Határok az állatorvos-tudományban

Az állatok táplálkozása és anyagcseréje

Szerkesztette
Véronique A. Lacombe

Oklahoma Állami Egyetem, Egyesült Államok

Felülvizsgálta
Mohamed E. Abd El-Hack

Zagazigi Egyetem, Egyiptom

F. Capela E Silva

Departamento de Biologia, Escola de Ciência e Tecnologia, Universidade de Évora, Portugália

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

étrend

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Táplálkozási, fiziopatológiai és farmakológiai egység (NP3), Oniris, Állatorvostudományi, Élelmiszertudományi és Mérnöki Főiskola, CRNH, Nantes, Franciaország
  • 2 UMR 1280 Nutritional Adaptations Physiopathology (PhAN), INRAE, CRNH, West Human Nutrition Research Center, CHU, Nantes, Franciaország
  • 3 USC 1383 Cellular and Molecular Immunoendocrinology (IECM), INRAE, Oniris, Állatorvostudományi, Élelmiszertudományi és Mérnöki Főiskola, Nantes, Franciaország
  • 4 Kutatóközpont, Royal Canin SAS, Aimargues, Franciaország
  • 5 Gasztrointesztinális laboratórium, Texas A&M Egyetem, College Station, TX, Egyesült Államok

Bevezetés

A normális időbeli eltérések ellenére bebizonyosodott, hogy egy adott környezetben a széklet mikrobiota stabilnak tekinthető kutyáknál (1), mint más fajokban (2, 3). Számos környezeti tényező, például az étrend, átmenetileg vagy tartósan megváltoztathatja a mikrobiotát. Kutyáknál a bél mikrobiotáját mind a magas fehérjetartalmú étrend (4–6), mind a fehérje/szénhidrát arány változása (7, 8) megváltoztathatja. Mint más fajokban, a fermentálható rostok is szerepet játszanak a bél mikrobiotájában (6, 9–11). Végül a HFD (12), valamint a zsír/szénhidrát arány változása megváltoztatja a bél mikrobiotáját (13).

A kutyák elhízása számos anyagcsere- és hormonzavarral jár, például alacsonyabb inzulinérzékenységgel. Korábban kimutattuk, hogy a túltáplált kutyák súlygyarapodása csökkent inzulinérzékenységgel, alacsony fokú gyulladással és megváltozott lipidállapothoz kapcsolódott (14, 15). Ezzel szemben a túlsúlyos kutyák súlycsökkenése az inzulinérzékenység javulását, a gyulladásgátló citokinek csökkenését (16) és a lipidprofil javulását eredményezte (17).

Ebben az adott környezetben a különböző élettani vagy kóros állapotok határozzák meg a bél mikrobiotájának különbségeit. Különösen kimutatták, hogy a sovány egyedek vagy állatok mikrobiotája eltér az elhízottakétól. Emberekben és egerekben a fő különbség a két uralkodó phyla arányának növekedését jelenti ezekben a fajokban, a Firmicutes és a Bacteroidetes (18, 19). A sovány egerekhez képest és rokonságtól függetlenül az ob/ob állatok 50% -kal csökkentik a Bacteroidetes bőségét és a Firmicutes arányosan növekednek (18). Emberekben a Bacteroidetes relatív aránya csökken az elhízott embereknél a sovány emberekhez képest, és ez az arány a fogyás mellett növekszik kétféle alacsony kalóriatartalmú étrend esetén (19). A bél mikrobiotájának különbségeit elhízott kutyáknál is leírták a sovány kutyákhoz képest (12, 20, 21). Az eredmények heterogenitása azonban nem tette lehetővé a kutyák elhízásának bakteriális aláírását, amint ezt embereknél és egereknél tették (18, 19). Érdekes módon arról is beszámoltak, hogy az étrend mikrobiotára gyakorolt ​​hatását befolyásolhatja a kutya testállapot-mutatója (BCS), amelyet adipozitási indexként használnak (5).

Számos tanulmány szerint a bél mikrobiota részt vehet az elhízás kialakulásában. A javasolt mechanizmusok közül a mikrobiota fokozhatja az étrendből származó energiatermelést azáltal, hogy növeli a monoszacharid felvételt a vékonybélben (22) és a rövid láncú zsírsavak (SCFA) termelését a hátsó bélben történő erjesztés révén (23). Mindazonáltal az SCFA szerepe az elhízás szempontjából, valamint az SCFA fokozott székletkoncentrációjának okai ellentmondásosak (24).

A bél mikrobiota az elhízás elősegítésében szerepet játszhat az endotoxémia kiváltásával is, a bél gram-negatív baktériumainak falát alkotó lipopoliszacharidok (LPS) szisztémás keringése miatt. Ez az állítás azon a megfigyelésen alapul, hogy egerekben az LPS krónikus infúziója az egész test, a máj és a zsírszövet tömegének hasonló növekedését váltja ki, és hasonló metabolikus hatásokat, nevezetesen hiperglikémiát és hiperinsulinémiát, mint a HFD-ben (25) . Azt is kimutatták, hogy a HFD a bél LPS-tartalmú baktériumainak növekedését és a bél gátjának megváltoztatását indukálja a hámszűk kereszteződésű fehérjék csökkent expressziójával járó mechanizmus révén (26). A mikrobiota és a bélpermeabilitás változása endotoxémiához vezethet, és hozzájárulhat az elhízás kialakulásához.

Azokban a tanulmányokban, amelyek a HFD következményeit vizsgálták a bél mikrobiotájára, nehéz volt megkülönböztetni a megnövekedett kalóriabevitel és a megnövekedett testtömeg (BW) (és a megnövekedett testzsír) által kiváltott hatásokat, mert a HFD-t általában hiperenergetikusan adták be szint (vagy akár ad libitum). Cani és mtsai hipotézisét is fel akartuk vetni. (26), miszerint a mikrobiota részt vesz az inzulinérzékenység csökkenésében metabolikus endotoxémiával és alacsony fokú gyulladással, amelyet a bélpermeabilitás növekedése kísér. A HFD változásokat indukál a bél mikrobiotájában, amely részt vesz a súlygyarapodásban, valamint megváltoztatja a bél gátját, valamint az anyagcsere és a gyulladás paramétereit. A jelenlegi tanulmány célja az volt, hogy összehasonlítsák a fenntartó energiaigénnyel táplált HFD és ugyanazon étrend hatásait 150% -os fenntartás mellett a mikrobiotára, a bélgátra és a gazdaélettanra (gyulladásos és metabolikus változók).

Anyagok és metódusok

Állatok és szállás

Huszonnégy egészséges nőstény ivartalanított Beagle kutya (életkor: 5,1 ± 0,4 év, átlag ± SEM; testtömeg: 13,2 ± 1,3 kg; BCS: 6/9 (tartomány: 5/9–6/9) vett részt ebben a vizsgálatban. A méret nem formálisan került kiszámításra, ehelyett a 24 kutya felvétele az Oniris létesítményeinek azon képességén alapult, hogy garantálja az állatok jólétét és biztosítsa, hogy a mintavételi munkaterhelést megbízható körülmények között egy személy végezhesse a manipulációs torzítás elkerülése érdekében.

A kutyákat társadalmi összeegyeztethetőségük alapján párban helyezték el, egy kültéri házban, amely védett alvási helyet (2,0 x 5,0 m) tartalmazott. Napi kapcsolatban álltak gondozóikkal, és naponta hozzáférhettek a külső játszóterekhez. A kutyákat évente oltották, és kétévente féregtelenítettek. Klinikai vizsgálat, vérsejtszám és szérum biokémia alapján egészségesnek nyilvánították őket. A kutyák az előző 2 hónapban nem kaptak olyan gyógyszereket, amelyek várhatóan megváltoztatták a bél mikrobiotáját (pl. Antibiotikumok).

A kutyákat az ONIRIS-ben, a francia Nantes-i Állatorvosi Iskolában helyezték el, a francia kutatási minisztérium állatjóléti szabályainak megfelelően. A jegyzőkönyv teljesítette az állatkísérletekre vonatkozó európai uniós irányelveket (a tudományos célokra használt állatok védelméről szóló 2010/63 irányelv), és mind a Royal Canin Etikai Felülvizsgálati Bizottsága (090118-03), mind a „Pays-de-la” etikai bizottsága jóváhagyta. -Loire ”(Apafis # 13800).

Diéták és tanulmánytervezés

A vizsgálat megkezdése előtt a kutyákat 5 hónapon át standard fenntartó táplálékkal etették (Medium Adult, Royal Canin, Aimargues, Franciaország; 1. táblázat). A vizsgálat során minden kutya 8 héten át hiperlipid, normoproteikus kereskedelmi táplálékot kapott (33% zsír, 29% fehérje, 4830 kcalME (metabolizálható energia)/kg (Marathon 5000 ® Royal Canin, Aimargues, Franciaország; 1. táblázat). véletlenszerűen két csoportba sorolták: a HF-100 csoportba, akik a fenntartó energiaigény 100% -ával kapták az étrendet (n = 8; 103 ± 11 kcalME/ttkg/nap) és a HF-150 csoport, amely a fenntartási energiaigény 150% -ával fogyasztotta az étrendet (n = 16; 168 ± 26 kcalME/ttkg 0,75/nap). Az ételt naponta egyszer adták, és a víz folyamatosan rendelkezésre állt. A fenntartási szükséglet kielégítéséhez szükséges étrend mennyiségét abból az energiából számították ki, amely az állandó súly megőrzéséhez szükséges volt a vizsgálat előtti időszakban.

Asztal 1. A vizsgálat előtti étrend és a magas zsírtartalmú étrend összetétele táplálékként és energiánként.

A vizsgálat felépítését az 1. ábra mutatja. A BW-t és a BCS-t minden héten rögzítettük. A vérmintákat 24 órás táplálék nélküli periódus után, étkezés után pedig a takarmány-provokációs tesztet követően, a 8 hetes periódus előtt és végén végeztük. A vastagbél biopsziákat hajtottuk végre, és az étrend emészthetőségét azonos időbeosztás szerint határoztuk meg. A vastagbél permeabilitását a kiinduláskor, valamint 4 és 8 hét elteltével határoztuk meg. Friss székletmintákat vettek kiinduláskor, majd kéthetente.

1.ábra. A vizsgálat kísérleti terve. A HF-100 a magas zsírtartalmú étrendet fogyasztó kutyák csoportjának felel meg a fenntartási energiaigény 100% -ával, a HF-150 pedig a magas zsírtartalmú étrendet fogyasztó kutyák csoportjának felel meg a fenntartási energiaigény 150% -ával. A HF-150a és a HF-150b két külön alcsoport, amelyek a HF-150 csoport 8 kutyájából állnak.

Emészthetőség

A szerves anyag, a nyersfehérje és a zsíranyag emészthetőségét a FEDIAF táplálkozási irányelveinek megfelelően határozták meg (27).

Feed-Challenge teszt

24 órás táplálék nélküli időszak után a kutyákat takarmányteszt-tesztnek vetették alá. Az orális provokációs takarmány 3 g/ttkg 0,75 fehérjéből, 3 g/ttkg 0,75 glükózból, 2,5 g/ttkg 0,75 lipidből állt. Vérmintákat vettünk a nyaki vénából a fertőzéses adagolás előtt és 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240 és 360 perccel. Az AlphaTRAK-ot, egy validált hordozható kutya vércukor-mérőt (Abbott Animal Health, Abbott Park, IL, USA), a vércukor-koncentráció meghatározásához közvetlenül a gyűjtés után használtuk. A plazmamintákat a vizsgálatok elvégzéséig -80 ° C-on tároltuk.

Szérum és plazma vizsgálatok

Leptin (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), adiponektin (Wuhan Fine Biotech Co, Wuhan, Kína), ghrelin (BioVendor, Karasek, Csehország), gyomor-gátló polipeptid (GIP) és Y neuropeptid (NPY) (BlueGene Biotech, Shanghai, Kína), a C-reaktív fehérje (CRP) (Helica, Santa Ana, Kalifornia, USA), a szérum amiloid A (SAA) (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) és a haptoglobin (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) koncentrációkat mértük. plazmát specifikus enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készlettel a gyártók utasításai szerint. Az inzulin koncentrációt radioimmun vizsgálattal határoztuk meg (IRMA inzulin KIT, Beckman Coulter, Nyon, Svájc). A plazma LPS-koncentrációt limulus amoebocita-lizátum (LAL) vizsgálattal mértük pirokróm kromogén reagens alkalmazásával (Associates of Cape Cod, INC., East Falmouth, MA, USA). A plazma lipopoliszacharid-kötő fehérje (LBP) koncentrációját ELISA kit alkalmazásával (Novatein Biosciences, Woburn, MA, USA) vizsgáltuk. A szuperoxid-diszmutázt (SOD), a glutation-peroxidázt (GPx) és a teljes antioxidáns státust (TAS) kolorimetriás módszerrel (Randox, Egyesült Királyság) vizsgáltuk. A triglicerideket (TG), az összes koleszterint, a HDL-koleszterint (HDL-C) és a nem észterezett zsírsavakat (NEFA) kolorimetriás vizsgálatokkal határoztuk meg (Sobioda, Montbonnot Saint Martin, Franciaország).

Vastagbél átjárhatóság

Cukor bevitele és vizeletgyűjtés

24 órás táplálék nélküli időszak után a BW-t rögzítették, és a kutyákat egyedi gyűjtőtollakba helyezték. A víz folyamatosan rendelkezésre állt ad libitum. Két milliliter testtömeg-kilogramm cukoroldatot (150 mg/ml laktulóz (Mylan Pharma, Saint-Priest, Franciaország) és 100 mg/ml szukralózt (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA)) adtunk be orálisan., a kutyáknál korábban leírtak szerint (28). Négy órával a cukrok beadása után a kutyákat etették napi adagjukkal. Negyvennyolc órás vizeletet gyűjtöttünk, és a mintákat -20 ° C-on tároltuk a későbbi elemzés céljából.

Vizeletcukor tartalom

A vizeletmintákat Hernot és munkatársai által korábban leírt módon készítettük el. a belső standard kivételével a turanóz (28). Az egyes cukrok koncentrációját gázkromatográfia-tömegspektrometriás módszerrel értékeltük (Agilent technologies, Santa Clara, Egyesült Államok). A vizelet cukor koncentrációját és a 48 órás összegyűjtött vizelet térfogatát használtuk a kiválasztott cukrok teljes mennyiségének kiszámításához. Az egyes vizeletben levő cukor mennyiségét a bevitt mennyiség százalékában fejeztük ki. A vastagbél permeabilitását a% laktulóz és a szukralóz% (L: S) arányával becsültük meg.

Biopsziák

24 órás táplálék nélküli időszak és két vastagbél-előkészítés után (a kolonoszkópia előtti napon és közvetlenül előtte) meleg beöntéssel vízzel, állatonként hat vastagbél-nyálkahártya biopsziát végeztünk mindkét mintavételi időpontban (0 és 8 hét) egy szálkötés segítségével 15 és 30 cm-re a végbéltől, altatásban. A szövetbiopsziákat azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és -80 ° C-on tartottuk, az RNS-szövet kivonásáig.

Az érzéstelenítő gyógyszerek közé tartozott a medetomidin (Domitor®, Elanco, Neuilly sur Seine, Franciaország) 15 μg/ttkg-ban és a butorfanol (Dolorex®, MSD Animal Health, Beaucouze, Franciaország) 0,2 mg/ttkg-ban, és intravénás bolus formájában adták be 10 percig az érzéstelenítés kiváltása előtt. Az általános érzéstelenítést propofollal (Propovet®, Axience, Pantin, Franciaország) 2 mg/ttkg intravénásan indukáltuk. Az orotracheális intubáció után az általános érzéstelenítést fenntartjuk izoflurán oxigénnel. Ringer-laktát-oldatot (Virbac®, Franciaország) intravénásán adagoltunk 5 ml/ttkg/h sebességgel. Az eljárás befejezése után az anesztézia beadását abbahagyták, és oxigént juttattak az extubálásig. 75 μg/ttkg-os atipamezolt (Atipam, DECHRA Veterinary Products SAS, Suresnes, Franciaország) intramuszkulárisan adagoltunk tartós gyógyulás esetén.

RNS extrakció és RT-PCR

A teljes RNS-t a vastagbél szövetéből extraháltuk TRIzol® reagenssel a gyártó utasításai szerint (Life Technologies, Cergy-Pontoise, Franciaország), és koncentrációját spektrofotometriával mértük 260 nm-en.

A teljes RNS-t reverz átírással cDNS-be írtuk át Superscript IV reverz transzkriptáz (Life Technologies, Cergy-Pontoise, Franciaország) alkalmazásával. Kiegészítő DNS-oldatot (2,5 μl) adunk egy keverékhez, amely 10 μl Takyon TM MasterMix-et (Eurogentec, Angers, Franciaország), 2 μl mindegyik primert (2,5 mM) (érzék és antiszensz) és 3,5 μl ultratiszta vizet tartalmaz. A valós idejű PCR-t CFX96 Connect rendszeren (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) végeztük. Az RNS szekvenciáját az NCBI nukleotid adatbázisában kaptuk. A primereket a Primer 3 beviteli programmal (Palo Alto CA, USA) terveztük és a 2. táblázatban mutattuk be. Referenciaértékként a GAPDH expresszióját használtuk. A génexpressziót a 2 -ΔΔ-vel számítottukCt módszer (29).

2. táblázat. Érzékelő és antiszensz primerek szekvenciái.

Mikrobiota elemzés

Minden héten a párban elhelyezett kutyákat napközben elválasztották a széklet azonosítása érdekében. A székletmintákat a spontán székletürítés után azonnal összegyűjtötték, folyékony nitrogénben lefagyasztották, majd felhasználásig -80 ° C-on tárolták. A székletmintákból származó bakteriális DNS-extrakciót a kereskedelemben kapható készlet (PowerSoil ® DNS-izoláló készlet, Mo Bio Laboratories Inc., Quiagen, Carlsbad, CA, USA) segítségével, a gyártó utasításainak megfelelően hajtották végre.

A 16S rRNS gén V4 variábilis régiójának 515/806 (minden állat számára sajátos vonalkóddal) PCR-primereket 30 ciklusú PCR-ben használtuk a HotStarTaq Plus (Qiagen, USA) fő keverőkészlet alkalmazásával a következő körülmények között: 94 ° C 3 percig, majd 30 ciklusig 94 ° C-on 30 másodpercig, 53 ° C-on 40 másodpercig és 72 ° C-on 1 percig, majd ezt követően végleges megnyújtási lépést hajtunk végre 5 percig 72 ° C-on. Az amplifikáció után a PCR termékeket 2% -os agaróz gélben ellenőriztük, hogy meghatározzuk az amplifikáció sikerességét. Több mintát egyesítettünk, azonos arányban, DNS-koncentrációjuk alapján. Az egyesített mintákat kalibrált Ampure XP gyöngyökkel tisztítottuk. Ezután az egyesített és tisztított PCR-terméket felhasználtuk az Illumina DNS-könyvtár előállításához. A szekvenálást MR DNS-en (www.mrdnalab.com, Shallowater, TX, USA) végeztük egy MiSeq-en a gyártó útmutatásait követve. A szekvenciaadatokat MR DNS-elemző pipeline segítségével dolgoztuk fel (MR DNS, Shallowater, TX, USA). Összefoglalva: szekvenciák csatlakoztak, vonalkódok kimerültek, ® (San Diego, Kalifornia).

Eredmények

A kutyák egészségesek maradtak a vizsgálat ideje alatt. Teljesen megették napi adagjukat, amit a testsúly fenntartása vagy a súlygyarapodás is támogatott.

8 hetes diéta után a BW és a BCS szignifikánsan magasabb volt a HF-150 csoportban, mint a HF-100 csoportban. A HF-150 csoportban az átlagos testtömeg 17,4 ± 6,5% -kal nőtt a 8 hetes beavatkozás során, és ez a BCS növekedésével járt (8. hét: medián BCS 7; tartomány 6–7 vs. 0 hét: medián BCS 6; 5–6 tartomány) (2A, B ábra).

2. ábra (A) Testtömeg és (B) A testállapot (BCS) azoknál a kutyáknál, akik magas zsírtartalmú étrendet fogyasztottak fenntartáskor (HF-100; n = 8) és 150% -os karbantartással (HF-150; n = 16) 8 hét alatt. Az adatok átlag ± SEM. ****P $ P $ P $$$ P $ P # P $ P $$ P # P ## P $ P $$ P § P # P $ P Kulcsszavak: magas zsírtartalmú étrend (HFD), mikrobiota (mikroorganizmus), vastagbél gát, inzulinérzékenység, kutya

Idézet: Moinard A, Payen C, Ouguerram K, André A, Hernandez J, Drut A, Biourge VC, Suchodolski JS, Flanagan J, Nguyen P és Leray V (2020) A magas zsírtartalmú étrend két energetikai szinten gyakorolt ​​hatása a széklet mikrobiotájára, Vastagbél korlát és anyagcsere paraméterek kutyákban. Elülső. Állatorvos. Sci. 7, 566282. doi: 10.3389/fvets.2020.566282

Beérkezett: 2020. május 27.; Elfogadva: 2020. augusztus 21.;
Megjelent: 2020. szeptember 25.

Véronique Anne Lacombe, Oklahoma Állami Egyetem, Egyesült Államok

Mohamed E. Abd El-Hack, Zagazig Egyetem, Egyiptom
F. Capela e Silva, Universidade de Évora, Portugália