A Cordyceps sinensis biomassza, amelyet magas zsírtartalmú étrendes takarmánypatkányok merített fermentációval állítanak elő, normalizálja a vér lipidjét és az étrend által kiváltott alacsony tesztoszteronszintet

Leandro Freire dos Santos

1 Szövetségi Paranai Egyetem, Bioprocesszorok és Biotechnológia Tanszék - Usina piloto B, Curitiba - PR - Brazília

Roselia Rubel

2 UFPR Klinikai Kórház, Brazília

Sandro José Ribeiro Bonatto

3 Pelé Pequeno Príncipe Intézet, Brazília

Ana Lucia Zanatta

4 Paraná szövetségi egyetem, élettani tanszék, Brazília

Júlia Aikawa

4 Paraná szövetségi egyetem, élettani tanszék, Brazília

Adriana Aya Yamaguchi

4 Paraná szövetségi egyetem, élettani tanszék, Brazília

Maria Fernanda Torres

5 Anatómiai tanszék, Paraná szövetségi egyetem, Brazília

Vanete Thomaz Soccol

1 Szövetségi Paranai Egyetem, Bioprocesszorok és Biotechnológia Tanszék - Usina piloto B, Curitiba - PR - Brazília

6 ipari biotechnológia posztgraduális program, Positivo Egyetem, Brazília

Sascha Habu

7 Paraná Szövetségi Technológiai Egyetem - Katonai Műszaki Intézet, Brazília

Karin Braun Prado

8 Kórtan Tanszék, Paraná szövetségi egyetem, Brazília

Carlos Ricardo Soccol

1 Szövetségi Paranai Egyetem, Bioprocesszorok és Biotechnológia Tanszék - Usina piloto B, Curitiba - PR - Brazília

Absztrakt

Ez a tanulmány a Cordyceps sinensis biomassza-kiegészítésének hatását vizsgálta az alámerített erjesztés során a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott lipidekre és alacsony tesztoszteronszintre. A kísérleteket HFD és HFD, valamint Simvastatin vagy C. sinensis (4 hónap) hosszú távú bevitelével végeztük. Eredményeink azt mutatják, hogy a plazma koleszterinszintjét, trigliceridjeit és az LDL-t csökkentette a Cordyceps sinensis biomassza-kiegészítés (CSBS). A HFD hosszú távú bevitele jelentős májkárosodást okozott, amelyet a CSBS visszaállított. A CSBS normalizálta a csökkenő tesztoszteronszintet a magas zsírtartalmú étrendben. Mindezek a megállapítások arra engednek következtetni, hogy a C. sinensis képes volt csökkenteni a vér lipidkoncentrációját, fokozni a hepatoprotektív aktivitást és normalizálni a tesztoszteron szintet.

Bevezetés

A C. sinensis micélium biológiai tulajdonságait, beleértve a gyulladáscsökkentő és daganatellenes aktivitásokat, korábban vizsgálták (Liu et al., 2011 [18]; Yan et al., 2011 [33]).

Érdekes módon a szilárd halmazállapotú erjesztés során kapott micéliumhatásaik mellett a süllyesztett erjesztés során nyert C. sinensis biomassza (Chimilovski et al., 2011 [7]) hatékony hatóanyag lehet a lipidanyagcserében. Ezt a hipotézist alátámasztották a C. sinensisből izolált glükánról szóló néhány bizonyíték (Wu és mtsai., 2005 [32], 2007 [31]). Figyelemre méltó, hogy a glükánok hipokoleszterinémiás hatásait számos tanulmány kimutatta (Tiwari és Cummins, 2011 [26]; Lei és mtsai, 2012 [16]). Hasonlóképpen, a merített fermentáció hagyományos megközelítés a kiváló minőségű biomassza előállításához, és ennek a technikának olyan különleges előnyei vannak, mint például a folyamatszabályozás fölénye és a biomassza könnyű visszanyerése (Sun és Xu, 2009 [24]).

A glükánoknak a lipid anyagcserére gyakorolt hatása iránti jelenlegi érdeklődés középpontjában az a lehetőség áll, hogy a glükánok befoghatják az epesavakat a belekben, és ezáltal növelhetik az epesav kizáródását a székletben (Bowles et al., 1996 [3]). Másodszor, a koleszterinfelvételt a bélfal glükánja gátolhatja (Drozdowski et al., 2010 [10]). Harmadszor, a glükánok fermentációs folyamaton mennek keresztül rövid láncú zsírsavak előállítására, amelyek gátolhatják a koleszterinszintézist (Drozdowski et al., 2010 [10]; Turunen és mtsai, 2011 [27]).

Az érelmeszesedés, a makrofágok komplex kölcsönhatása az artériás fal szérum koleszterinnel, világszerte a kardiovaszkuláris betegségek legfőbb oka, és ez komoly társadalmi problémává vált. Az ateroszklerózishoz vezető különböző tényezők közül a magas kis sűrűségű lipoprotein-koleszterint, a triglicerideket és az összkoleszterint tekintik a patogenezis fő kockázati tényezőinek (Østerud és Bjørklid, 2003 [20]; Ding és mtsai, 2012 [8]; Zha és mtsai, 2012 [35]).

Mivel a megnövekedett koleszterinszint és más lipidparaméterek befolyásolhatják az érelmeszesedés kialakulását és a koleszterin felhalmozódását a szívkoszorúerekben (Zha és mtsai., 2012 [35]), feltételeztük, hogy a hipolipidémiás aktivitást a merített vízből nyert C. sinensis biomasszában kell vizsgálni. erjesztés.

Bemutatták a krónikus májbetegség tesztoszteron szintjén játszott szerepével kapcsolatos jelenlegi ismereteket. Tanulmányok kimutatták, hogy az alacsony tesztoszteronszint gyakori a súlyos májbetegségben szenvedő férfiaknál (Grossmann et al., 2012 [12]). Az alacsony tesztoszteronszint patogenezise krónikus májbetegségben szenvedő férfiaknál magában foglalja a hipotalamo-agyalapi mirigy-gonád tengely többszintű szabályozását (Grossmann et al., 2012 [12]). Ezáltal a krónikus májbetegség súlyossága nyilvánvalóan komoly problémává válhat a pubertás korú fiúk számára.

Itt megvizsgáltuk, hogy a zsírtartalmú étrend hosszú távú bevitele csökkentheti-e a tesztoszteronszintet a májkárosodás (a májzsír-lerakódás okozta) és az alámerjesztett fermentáció által előidézett CSBS-ek jótékony hatása révén a magas zsíros étrend patkányokat etet.

Kísérleti

Fogyókúra elkészítése

A felhasznált alapállati étrendet (Labina, Purina ®, São Paulo, Brazília) a következő összetevők (g/100 g) kiegészítésével módosítottuk: zsírzsír, 14 és hidrogénezett növényi zsír, 6. Ennek elkészítéséhez kevert porított standardot diéta és olvasztott lipidek (zsír és zsírsav növényi zsír). A táplálékfelvétel napi átlagát úgy határoztuk meg, hogy az egyes csoportok összes patkányának minden nap elfogyasztott ételt hozzáadtuk, és elosztottuk a csoportonkénti patkányok számával.

Dizájnt tanulni

Az állatokkal kapcsolatos összes eljárást a Positivo Egyetem Állatvédelmi Bizottsága hagyta jóvá. Negyven hím Wistar patkányt, 30 napig és 110 g-ot (± 10 g), négy csoportba osztottunk (csoportonként tízet). Az állatokat az állatkertben 24 ± 2 ° C hőmérsékleten, 12/12 órás fény/sötét ciklus mellett 4 hónapig tartottuk, és a megfelelő étrenddel és vízzel ad libitum tápláltuk. A kontrollcsoportot módosulás nélküli bazális étrenddel, HDF és HFD + szimvasztatint (Medley, Campinas-SP, Brazília), illetve a C. sinensis csoportokat módosított bazális étrenddel és módosított bazális étrendet + Simvastatin vagy C. sinensis tápláltuk. Szükség esetén Simvastatin és C. sinensis biomasszát adtak hozzá módosított alapdiétával együtt. A gyógyszer és a biomassza dózisa 10,36 mg/kg volt, és 10% (w/w) (gyógyszer vagy biomassza/takarmány) összesen 14 hétig.

Biokémiai meghatározások

A kísérletek végén az állatokat éteri inhalációval altattuk, és vérmintákat vettünk szívszúrás útján a plazma koleszterin, trigliceridek, LDL, AST aktivitás, karbamid és tesztoszteron mérésére.

A plazma lipid, karbamid és kreatinin méréseket ADVIA 1650 automatizált rendszerben (Bayer AG, Leverkusen, Németország) végeztük. A tesztoszteron méréseket közvetlen immunvizsgálattal végeztük a Roche E170-en.

Máj-lipid-hidroperoxidok

A lipid-hidroperoxidok adagolását a májszövet metanolos kivonatán végeztük, Nourooz-Zadeh és mtsai. 1994 [19]. A máj jobb lebenyének 300 mg-os részét 1 ml metanolban homogenizáltuk, elektromos homogenizátor (GGS 27, Bosch) alkalmazásával. Centrifugálás után (5000 g, 5 perc, 4 ° C) a felülúszó 50 µl-es alikvot részét (sejtmentes kivonat) tároltuk az összes fehérje további mérésére, és 90 µL-es alikvotokat hat centrifuga fiolába helyeztünk (1, 5 ml). Ebből az injekciós üvegből háromba 10 ul metanolos, 10 mM trifenil-foszfint adunk, ezáltal három vakot kapunk. A másik három fiolához 10 ul metanolt adunk. Mind a hat fiolát vortexeltük, majd 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezt követően 900 ul FOX 2-t (100 mM xilenol-narancs, 4 mM BHT, 25 mM kénsav és 250 mM ammónium-vas-szulfát, 90% metanol, 10% ultratiszta víz) adtunk az összes fiolához. Keverés után a mintákat további 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Az abszorbanciát 560 nm-en mértük spektrofotométerrel (Ultrospoc 2000, Pharmacia Biotech). Az eredményeket korrigáltuk az extraktum fehérje koncentrációjával.

A máj összes fehérje

Ehhez a méréshez a Bradford által leírt módszert alkalmaztuk (Bradford, 1976 [4]). Röviden: 250 µl Bradford-reagenst adtunk 10 µl sejtmentes kivonathoz mikrotányéron. Szobahőmérsékleten 5 perc elteltével az abszorbanciát 595 nm-en mértük mikrotányér-spektrofotométerrel (Benchmark, Bio-Rad). A fehérjekoncentrációt interpoláló abszorbancia értékekkel határoztuk meg, a szarvasmarha-szérum albumin ismert koncentrációi által létrehozott standard görbén.

Szövettan és festés

Különböző kísérleti csoportokból származó állatok májának biopsziáját végeztük: (A) Kontroll, (B) HFD és (C) HFD plusz C. sinensis. A biopsziás mintákat formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk, és fagyasztás után kriptátba vágtuk 3-6 µm-es sorozatokkal. Ezután szudáni feketével festették őket.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM értékként adjuk meg. A statisztikai elemzést egyirányú ANOVA-val, majd Tukey-próbával végeztük. A p értéke (1. ábra) a HFD-vel és HFD-vel etetett patkányok lipidparamétereit (plazma koleszterin, trigliceridek és LDL) mutatja, kiegészítve szimvasztatinnal és biomasszával (C. sinensis). Az étrend-kiegészítő kísérletben a lipidparaméterek szintjét enzimatikus-kolorimetrikus módszerrel számoltuk. A magas zsírtartalmú étrendi takarmánypatkányoknál a plazma koleszterin- és LDL-szintje emelkedett; azonban a triglicerid szint nem mutatott változást a kontroll állatokhoz képest. A magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányoknak étrend-kiegészítőként adott Simvastatim és C. sinensis jól tolerálható volt, és pozitív választ (jelentős csökkenést) okozott, mint például a plazma koleszterin-, triglicerid- és LDL-szintje. Érdekes módon a szimvasztatin (szintetikus hipolipidémiás) és a C. sinensis hasonló tendenciákat mutatott.

Diétás körülményeink májkárosodást mutattak ki a lipidcseppek felhalmozódása miatt, ami tükrözheti a máj steatosisát (2. ábra (2. ábra)) (Amacher, 2011 [1]). Minden más elemzés olyan májkárosodást is mutatott, mint az aszpartát-aminotranszferáz aktivitás, a plazma karbamid és a lipid peroxidáció (HFD csoport) (3. ábra (3. ábra)). A kezelt csoportok közül a plazma karbamid szintje nem javult. Annak ellenére, hogy a szimvasztatin és a C. sinensis biológiailag inaktívnak tekinthető a májkárosodás ellen, amikor a plazma karbamidszintet figyeltük meg (3B. Ábra (3. ábra)), lehetséges, hogy a kezelési időszak nem volt képes helyreállítani a karbamidciklus enzimjeit. Az aszpartát-aminotranszferáz aktivitás, a máj hisztopatológiai elemzései és a lipidperoxidáció azonban azt mutatták, hogy a kezelt csoportok, különösen a HFD és C. sinensis, hepatoprotektív aktivitást mutattak (2. ábra (2. ábra) és 3A, C ábra (3. ábra)). Az oxidatív károsodás értékelését az oxidatív stressznek kitett szövet lipidperoxidációja révén javasolták a szövetkárosodás felmérésére (Wang et al., 2012 [29]). Beszámoltak a HFD és a javult oxidatív stressz közötti összefüggésről (Chaudhari et al., 2012 [6]).

Következtetések

Eredményeink azt sugallják, hogy a C. sinensis biomassza-kiegészítés magas zsírtartalmú étrendben 4 hónapig táplálja a patkányokat, normalizálja a vér lipidszintjét és a HFD által kiváltott alacsony tesztoszteronszintet. Valószínűleg a C. sinensis biomassza-kiegészítés nem helyettesítheti a jelenleg rendelkezésre álló gyógyszerezredek használatát a lipidek csökkentésére, de kiegészítheti azokat. Lehetővé tehetik alacsonyabb dózisú terápiás gyógyszerek alkalmazását is, ezáltal csökkentve a dózishoz kapcsolódó mellékhatások kockázatát. Megfigyeléseink hozzájárulnak a krónikus májbetegség alacsonyabb tesztoszteronszintnél betöltött szerepével kapcsolatos jelenlegi ismeretek érvényességéhez is. További vizsgálatokat kell végezni az IGF szintek, valamint az egyéb pubertás paraméterek értékelése érdekében, hogy értékeljük a pubertás érés jeleinek késői megjelenését.

Megjegyzések

Leandro Freire dos Santos és Carlos Ricardo Soccol (Paranai Szövetségi Egyetem, Bioprocesszorok és Biotechnológia Tanszék - Usina piloto B, Curitiba - PR - Brazília; [email protected]) egyenlő mértékben járultak hozzá, mint a megfelelő szerzők.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők hálásan köszönik a Nemzeti Kutatási Tanácsnak (CNPq) és a személyzeti fejlesztések koordinálásának - felsőbb szintű (CAPES), Brazília pénzügyi támogatásáért és a Clínicasi Kórházért (Paraná Szövetségi Egyetem - Brazília), akik szíves technikai segítséget nyújtottak.

Érdeklődésnyilatkozat

A szerzők nem jelentettek be érdekeltségi nyilatkozatot.