra agglutinin (WGA) festése is bizonyít (3A, B ábra). Érdekes módon a kardiomiocita méretének ez az öregedés által okozott növekedése nem volt látható a katepszin K knockout egerekben (3A. Ábra, B). Mivel a szív öregedése általában megnövekedett fibrózissal jár, a következőkben felmértük a fibrózis mértékét ezen egerek szívében. Ahogy az várható volt, a fibrózis területe szignifikánsan megemelkedett a szívben a WT-öreg egerekben, a WT-fiatal egerekéhez képest. A katepszin K törlése azonban nem gátolta a szívfibrózis korral járó növekedését (3C. Ábra, D ábra).

A katepszin K kiütés gyengíti az életkorral összefüggő szív lipofuscin felhalmozódását és a sejtciklus lassítók expresszióját

Ezután értékeltük a lipofuscin pigmentek szívben való felhalmozódását, az öregedés „árulkodó” jelét. Eredményeink a szív lipofuscin robusztus felpörgetését mutatják be WT-öreg egerekben, amelyet katepszin K kiütés elnyomott (4A. Ábra). Továbbá, összhangban a korábbi megfigyelésekkel (Krishnamurthy et al., 2004; Naito et al., 2010), a p16 és a p21 sejtciklus-lassító fehérjék expressziós szintje megemelkedett a WT-öreg egerek szívében, amelyet katepszin K kiütés gyengített (4B. Ábra és S2A, B ábra).

A Cathepsin K knockout nem változtatja meg az életkorral összefüggő oxidatív stresszt a szívben: megemelkedett oxidatív szint az öregedő szívben

A szív oxidatív stresszének szintjét glutation (GSH)/glutation diszulfid (GSSG) vizsgálatokkal határoztuk meg. Amint a 4B. Ábra mutatja, a GSH szintjének életkorral összefüggő csökkenését a katepszin K leütése nem változtatta meg, ami arra utal, hogy a katepszin K kiütése nem csökkentheti az oxidatív stresszt.

A katepszin K-hiány gátolja az Akt és az IGF-1 korral az életkorral összefüggő bazális foszforilációját

Mivel beszámoltak arról, hogy az inzulin jelátviteli út részt vesz az öregedési folyamatban, ezután értékeltük a foszforilált Akt és az IGF ‐ 1, az inzulin jelátviteli út legfontosabb mediátorainak szívszintjét. Észrevettük az Akt és az IGF-1 foszforilációjának megemelkedését az öregedés hatására, amelyet a katepszin K knockout egerekben csillapítottak (4D. Ábra).

A katepszin K-hiány tompítja a kaszpázfüggő és a kaszpázfüggetlen apoptózist a szív öregedésének hatására

Vita

Vizsgálataink összességében azt sugallják, hogy a katepszin K kiütése egerekben és az siRNS által közvetített katepszin K elnémítása kardiomiocitákban megakadályozza az öregedéssel összefüggő károsodást a sejt geometriájában és működésében. Adataink azt sugallják, hogy a katepszin K-hiány védő szerepe a szív öregedésében az öregedéssel járó szív apoptózisának, köztük a kaszpáz-függő és a kaszpáz-független apoptózis deaktiválásának tulajdonítható, és ezáltal véd a szívműködési zavarokkal szemben (S5. Ábra). Bár a katepszin K-deléció pontos molekuláris mechanizmusai, amelyek megvédik a szíveket az öregedéstől, további vizsgálatokat igényelnek, eredményeink validálják a katepszin K szerepét az életkorral összefüggő szív-rendellenességekben. Ezek a megfigyelések különösen jelentősek, figyelembe véve azt a tényt, hogy a katepszin K-gátlók, amelyek jelenleg az oszteoporózis klinikai vizsgálata alatt állnak, kettős előnyökkel járhatnak a szív- és érrendszeri betegségek kezelésében. Ez különösen fontos eredmény, tekintettel gyorsan növekvő idős népességünkre.

kísérleti eljárás

Kísérleti állatok

A kísérleti protokollokat a wyomingi egyetem állat-egészségügyi és gondozási bizottsága hagyta jóvá. 6 hónapos („fiatal” jelölésű) és 24 hónapos („régi” jelölésű) Cathepsin K globális kieső egerek (Ctsk -/- ) és WT kontroll (C57BL/6J) egereket használtunk ebben a vizsgálatban. Az összes egeret klímavezérelt környezetben (22,8 ± 2,0 ° C, 45-50% páratartalom) helyeztük el, 12/12-es fény/sötét ciklus mellett, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez.

Echokardiográfiai értékelés

Kardiomiocita izoláció és mechanika

Az egér kardiomiocitákat liberáz enzimatikus emésztéssel izoláltuk; a mechanikai tulajdonságokat egy IonOptix ™ soft-edge rendszer (IonOptix, Milton, MA, USA) segítségével értékeltük, a korábban leírtak szerint (Hua et al., 2011). A sejtek rövidülését és megerősödését PS, TPS, TR90 és ± dL/dt alkalmazásával értékeltük.

Intracelluláris Ca 2+ tranziensek

A myocyták egy csoportját 15 percig fura ‐ 2/AM-vel (0,5 μm) töltöttük, és a fluoreszcencia intenzitását kettős gerjesztésű fluoreszcencia fotomultiplikátor-rendszerrel (IonOptix) rögzítettük. A sejteket egy 75 W-os lámpa által kibocsátott fénynek tettük ki, miközben 0,5 Hz frekvencián összehúzódásra ösztönöztük őket. A fluoreszcencia-emissziókat 480 és 520 nm között detektáltuk; a fura ‐ 2 fluoreszcencia intenzitás (FFI) kvalitatív változására a két hullámhosszon (360/380) tartozó FFI arány alapján következtettünk. A fluoreszcencia bomlási sebességét az intracelluláris Ca 2+ - tisztulás (Hua et al., 2011).

Szövettani elemzés

A kamrai szöveteket FITC-konjugált WGA-val (Sigma, St. Louis, MO, USA) festettük, és a kardiomiocita keresztmetszeti területét 100 véletlenszerűen kiválasztott kardiomiocitából számszerűsítettük. A szívizom fibrotikus területét Masson trichrome festésével (Sigma) értékeltük.

TUNEL festés

Az apoptotikus kardiomiocitákat az In situ halál detektáló készlet (Roche, Branchburg, NJ, USA) segítségével detektáltuk, a miocitákat Desmin antitesttel (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) ellenfestettük és Zeiss konfokális mikroszkóppal figyeltük meg. A TUNEL-pozitív sejteket 1000 random kardiomiocita számolásával számszerűsítettük.

Redukált és oxidált glutation (GSH és GSSG) meghatározása

A szív glutation tartalmát a korábban leírtak szerint mértük (Guo et al., 2009). A szövetmintákat pikrinsavban ultrahanggal kezeltük és 13 500 ° C-on centrifugáltuk g 20 percig. Ezután a felülúszót két alikvotra osztottuk. Az egyiket a teljes GSH vizsgálatra, a másikat a GSSG vizsgálatra használták. 100 μl felülúszó frakciókat 2 μl vinil-piridinnel inkubáltunk szobahőmérsékleten 1 órán át, hogy a GSH-t eltávolítsuk a GSSG meghatározásához. A GSG szintjének kiértékeléséhez a GSSG-t kivontuk a teljes glutationból. A GSH-t a DTNB-glutation-reduktáz újrahasznosítási mechanizmusa határozta meg.

Western blot elemzés

A fehérjét RIPA lízispufferrel extraháltuk, és Western blot segítségével p16, p21 (Proteintech Group, Chicago, IL, USA) antitestek ellen citokrómot használtunk. c, Bax, Bcl-2, hasított PARP-t, AIF-et, COXIV-et (a mitokondriális fehérjék terhelésének kontrolljaként használtak) és a GAPDH-t (terhelés-szabályozás, Cell Signaling Technology). A jelet Bio-Rad kalibrált denzitométerrel (Hercules, CA, USA) detektáltuk.

Lipofuscin vizsgálat

A fagyott szívszöveteket kloroform – metanol (1:20, w: v) elegyben homogenizálták. A kloroformban gazdag fázist metanollal elkevertük, 15 perces 15 000-es centrifugálást követően g. A mintában a fluoreszcenciát 350 nm gerjesztési hullámhosszon és 485 nm emissziós hullámhosszon mértük spektrofluorométerrel (Molecular Devices, SpectraMAX Gemini XS, CA, USA) (Shinmura et al., 2011). Az adatokat fluoreszcencia intenzitásként fejeztük ki 100 mg szövetenként.

Sejtkultúra és RNS csendesítés

A H9c2 myoblastokat DEME táptalajban tenyésztettük és 80% -os összefolyásig növesztettük. A sejteket doxorubicinnel (0,1 μm, 48 óra) kezeltük a korai öregedés kiváltása érdekében (Spallarossa et al., 2009). A katepszin K fehérje hiányát RNS csendesítési technikával érték el. Röviden, a katepszin K vagy a kontroll nem célzott siRNS elleni kis interferáló RNS-eket DharmaFECT ® transzfekciós reagenssel (GE Healthcare, Lafayette, CO, USA) transzfektáltuk a gyártó utasításai szerint.

Az AIF immunfestése H9c2 sejtekben

Az AIF és DAPI kettős festését alkalmaztuk az AIF helyének megjelölésére. Röviden, a sejteket 4% paraformaldehidben rögzítettük 15 percig, majd 0,2% Triton X ‐ 100-val 15 percig permeabilizáltuk. A sejteket ezután 5% -os BSA-ban blokkoltuk 30 percig, majd az AIF elleni antitesttel inkubáltuk 4 ° C-on egy éjszakán át, majd inkubáltuk nyúlellenes Alexa Fluor® 568 antitestben (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). 37 ° C-on 60 percig. A sejteket DAPI ellenfestette és Zeiss konfokális mikroszkóp alatt nézte.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be (SEM = az átlag standard hibája). A statisztikai összehasonlításokat varianciaanalízissel (anova), majd Tukey-val végeztük post hoc több összehasonlító teszt a sigmaplot szoftver segítségével (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA). Bárhol jeleztük, a statisztikai szignifikancia validálásához az r statisztikai szoftverben (The R Foundation for Statistical Computing, Bécs, Ausztria) végrehajtott permutációs teszteket végeztük el az rmPerm csomaggal. A nullhipotézist akkor utasították el P

Finanszírozási információk

Ezt a projektet részben az Országos Kutatási Források Központjának (P20RR016474) és az Országos Általános Orvostudományi Intézet (P20GM103432) támogatásai támogatták.

Összeférhetetlenség

A szerzőknek nincs más összeférhetetlenségük.

Szerző hozzájárulás

YH - megtervezte a kísérleteket, elvégezte a vizsgálatot és elkészítette a kéziratot; GPS - áttekintette a kéziratot és hozzájárult a megbeszéléshez; TJR - segített a statisztikákban és a kézirat áttekintésében; YC - segíti a statisztikai programot; JR - áttekintette a kéziratot, hozzájárult a vitához, segített az echokardiográfiában és a kalcium mérésében; SN - konceptualizálta a tanulmányt, hozzájárult a vitához és elkészítette a kéziratot.

S1. Ábra Intracelluláris Ca2 + tranziensek kardiomiocitákban fiatal vagy idős vad típusú (WT) és katepszin K kiütéssel (Ctsk -/-) egerek.

S2. Ábra A katepszin K kiütés hatása a ciklin-függő kináz inhibitorokra fiatal és idős egerekben.

S3. Ábra A katepszin K kiütés hatása apoptotikus markerekre fiatal és idős egerekben.

S4. Ábra A katepszin K elnémításának hatása a doxorubicin (DOX) által kiváltott korai öregedésre a tenyésztett H9C2 sejtekben.

S5. Ábra A katepszin K szerepének sematikus ábrázolása az életkor okozta szívműködési zavarokban.

Kérjük, vegye figyelembe: A kiadó nem felelős a szerzők által szolgáltatott bármilyen kiegészítő információ tartalmáért vagy működéséért. Bármilyen kérdést (a hiányzó tartalom kivételével) a cikk megfelelő szerzőjéhez kell irányítani.