Az étrendi koleszterin hatásának mechanizmusa a lipidek anyagcseréjére patkányokban

Absztrakt

Háttér

Beszámoltak arról, hogy a koleszterin beadása patkányokban befolyásolja a máj lipid metabolizmusát. Jelen tanulmányban az étrendi koleszterin máj aktivitásra és a lipid anyagcserében részt vevő enzimek mRNS expressziójára gyakorolt hatását vizsgálták. Tizennégy hím Wistar patkányt véletlenszerűen 2 csoportra osztottak, és 4% 1% koleszterin- vagy koleszterinmentes AIN76 diétával táplálták őket.

Eredmények

A szérum triglicerid és a nagy sűrűségű lipoprotein koleszterinszint szignifikánsan csökkent, de az összkoleszterin és a nem nagy sűrűségű lipoprotein koleszterinszint szignifikánsan megemelkedett a koleszterinnel táplált patkányokban a kontroll patkányokhoz képest. A májban a teljes koleszterin és a triglicerid koncentrációja pedig étrendi koleszterinenként külön-külön körülbelül négyszeresére és 20-szorosára nőtt. A máj almas enzimje, a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz, a zsírsav-szintáz, a foszfatidát-fophatáz és a karnitin-palmitoil-transzferáz aktivitását a koleszterin-táplálás csökkentette (40%, 70%, 50%, 15% és 25%). Az mRNS expressziójának eredményei azt mutatták, hogy a zsírsav szintáz, a karnitin-palmitoil-transzferáz 1, a karnitin-palmitoil-transzferáz 2 és a HMG-CoA reduktáz (35%, 30%, 50% és 25%), illetve az acil-CoA: koleszterin az aciltranszferáz és a koleszterin 7α-hidroxiláz szintje a májban (1,6 és 6,5-szeres) a koleszterin adagolásával.

Következtetések

Az étrendi koleszterin fokozta a triglicerid felhalmozódását a májban, de nem serkentette a triglicerid és a zsírsav bioszintézissel kapcsolatos májenzimek aktivitását és gén expresszióját.

Háttér

A magas étrendi koleszterin a szérum és a máj összkoleszterin (TC) növekvő koncentrációival, különösen a nagyon alacsony sűrűségű lipoprotein (VLDL) és az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) szintjével foglalkozott a szérumban, amelyet elsődleges kockázati tényezőnek tekintenek szív- és érrendszeri betegségek. A hiperkoleszterinémia patkány modellt képviselik a szív- és érrendszeri és az agyi érrendszeri betegségek kutatásában, amely 0,5% -1,0% koleszterin-kiegészítő étrenddel több héten keresztül történő etetésével állapítható meg. Az étrendi 0,5% -1,0% koleszterin drámai módon növelheti a szérum VLDL és LDL szintjét patkányokban. Ebben az esetben az étkezési koleszterin jelentősen megzavarta a triglicerid (TG) anyagcserét, a máj TG-tartalma redőkben nőtt, amíg a máj steatosis kialakult. Ennek eredményeként néhány korábbi tanulmányban diétával indukált alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) modellként fejlesztették ki. A patkány hiperkoleszterinémiájának és a NAFLD magas étrendi koleszterinszintjének mechanizmusát azonban nem vizsgálták szisztematikusan.

Anyagok és metódusok

Állatok és diéták

Tizennégy 5 hetes Wistar patkányt vásároltak a Qingdao állatközpontból (Qingdao, Kína). A patkányokat fémketrecekben helyezték el egy szabályozott hőmérsékletű helyiségben, 12 órás világos/sötét ciklus alatt. 1 hetes alkalmazkodási periódus után a por-chow étrenden a patkányokat véletlenszerűen 2 csoportba soroltuk (n = 7) az éhgyomri testtömegnek megfelelően, és páros etetéssel láttuk el (a patkányoknak minden nap ellátva az egyeztetett, szabadon etetett táplálék mennyiségét állatok) 1% koleszterin- vagy koleszterinmentes AIN76 étrenddel (1. táblázat). 4 hetes etetés után megmértük a végső éhgyomri testsúlyt, és az összes patkányt aorta exsanguinnal dietil-éteres érzéstelenítésben leöltük. A máj- és fehér zsírszöveteket (W.A.T.s, perirenalis, epididymális, omentális és szubkután zsírokat) azonnal kivágtuk, és elemzés céljából a szérumot elválasztottuk a vértől. A kísérlet minden aspektusát a Kínai Óceán Egyetem (OUC, Kína) kísérleti állatgondozásának etikai bizottságának útmutatásai szerint hajtották végre.

Szérum és máj lipidek

A szérumot elválasztottuk a vért 7500 * g-vel 15 percig végzett centrifugálással. Triglicerid (TG, Cat.F001), összkoleszterin (TC, Cat.F002), nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterin (HDL-c, Cat.F003), nem észterezett zsírsav (NEFA, Cat.A042) és glükóz ( Cat.F006) Biosino (Peking, Kína) enzimatikus reagenskészleteivel mértük. A foszfolipidet (PL, Cat. 467-32101) a Wako Pure Chemicals (Tokió, Japán) vizsgálati készletével mértük. A máj lipidjeit Folch módszerével extraháltuk és tisztítottuk et al. [6]. A TG, TC és PL koncentrációit Fletcher [7], Sperry [8] és Bartlett [9] módszerével mértük.

Az enzimaktivitás vizsgálata

Egy májdarabot 0,25 mol/l szacharóz-oldatban homogenizáltunk, amely 1 mol/l etilén-diamin-tetraecetsav-diamin-tetra-ecetsavat (EDTA) tartalmazott 10 mol/l Tris-HCl pufferben (pH 7,4). A magfrakció kicsapása után a felülúszót 10 000 * g-vel 10 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, hogy mitokondriumokat kapjunk. A kapott felülúszót 60 000 percig 125 000 * g-vel újrabentrifugáltuk a mikroszómák kicsapása céljából, a fennmaradó felülúszót pedig citoszol-frakcióként használtuk. A fehérje koncentrációt Lowry módszerével határoztuk meg et al., szarvasmarha szérum albuminnal standardként. Az ME, G6PDH és FAS [10–12] enzimaktivitását a máj citoszol frakciójában, a mitokondriális CPT-ben [11] és a mikroszómális PAP-ban [13] a leírtak szerint határoztuk meg.

Az mRNS szintjének meghatározása a májból

A teljes sejtes RNS-t májmintákból izoláltuk Trizol reagens (Invitrogen, Caelsbad, CA) alkalmazásával, a gyártó ajánlott eljárásainak megfelelően. Igény szerinti tesztek, gén expressziós termékek [Mm00662319_m1 a FAS-hoz, Mm00486279_m1 az ACAT-hoz és Hs99999901_s1 a 18SRNA-hoz, Applied Biosystems, Tokió, Japán) és TaqMan MGB gén expressziós készletek HMG-CoA reduktázhoz (forward primer, 5TGATGATGAT A kvantitatív, valós idejű reverz transzkripciójú polimeráz láncreakcióhoz (RT- PCR) elemzése a máj FAS, ACAT, 18SRNA és HMG-CoA reduktáz expressziójának. Az amplifikációt valós idejű PCR rendszerrel (ABI Prism 7000 Sequence Detection System; Applied Biosystems) végeztük. Az eredményeket relatív értékként fejeztük ki, miután normalizáltuk a 18S RNS-t [14].

Statisztikai analízis

Minden értéket átlagként ± S.E.M. A két csoport eszközeit összehasonlítottuk Hallgatói teszt minden kísérlethez. A különbségeket jelentősnek tekintették a P

Eredmények

A koleszterin hatása a növekedési paraméterekre

A 2. táblázat összefoglalta a Wistar patkányok növekedési paramétereit 4 hetes etetés után a különböző étrendekkel. Bár a két csoport között nem volt szignifikáns különbség a testtömeg-gyarapodásban, az élelmiszer-bevitelben vagy a teljes fehér zsírszövetben, a koleszterin-diéta drasztikusan megnövelte a máj súlyát (P 2. táblázat A koleszterin hatása a növekedési paraméterekre Wistar patkányokban 1

A koleszterin hatása a szérum lipid- és glükózkoncentrációra

Mint a 3. táblázat mutatja, a szérum TC és a nem HDL-c koncentrációja szignifikánsan magasabb volt (P 3. táblázat A koleszterin hatása a szérum lipidek és glükóz koncentrációira Wistar patkányokban 1

A koleszterin hatása a máj lipid koncentrációjára

A 4. táblázat a Wistar patkányok máj lipidszintjét mutatja az étrend 4 hetes etetése után. A koleszterin etetés zavarta a máj lipidanyagcseréjét patkányokban. A máj TC és TG koncentrációja figyelemre méltóan, 19,2-szeresére nőtt (P 4. táblázat: A koleszterin hatása a máj lipid koncentrációira Wistar patkányokban 1

A koleszterin hatása a máj lipid metabolizmusában szerepet játszó enzimaktivitásra

Az 5. táblázat kimutatta, hogy a koleszterin beadása 50% -kal szignifikánsan gátolta a lipogenezissel kapcsolatos enzimek, például a FAS, az ME és a G6PDH aktivitását, valamint a TAP szintézisében sebességet korlátozó enzim PAP aktivitását (P 5. táblázat A koleszterin hatása a máj lipidanyagcseréjében szerepet játszó enzimaktivitásokra 1

A koleszterin hatása a máj zsírsav metabolizmus enzimjeinek mRNS expressziójára

Az 1. ábra a Wistar patkányok májának mRNS-szintjét mutatja az étrend 4 hetes etetése után. A lipogenezis kapacitással korreláló enzimek aktivitásával összhangban a FAS, G6PDH és ME mRNS expressziója csökkent (35%, 59% és 44%) (P 1.ábra

A koleszterin hatása a máj koleszterin metabolizmus enzimjeinek mRNS expressziójára

A 2. ábra a wistar patkányok májának mRNS-tartalmát mutatja az étrend 4 hetes etetése után. A HMG-CoA reduktáz a koleszterin bioszintézis útjának sebességszabályozó enzime. A HMG-CoA reduktáz mRNS szintje 25% -kal csökkent, azonban statisztikai szignifikancia nélkül a koleszterinnel táplált patkányokban, összehasonlítva a kontroll diéta patkányokkal. Az ACAT, a koleszterin-észterezés sebességét szabályozó enzim és a CYP7A1, a koleszterin-hidroxiláció sebesség-korlátozó enzime, összefüggenek a máj koleszterin katabolizmusával. A két enzim mRNS szintje szignifikánsan megemelkedett a koleszterin csoportban a kontrollokhoz képest. Az itt bemutatott eredmény a koleszterin hidroxilezésének és észterezésének fokozását, valamint a máj koleszterin szintézisének elnyomását mutatta. Ennek a ténynek az értelmezése dokumentálta, hogy a felesleges koleszterin kiürült a májból.

Vita

Másrészt a máj zsírsav-béta-oxidációja egy másik tényező, amely befolyásolja a máj zsírsavszintjét. A CPT1 a mitokondrium α-oxidációs útjának sebességkorlátozó enzime. Jelen tanulmányban a máj CPT1 aktivitását (5. táblázat), valamint a CPT1a és CPT2 mRNS szintjét (1B. Ábra) drasztikusan gátolta a koleszterin kezelés. Ezek az eredmények bebizonyították, hogy a koleszterin beadása csökkentette a zsírsav katabolizmust, ami hozzájárulhat a máj TG szintjének növekedéséhez. Sőt, a Fukada N et al.[18] kimutatták, hogy a zsírsav-béta-oxidáció szuppressziója felelős lehet a zsírsav TG-vé és CE-vé történő átalakulásáért. Ez valószínűleg egy másik ok volt a máj TG-szintjének emelkedésének szemléltetésére.

Itt azt tapasztaltuk, hogy a szérum TG-szint szignifikánsan alacsonyabb volt a koleszterinnel táplált patkányokban, mint a kontrollok. Míg más jelentések azt mutatták, hogy a magas koleszterintartalmú étrend által kiváltott hiperkoleszterinémia patkányok magasabb szérum TG-szinttel rendelkeznek. Tamás et al.[1, 2] megfigyelte, hogy a koleszterin etetés növelte a szérum TG szintjét alacsony zsírtartalmú étrenddel etetett patkányokban (5%), de nem volt hatással a magas zsírtartalmú táplálékkal etetett patkányok szérum TG koncentrációjára (20%). Pang et al.[19] beszámolt arról, hogy a koleszterinkezelés csökkentette a szérum TG szintjét magas koleszterintartalmú étrendben táplált patkányokban. Van. et al.[20] kimutatta, hogy az étkezési zsír fajtája fontos az étrendi koleszterin által befolyásolt szérum TG-szint szempontjából. Ezért voltak arra utaló jelek, hogy a koleszterin hatása a szérum TG szintjére eltérő lehet az állati anyagcsere különféle állapotától és az étrend összetételétől függően.

Emellett, mint tudjuk, a foszfolipidek képezik a lipoprotein felületének fő tartalmát, valamint a benne lévő TG és CE-t. Ez a tanulmány kimutatta, hogy a koleszterin táplálása hatszorosára növelte a szérum LDL-c értékét, és 50% -kal csökkentette a szérum TG szintjét, de nem volt hatással a PL-re (3. táblázat). Ez a tény szemlélteti, hogy a szérum lipoprotein főleg a koleszterinnel táplált patkányokban a CE-ben gazdag LDL-ből állt. Ezért feltételeztük, hogy a CE előnyösen az LDL részecske belsejébe repült, összehasonlítva a TG részecskével, az LDL szintézis és szekréció közepette koleszterinnel táplált patkányokban.

Következtetések

Megállapításunk azt sugallta, hogy az étrendi koleszterin által okozott máj TG-felhalmozódás a zsírsav-béta-oxidáció csökkenésének és a CE előnyben részesítésének az LDL-hez való affluxnak tulajdonítható, nem pedig az aktivitás fokozása miatt. a zsírsavval és a TG szintézissel kapcsolatos enzimek közül. De a részletes mechanizmus még további vizsgálatokat igényel.

Hivatkozások

Fungwe TV, Fox JE, Cagen LM, Wilcox HG, Heimberg M: A zsírsavak bioszintézisének étrendi koleszterin általi stimulálása és a koleszterin szintézisének étrendi zsírsavval történő stimulálása. J Lipid Res. 1994, 35: 311-318.

Fungwe TV, Cagen LM, Cook GA, Wilcox HG, Heimberg M: Az étrendi koleszterin stimulálja a triglicerid máj bioszintézisét és csökkenti a patkányokban a zsírsavak oxidációját. J Lipid Res. 1993, 4: 933-941.

Liu CH, Huang M, Huang PC: A triacil-glicerin felhalmozódásának forrásai koleszterin-kiegészített étrendet tápláló patkányok májában. Lipidek. 1995, 30 (6): 527-531. 10.1007/BF02537027

Xu G, Pan LX, Li H, Shang Q, Honda A, Shefer S, Bollineni J, Matsuzaki Y, Tint GS, Salen G: Az étrendi koleszterin serkenti patkányokban az 15921680373CYP7A1-et, mert a farnesoid × receptor nem aktiválódik. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004, 286: 730-735. 10.1152/ajpgi.00397.2003.

Yokogoshi H, Mochizuki H, Nanami K, Hida Y, Miyachi F, Oda H. J Nutr. 1999, 129: 1705-1712.

Folch JML, Slane-Stanley GH: Egyszerű módszer a teljes lipidek izolálására és tisztítására állati szövetekből. J Biol Chem. 1957, 226: 497-506.

Fletcher MJ: Kolorimetriás módszerek a szérum triglicerid becslésére. Clin Chem Acta. 1968, 22: 393-397. 10.1016/0009-8981 (68) 90041-7.

Sperry WM, Webb M: A Shoenheimer-Sperry módszer felülvizsgálata a koleszterin meghatározásához. J Biol Chem. 1950, 187: 97-106.

Bartlett GR: Kolorimetriás vizsgálati módszerek szabad és foszforilezett glicerinsavakhoz. J Biol Chem. 1958, 234: 466-469.

Kelley DS, Kletzien RF: A glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz aktivitás hormonális és táplálkozási szabályozásának etanol-modulációja patkány hepatociták elsődleges tenyészeteiben. Biochem J., 217, 543-549 (1984).

Markwell MAK, McGroarty EJ, Bieber LL, Tolbert NE: A karnitin-aciltranszferázok szubcelluláris eloszlása emlős májban és vesében. J Biol Chem. 243, 3433-3440 (1973).

Walton PA, Possmayer F: Patkánytüdő Mg-függő foszfatidát-foszfohidroláza: olyan vizsgálat kifejlesztése, amely meghatározott kémiai szubsztrátot alkalmaz, amely tükrözi a membránhoz kötött és szubsztrát segítségével elvarázsolt foszfohidroláz-aktivitást. Anal Biochem. 151, 479-486 (1985). 10.1016/0003-2697 (85) 90208-8

Ochoa S, Mehler AH, Kornberg A: Dikarbonsavak bioszintézise szén-dioxid-rögzítéssel. I. Az I-almasav reverzibilis oxidatív dekarboxilezését katalizáló enzim izolálása és tulajdonságai galambmájból. J Biol Chem. 1948, 174: 977-1000.

Wang YM, Nagao K, Inoue N, Ujino Y, Shimada Y, Nagao T, Iwata T, Kamegai T, Yamauchi-Sato Y, Yanagita T: A konjugált linolsav izomer-specifikus elhízás- és hipolipidémiás tulajdonságai elhízott OLETF patkányokban. Biosci Biotechnol Biochem. 2006, 70: 355-362. 10.1271/bbb.70.355

Davis RA, McNeal MM, Moses RL: Nagyon kis sűrűségű lipoproteinek intrahepatikus összeállítása. A koleszterin-észterek versengése a hidrofób magért. J Biol Chem. 252, 2634-2640 (1982).

Zhao JC, Xiao LJ, Zhu H, Shu Y, Cheng NS: A lipid anyagcsere változásai a plazma májban és az epében koleszterin epekő képződés során nyúl modellben. Világ J Gasztroenterol. 1998, 4 (4): 337-339.

Zhao HL, Cho KH, Ha YW, Jeong TS, Lee WS, Kim YS: A platikodin D koleszterinszint-csökkentő hatása hiperkoleszterinémiás ICR egerekben. Eur J Pharmacol. 2006, 537 (1-3): 166-73. 10.1016/j.ejphar.2006.03.032

Fukada N, Ontko JA: A zsírsavszintézis oxidációja és az észterezés közötti kölcsönhatások a trigliceridekben gazdag lipoproteinek májban történő előállításakor. J Lipid Res. 1984, 25: 831-842.

Pang L, Wang JF, Dong P, Wang Y, Xue CH: Két holothuria faj megelőző hatásainak összehasonlítása kísérleti hiperlipidémia patkányokon. Acta Nutr Sin. 2006, 5: 446-447.

Van Heek M, Zilversmit DB: A hipertrigliceridémia mechanizmusai kókuszolajban/koleszterinnel táplált nyúlban. A nagyon alacsony sűrűségű lipoproteinek fokozott szekréciója és csökkent katabolizmusa. Arteriosclm Thmmb. 1991, 11: 918-927.

Martin KO, Budai K, Javitt NB: Koleszterin és 27-hidroxi-koleszterin 7a-hidroxiláció: két különböző enzim bizonyítékai. J Lipid Res. 1993, 34: 581-588.

Köszönetnyilvánítás

Jelen tanulmányt a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (30972285) támogatja.

Szerzői információk

Hovatartozások

Élelmiszertudományi és Mérnöki Főiskola, Kínai Óceán Egyetem, Qingdao, Kína

Yu-Ming Wang, Bei Zhang, Yong Xue, Zhao-Jie Li, Jing-Feng Wang és Chang-Hu Xue

Alkalmazott Biológiai Tudományok Tanszék, Saga Egyetem, Saga, Japán

A PubMed Google Scholar alkalmazásban is kereshet erre a szerzőre

Levelezési cím

További információ

Versenyző érdekek

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő érdekeik.

A szerzők hozzájárulása

Az YMW hozzájárult a tervezéshez, a kísérleti munkához, az elemzéshez és az eredmények közzétételéhez. A kézirat elkészítéséért BZ volt a felelős. YX részt vett a vizsgálat, az állatkísérletek tervezésében és statisztikai elemzéseket végzett. A ZJL feladata volt az eredmények megtervezése és megbeszélése. A JFW részt vett a tanulmány tervezésében és a statisztikai elemzésben. A CHX részt vett a kézirat elkészítésében, az eredmények megbeszélésében és a tanulmány finanszírozásában. A TY részt vett a tervezésben, és támogatást biztosított a tanulmányhoz. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta ezt a kéziratot.

Yu-Ming Wang, Bei Zhang egyformán járult hozzá ehhez a munkához.

A szerzők eredeti fájljai fájlokhoz

Az alábbiakban mutatjuk be a linkeket a szerzők eredeti képfájljaihoz.