A chlamydia aterogén hatása a szérum koleszterinszintjétől függ és specifikus a Chlamydia pneumoniae-ra

He Hu

1 Orvosi Mikrobiológiai Osztály, 2 Élettani Tanszék és 3 Agyvérzés és Érbetegségek Osztálya, St. Boniface Általános Kórház Kutatóközpont, Manitobai Egyetem, Winnipeg, Manitoba, Kanada R3E 0W3

Grant N. Pierce

Guangming Zhong

Absztrakt

J. Clin. Invest. 103.: 747–753 (1999).

Bevezetés

Az érelmeszesedés az elsődleges oka a szívizom- és agyinfarktusoknak. Noha az érelmeszesedés számos kockázati tényezőjét azonosították, az érelmeszesedés etiológiája még mindig nem egyértelmű. A sok azonosított kockázati tényező közül a hiperlipidémia a leggyakoribb és legfontosabb tényező (1). Ezenkívül a legújabb tanulmányok (2–4) meggyőző bizonyítékokat mutattak be, amelyek arra utalnak, hogy a Chlamydia pneumoniae fertőzés szerepet játszik az érelmeszesedésben. Először is, az atherosclerosisban szenvedő betegek vérében a C. pneumoniae elleni antitestek gyakorisága magasabb, mint a kontroll alanyokban (5, 6). Másodszor, különböző laboratóriumok tanulmányai szerint a C. pneumoniae közvetlen kimutatásáról számoltak be az érelmeszesedésben szenvedő betegek artériáiban, de nem a kontroll artériákban, beleértve a szívátültetés után károsodott artériákat is (7–9). Harmadszor: a makrofágok in vitro fertőzése C. pneumoniae-val habsejtképződést indukálhat (10). Azonban még mindig nem ismert, hogy a C. pneumoniae fertőzés okozati szerepet játszik-e az érelmeszesedésben, és a szérum koleszterin hozzájárul-e a C. pneumoniae atherogén hatásaihoz.

Az emberi chlamydia fertőzéseket gyakran két klamídiumfaj, a C. trachomatis és a C. pneumoniae törzse okozza. A C. trachomatis emberi törzsei különféle okuláris és urogenitális fertőzéseket okoznak, míg a C. trachomatis egér törzse egér tüdőgyulladást okoz, amelyet ezért egér tüdőgyulladás kórokozónak (MoPn) neveznek. A C. pneumoniae egy újonnan izolált klamidiumfaj az emberi légutakból (11). A C. pneumoniae fertőzés gyakori, és világszerte a felnőttek körülbelül 50% -ának van antitestje a C. pneumoniae ellen (12). Jóllehet a C. pneumoniae által okozott emberi légúti fertőzések nemrégiben ateroszklerózissal társultak, a C. trachomatis által okozott okuláris és urogenitális fertőzéseket egyetlen kardiovaszkuláris patogenezisben sem jelezték. Érdekes lesz összehasonlítani ennek a két klamidiális fertőzésnek az érelmeszesedés kialakulására gyakorolt hatását, mivel egy ilyen összehasonlítás megkönnyíti a C. pneumoniae fertőzés ateroszklerózisban betöltött pontos szerepének megértését.

Mód

Szervezetek.

A C. pneumoniae AR39 törzs organizmusait (Washington Research Foundation, Seattle, Washington, USA) Hep-2 sejtekben növesztettük (24), az egér C. trachomatis MoPn törzsét pedig HeLa sejtekben növesztettük a korábban leírtak szerint (25, 26). . Az élő organizmusokat megtisztítottuk, szacharóz-foszfát-glutaminsav-pufferben (pH 7,4) osztottuk el, és –80 ° C-on tároltuk, amíg egér beoltására nem használtuk.

Kísérleti terv.

Az érelmeszesedés morfometriai meghatározása.

Keresztmetszetek és szövettan.

Chlamydial antigén festés.

Néhány aortaív keresztmetszetét klamidiális antigénfestésnek vetettük alá. Az aceton permeabilizálása és az endogén peroxidáz kioltása céljából 0,2% H2O2-val történő kezelés után a metszeteket klamidiális LPS elleni monoklonális antitesttel (EV1-H1, egér IgG2a; H. Caldwell kérte szívesen a Rocky Mountain Laboratories-tól, National Institute of Health)., Hamilton, Montana, USA; ref. 27) és egy C. pneumoniae-specifikus antitest (D1E8, egér IgG1; publikálatlan adataink). Az elsődleges antitestkötést torma-peroxidázzal konjugált kecske anti-egér IgG-vel vizsgáltuk (Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Ontario, Kanada). Oldhatatlan 4-klór-1-naftol szubsztrátot (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) alkalmaztunk az antitestkötés vizualizálására. A klamidiális antigénekre pozitívan festett minták szomszédos szekcióit az imént leírt antitestekkel használtuk az izotípus kontroll festéshez. Az összes festett mintát Zeiss mikroszkóp alatt (Thornwood, New York, USA) fényképeztük, amely differenciális interferencia-kontrasztos hűtésű kamerával volt felszerelve 20 × vagy 63 × objektíves lencsékkel.

Szérum lipoprotein elemzés.

Vért vettünk minden egérből az aorta perfúziója előtt. A szérumokat anti-chlamydial antitest titráláshoz és lipid analízishez használták. A szérum összes koleszterin-, triacil-glicerin- és nagy sűrűségű lipoproteint (HDL) Hitachi 917 vizsgálati rendszerrel (Boehringer Mannheim Kanada, Laval, Quebec, Kanada) mértük az Egészségtudományi Centrum Klinikai Biokémiai Osztályának (Winnipeg, Manitoba, Kanada). Az alacsony sűrűségű lipoproteint (LDL) az alábbiak szerint számítottuk: LDL koncentráció (mmol/l) = összkoleszterin - (HDL + triacil-glicerin × 0,46).

A klamidiális antigénspecifikus antitestek titrálása egérszérumokban.

Az egér szérum antitesteket a C. pneumoniae AR39 vagy a C. trachomatis MoPn törzs organizmussal fertőzött HeLa sejtek alkalmazásával mértük antigénekként immunocitokémiai vizsgálatban. A klamidia-fertőzött HeLa-sejteket hagytuk, hogy 96 lyukú szövetkultúra-lemezekhez kapcsolódjanak, és a hozzá kapcsolt egyrétegeket 4% paraformaldehiddel (Sigma Chemical Co.) rögzítették, majd ezt követően 0,5% -os szaponinnal (Sigma Chemical Co.) permeabilizálták. PBS-ben sorozatosan hígított antiszérumot alkalmaztunk a fertőzött HeLa-sejt monorétegekre. Az első antitestkötést egy torma-peroxidázzal és oldhatatlan 4-klór-1-naftol szubsztráttal konjugált kecske anti-egér IgG-vel detektáltuk. Az adott szérum legnagyobb hígítását, amely még nyilvánvaló klamidiális zárványt képes felfedni, a szérum titereként határoztuk meg. Az immunocitokémiai vizsgálatot széles körben alkalmazták a klamidiális antigének kimutatására (4), és az ezzel a vizsgálattal nyert antitest-titereket a szokásos ELISA módszerrel reprodukálták (25).

Statisztikai analízis.

A különböző állatcsoportok közötti különbségek elemzéséhez a Student t tesztjét (párosítatlanul) használtuk.

Eredmények

Aorta ateroszklerózis kiváltása magas koleszterintartalmú étrendben lévő LDLR KO egerekben.

Kilenc hónapos kezelés után 5–8 mmol/l összszérum koleszterinszintet mutattak ki az LDLR KO egerekben, akiket rendszeres egérstoppal tápláltak, míg a 2% koleszterintartalmú étrendet tápláló egerek kétszer-háromszoros növekedést mutattak. a teljes szérum koleszterinszintben (ábra (1. ábra 1 a). A teljes koleszterinszintet elsősorban az LDL alkotta (ábra (1. ábra, 1 b és az adatok nem láthatók), ami összhangban van a korábbi megfigyelésekkel (15 A C. pneumoniae AR39 vagy a C. trachomatis MoPn törzsekkel végzett chlamydialis fertőzés sem a szérum összes koleszterin-, sem LDL-szintjét nem változtatta meg. A szérum koleszterinszint növekedése korrelációban állt az aorta érelmeszesedéses elváltozásának fejlődésével (ábra Valamennyi egér, akinek a táplálékát egy normál egérstáppal etették, nagyrészt normális aorta luminalis felülettel (2. ábra, 2. ábra, a panel) és keresztmetszetekben normális aortafalszerkezettel rendelkezett (ábra (2. ábra). 2., 2., g) panel. Miután azonban kilenc hónapig magas koleszterinszintű étrendet tápláltak, minden egér kifejlődik d tipikus érelmeszesedési elváltozások az aortaív és a carotis artériák területén (1. ábra). (2., 2. ábra, b panel). A keresztmetszeti elemzésből kiderült, hogy ezek az elváltozások főként zsíros csíkok voltak, nyilvánvaló rostos kupak nélkül (ábra (2. ábra, h panel), ami összhangban van a korábbi megfigyelésekkel (16).

Összes koleszterin (a) és kis sűrűségű lipoprotein (b) szintek (átlag ± SE-ben az y tengely mentén) az LDLR KO egerek szérumában az étrendi koleszterin-kiegészítés és a két különböző klamidia törzs (az x tengely mentén) fertőzés függvényében. A klamidiális fertőzéstől függetlenül az egerek magas koleszterinszintű étrendet (önmagában magas koleszterinszintű étrendet [n = 7], vagy plusz MoPn [n = 4] vagy AR39 [n = 7] fertőzést) tápláltak, a szérum összes koleszterinszintje kétszer-háromszor magasabb volt (a) vagy alacsony sűrűségű lipoprotein (b) szintek, mint az egerek, akiket rendszeres egér-chow-val etettek (normál táplálék [n = 7] nélkül vagy MoPn [n = 4] vagy AR39 [n = 7] fertőzéssel). LDLR-KO, kis sűrűségű lipoprotein receptor kiütés.

Reprezentatív képek az egér aorta luminalis felületéről (felül) és az aorta íve keresztmetszeteiről (alul) hematoxilin és eozin festés után. Hat egércsoportból származó aortát izoláltunk a luminalis felületi elváltozás megfigyelésére előzetes festés nélkül (panelek a – f). Megmutattuk az egész aorta luminalis felületét az aortaívtől (balra) a bifurkációig (jobbra). A világos színű ateroszklerotikus elváltozások könnyen észrevehetőek voltak a magas koleszterintartalmú étrenddel etetett egerek aortájában (b, d és f panelek), a normál táplálékkal táplált egereknél (a, c és e panelek) azonban nem. . Néhány sérülést a szudánvörös színnel tovább festettek, hogy ellenőrizzék a lipidtartalmat (az adatokat nem közöljük) a képek megszerzése után. Az imént leírt minták aortaívének részeit felhasználva hematoxilin- és eozinfestésre (g – l panelek) készítettünk metszeteket az elváltozás súlyosságának értékelésére. A képeket Zeiss mikroszkóppal készítettük 20 × objektíves objektív segítségével.

Mind az AR39, mind a MoPn antigént detektáltuk a megfelelő klamidiális törzsekkel intranazálisan fertőzött egerek aortájában.

A normál táplálékkal táplált egerekből származó aorta keresztmetszetekben detektált klamidiális antigén reprezentatív képei (a-c) vagy magas koleszterinszintű étrenddel táplált egerek (d-f). A keresztmetszeteket anti-klamidiális LPS monoklonális antitesttel festettük, és a festést immunhisztokémiai módszerekkel tártuk fel, amint azt a módszerekben leírjuk. Az a és d képek egerekből származnak, klamidiális fertőzés nélkül; b és e MoPn-vel fertőzött egerekből származnak; és c andf AR39-vel fertőzött egerekből származnak. Az a – f képeket 20 × objektíves objektívvel készítettük. A g – i képeket a 63 × objektív lencséje alatt a d – f képek beillesztett területeiről szereztük be. A nyilvánvaló zárványtestszerű struktúrák egyértelműen megfigyelhetők a h és i képeken.

A szérum antitestek titrálása a klamidium MoPn ellen (a) és AR39 (b) az egerekben normális vagy koleszterin-tartalmú étrendet tápláló organizmusok klamidiális fertőzéssel vagy anélkül, az ábra alján feltüntetett és az ábrán leírtak szerint.

Vita

Összefoglalva, a tanulmány eredményei nemcsak azt bizonyították, hogy a C. pneumoniae fertőzés közvetlenül stimulálhatja az atherogenezist, de ami még fontosabb, új információkat szolgáltattak az érbetegségekben előforduló klamidiális érintettség mechanizmusairól. A klamidiális atherogén hatások az emelkedett szérum koleszterin jelenlététől függtek. Eredményeink azt is sugallják, hogy az érelváltozásokban kimutatott összes fertőző ágens nem járult hozzá az elváltozás előrehaladásához, és hogy a C. pneumoniae egyedülálló biológiai tulajdonsággal bír az aterogenezisében. A tanulmány egyik lehetséges gyengesége, amely korlátozhatja következtetéseinket, a viszonylag hosszú kísérleti periódus során alkalmazott kis minta nagysága. Az ilyen kísérletekben az eredmények változékonysága lehetséges. A megállapításokat előzetes jellegűnek kell tekinteni, de kellő érdeklődéssel bírnak a témával kapcsolatos további tanulmányok ösztönzésére ennek és más modelleknek a felhasználásával.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Wayne Fosternek a digitalizált képek megszerzésében nyújtott segítséget, Dongji Zhangnak pedig az egér intranazális beoltásának segítségét a vizsgálat kezdeti szakaszában. Ezt a munkát a Manitobai Szív és Stroke Alapítvány és a kanadai Orvosi Kutatási Tanács támogatta. G. Zhong a kanadai Orvosi Kutatási Tanács kutatója.