A csipkebogyó kiegészítés növeli az energiafelhasználást és a fehér zsírszövet barnulását váltja ki

Absztrakt

Háttér

A túlsúly és az elhízás széles körben elterjedt krónikus rendellenességek, amelyeket túlzott zsírfelhalmozódásként határoznak meg, és számos krónikus betegség, köztük a 2-es típusú cukorbetegség, a szívkoszorúér-betegség, a magas vérnyomás és a zsírmáj fő kockázati tényezői. Az életmód változásai, például a fokozott fizikai aktivitás és az egészséges étrend, kulcsfontosságú eszközök lehetnek az elhízás kezelésében. A csipkebogyó bevitele, a növényhez tartozó több növény gyümölcse Rosaceae kimutatták, hogy csökkenti a testzsír-tömeget és megakadályozza a testtömeg-növekedést. Így a vizsgálat célja azon potenciális mechanizmusok tisztázása volt, amelyek révén a csipkebogyó gátolja az étrend okozta elhízást.

Mód

A C57BL/6 J egereket magas zsírtartalmú étrenddel (RH) vagy anélkül (CTR) csipkebogyó-kiegészítéssel etették három hónapig. Az in vivo közvetett kalorimetriát, valamint a gén expressziót és a különböző zsírraktárak fehérjeszintjét monitoroztuk.

Eredmények

Bár az energiafogyasztásban nem találtunk különbséget a CTR csoporthoz képest, az RH megakadályozta a testtömeg-növekedést, és csökkentette a vércukor-, inzulin- és koleszterinszintet. A közvetett kalorimetria azt mutatta, hogy az RH-vel táplált egerekben az összehasonlítható önkéntes aktivitás ellenére az EE jelentősen magasabb volt a sötét fázisban. Ezenkívül, amikor futópad futással szembesültek, az RH-vel táplált egerek nagyobb metabolikus sebességet mutattak. Ezért feltételeztük, hogy az RH stimulálhatja a barna zsírszövet (BAT) termogén képességét, vagy a fehér zsírszövet (WAT) barnulását idézheti elő. A CTR csoporthoz képest egyes barna és „brite” markerek génexpressziója és fehérje szintje, valamint a barna adipocita differenciálódást és termogenezist elősegíteni képes gének (pl. ucp1, tbx15, bmp7, és cidea), valamint az AMPK foszforilációja megnőtt az RH-vel táplált egerek WAT-ban (de nem BAT-ban).

Következtetések

Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy az étrendi csipkebogyó megakadályozza a testtömeg-növekedést azáltal, hogy növeli az egész test EE-t és előidézi a WAT barnulását. Így potenciális terápiás vonatkozása lehet az elhízás és a kapcsolódó anyagcserezavarok kezelésére.

Háttér

Az elhízás olyan állapot, amely korai halálhoz vezet számos társbetegség, például szív- és érrendszeri betegségek [1], 2-es típusú cukorbetegség [2], magas vérnyomás [3] és rák [4, 5] miatt. A zsírszövet funkcionálisan és morfológiailag kétféle szövettípusból áll, a WAT-ból és a BAT-ból [6]. Az egyoldalú WAT egyik fő szerepe a trigliceridek tárolása, valamint a zsírsavak és az adipocitokinek felszabadulása, míg a multilokuláris BAT az alkotmányosan expresszált UCP1 révén hő formájában is eloszlatja az energiát [7, 8]. A termogén kapacitású adipociták egy másik altípusa megjelenhet a WAT-on belül, különféle ingerekre reagálva [9]. Ezeket a sejteket „brite” -nek (barna-fehérben), „bézs” -nek, “indukálhatónak” vagy “toborozhatónak” nevezték el, és elérik a BAT-ra jellemző jellemzőket, például a magas mitokondriális tartalmat, a multilokuláris lipidcseppeket és a BAT-specifikus expresszió képességét. gének [9–12]. Mivel a BAT felfedezése felnőtt embereknél is jelen van [13–17], termogén képességének növelése vagy a fehér bézs zsírsá történő átalakulásának elősegítése terápiás stratégia lehet az elhízás, a cukorbetegség és az anyagcserezavarok kezelésére [8].

Számos tényező, például gyógyszerek, megfázás, adrenerg stimuláció és testmozgás képes kiváltani a fehér zsír megbarnulását [8, 11, 18]. Néhány étrendi komponens szintén befolyásolhatja az energia homeosztázisát. Például a resveratrol [19], a kurkumin [20] vagy a konjugált linolsavak [21] kimutatták, hogy csökkentik az adipozitást és barnaszerű adipocitákat indukálnak a WAT-ban.

A csipkebogyó (RH) a nemzetség több növényének gyümölcse Rosa, a Rosaceae család, és gazdag aszkorbinsavban [22], fenolos vegyületekben [23] és karotinoidokban [24]. Elhízás-, gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatást fejt ki in vivo és in vitro [25–30], valamint jótékony és fájdalomcsillapító tulajdonságokkal rendelkezik ízületi gyulladásban szenvedő betegeknél [31–34]. Az elhízás az energiafogyasztás (EI) és az energiafelhasználás (EE) közötti egyensúlyhiány következménye, és ennek a tanulmánynak a célja a csipkebogyó elhízás elleni hatásainak hátterében álló mechanizmusok tisztázása volt.

Mód

Kísérleti állatokon végzett eljárások

Nyolc hetes hím C57BL/6 J egereket vásároltak a dániai Taconic-ból. Az állatokat szabályozott hőmérsékletű helyiségben (22 ° C) tartottuk 12:12 órás fény: sötét ciklusban, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. Egy hét akklimatizáció után az egereket véletlenszerűen két csoportra osztották (n = 12) és kontroll HFD-t (CTR) vagy csipkebogyóval (RH) kiegészített HFD-t tápláltak 3 hónapig. A vizsgálatot a Helyi Állatetikai Bizottság hagyta jóvá (Lund, Svédország).

Fogyókúrák

A két kísérleti étrend 45% zsírtartalmat tartalmazott (Research diets, New Brunswick, NJ, USA) (1. táblázat). A csipkebogyó port az Orkla ASA-tól (Oslo, Norvégia) szerezték be, és az Eurofins Food & Agro Testing (Svédország) elemezte. Összetétele alapján (2. táblázat) a makrotápanyag-tartalom kiegyensúlyozott volt a két étrendben.

Glükóz tolerancia teszt

Az intraperitoneális glükóz tolerancia tesztet (IPGTT) 6 órán át éheztetett egereken végeztük 2 g/kg D - (+) - glükóz (SIGMA-Aldrich, St. Louis, MO) injektálásával, majd vérmintát vettünk a saphena vénából. heparinnal bevont csövekben 0, 30, 60 és 120 percen keresztül. A vérmintákat centrifugáltuk, a plazmát összegyűjtöttük és Infinity ™ -glükózzal (Fisher Diagnostic, Middletown - VA) elemeztük a gyártó utasításainak megfelelően.

Inzulin tolerancia teszt

Intraperitoneális inzulin tolerancia tesztet (IPITT) végeztünk 4 órás éhgyomri egereken 0,75 E/kg inzulin injekciójával (Actrapid®, Novo Nordisk, Dánia). A vérmintákat 0, 15, 30 és 60 perc múlva vettük fel, és a vércukorszintet az Accu-check Aviva (Roche Diagnostic Gmbh, Németország) segítségével határoztuk meg.

Plazmaelemzés

A vizsgálat végén a vért orbitális szúrással vettük ki, és heparinnal bevont csövekbe gyűjtöttük 10 órás éheztetett izofluoránnal altatott egerekből. A vért azonnal centrifugáltuk, a plazmát összegyűjtöttük, fagyasztva lefagyasztottuk és -80 ° C-on tároltuk. A plazma inzulin, az összes koleszterin és a triglicerid szint meghatározásához az inzulin ELISA-vizsgálatokat (Mercodia, Svédország), az Infinity ™ -Koleszterin- és az Infinity ™ -Triglicerid-vizsgálatokat (Fisher Diagnostic, Middletown - VA) használtuk a gyártó utasításainak megfelelően.

Közvetett gázkalorimetria és viselkedésfigyelés

A teljes test energia-anyagcseréjét, az étel- és vízfelvételt, valamint az önkéntes mozgás- és kerék aktivitást a PhenoMaster/LabMaster Home ketrecrendszerrel (TSE-rendszerek, Németország) mértük. Az egereket a kísérletek előtt két napig lemértük és akklimatizáltuk. Az összes paramétert 15 percenként 24 órán keresztül rögzítettük. Két 24 órás kísérletet hajtottunk végre, és átlagoltuk mindegyik egeret.

Futópad és közvetett kalorimetriás mérések

A kísérletet egy CaloTreadmill (TSE Systems - Németország) négynapos edzés után 20% -os dőlésszöggel hajtották végre. Az EE, az oxigén és a szén-dioxid frakcióit folyamatosan monitoroztuk, és kiszámítottuk a légzéscsere arányt (RER). Protokoll futtatás: miután az egereket a futópadba helyezte, a sebesség kissé megnőtt: 0–14 m/perc 5 percig, majd 14–18 m/perc 15 percig, majd 18 perc/perc folyamatos futás 28 percig. Ezt követően a sebesség 1 perc alatt 18-ról 0 m/perc-re csökkent. A kimerültséget a rendszeres futás folytatásának képtelenségeként határozták meg.

Oxigénfogyasztás WAT-ban és BAT-ban

Bomba kalorimetria

A széklet bruttó energiatartalmát bombakaloriméterrel határoztuk meg (Parr Instrument Company - USA). Az üregeket egyketreces egerekből gyűjtötték, fagyasztva szárították 24 órán át, és körülbelül 1 g-os pelletet készítettek, és a gyártó utasításait követve elégették az 1108P Oxygen Bomb-ban (Parr Instrument Company - USA).

RNS előkészítés és valós idejű kvantitatív PCR

A teljes RNS-t izoláltuk a szövetből Qiazol-lízis reagens alkalmazásával (Quiagen Sciences, USA). Két μg RNS-t kezeltünk DNáz I-gyel (DNáz I amplifikációs fokozat; Invitrogen, CA), majd fordított irányban átírtuk véletlenszerű hexamerekkel (Amersham Biosciences, NJ) és SuperScript II reverz transzkriptázokkal (Invitrogen, CA). A kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakciókat ABI PRISM 7900 System alkalmazásával hajtottuk végre TaqMan láncindítókkal, bmp7 (Mm00432102_m1), ppargc1a (Mm01208835_m1), fgf21 (Mm00840165_g1), elovl3 (Mm004681642m1) ), car4 (Mm00483021_m1), tfam (Mm00447485_m1), nrf1 (Mm01135606_m1) és reagensek (Applied Biosystems, CA); A Qiagen SYBR zöld primerek a Prdm16 (QT00148127), a tbx15 (QT00148127), a zic1 (QT00173502), a tcf21 (QT00100688), az ucp1 (QT00097300), a cpt1 (QT00172564) és a tbp (QT00) voltak. Mindegyik reakciót két példányban hajtottuk végre, és az eredményeket két belső kontroll (Rps29 és Tbp) geometriai átlagához normalizáltuk.

Western blottolás

Körülbelül 50 mg szövetet homogenizáltunk lízispufferben (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% NP40, 1 mM Na-ortovanadát, 40 mM NaF, 4 mM Na-pirofoszfát, 0,27 M szacharóz, 1 mM DTT, 20 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml antipain és 1 μg/ml pepstatin), majd 12 000 g-vel 20 percig 4 ° C-on centrifugáljuk. A felülúszó fehérjekoncentrációját BCA-vizsgálattal (Pierce) határoztuk meg, és 20 μg fehérjét oldottunk fel NuPAGE 4–12% Bis-Tris gélen (Life technologies - Carlsbad, CA), és elektroblotizáltuk nitrocellulóz membránokra (Amersham, GE Healthcare Egyesült Királyság). Elsődleges antitestek a következők voltak: Cidea (Abin1858406 - Antitestek online), béta-aktin (A5441 - Sigma), pAMPK (CST2535 - Sejtjelzés), AMPK (CST2603 - Sejtjelzés), PGC1α (Ab54481 - Abcam). Másodlagos antitestek a következők voltak: juh anti-egér (NA931V - GE Healthcare) és kecske anti-nyúl (31460 - Thermo Fisher).

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SD-ként mutatjuk be. A statisztikai elemzést a Graph-Pad Prism 6 alkalmazásával végeztük, párosítatlan Student-ek felhasználásával t-teszt és kétirányú ANOVA, majd Tukey bejegyzése-hoc teszt a futópad adatkészletéhez. Értékei o

Eredmények

Az RH-kiegészítés megakadályozza a súlygyarapodást és antidiabetikus hatásokat fejt ki

A vizsgálat végén az RH-val táplált egerek csökkent testsúlyt (1a. Ábra) és éhomi glükózszintet (1b. Ábra) mutattak, annak ellenére, hogy a két csoport között hasonló volt az EI (1c. Ábra). Az IPGTT feltárta, hogy az RH-vel táplált egereknél fokozottabb a glükóz elhelyezkedés (1d. Ábra), míg az IPITT után (1e. Ábra) nem találtunk különbséget. A CTR csoporthoz képest az RH-kiegészítés jelentősen csökkentette a plazma teljes koleszterin- és inzulinszintjét (1f-g ábra). A trigliceridek szintje összehasonlítható volt a két csoport között (1h ábra).

Az RH táplálás növeli az EE, VO2 és VCO2 értékeket

A 24 órás kalorimetrikus ketreces kísérletek nem mutattak különbségeket a mozgásszervi aktivitásban, a kerék futásában vagy az EE-ben (2a-c. Ábra) a két egércsoport között. Mindazonáltal, ha csak a sötét fázist vesszük figyelembe, az RH-vel táplált állatok ismét hasonló mozgásszervi (2d. Ábra) és kerék aktivitást mutattak (2e ábra), de szignifikánsan magasabb EE-t mutattak (2f. Ábra), ami arra utal, hogy a megnövekedett EE nem tulajdonítható hiperaktivitásra. Ezenkívül az ürülék elemzése szignifikánsan magasabb energiatartalmat tárt fel az RH etetést követően (2g. Ábra). Ezenkívül egy ex vivo WAT-on és BAT-on végzett női egerek oxigénfogyasztási kísérlete azt mutatta, hogy a mitokondriális légzés megnövekedett az RH táplálásakor (3a. És b. Ábra), megerősítve az új in vivo eredményeket.

Az RH-kiegészítés növeli az anyagcserét a futópad edzése során

Mivel a testmozgás növeli az EE-t [35, 36] és aktiválja a barnító programot [18], futópad futással kihívtuk a két egércsoportot. Ismét a közvetett kalorimetria azt mutatta, hogy az RH-val táplált egereknél az EE (4a. Ábra) és a VO2 (4b. Ábra) lényegesen magasabb volt, míg a RER-ben (4c) nem találtunk különbséget. Érdekes módon az RH csoport egyik egere nem tudta befejezni a futást, míg egy másik befejezte a tesztet, de néhányszor eljutott a futópad aljáig, mielőtt azonnal újraindította a futást. Az összes CTR-egér probléma nélkül zárta le a tesztet.

A páratartalom táplálása felregulál ucp1 és más BAT és brite markerek a WAT-ban

Annak megvizsgálására, hogy az étrendi RH képes-e stimulálni a BAT termogén aktivitását, elemeztük az interscapularis barna zsírraktár kiválasztott génjeinek expresszióját. A CTR csoporthoz képest nem találtunk különbséget a ucp1 vagy bármely más elemzett gén (5a. ábra). Ezután megvizsgáltuk a BAT- és a brite-markerek expresszióját a szubkután inguinalis WAT-ban (scWAT). Ebben a zsírraktárban, ucp1 az RH markánsan felülszabályozta, valamint bmp7, tbx15 és cidea (5b. Ábra). Továbbá a mitokondriális oxidáció markerei között, cpt1 jelentősen megnőtt (5b. ábra). A kifejezés zic1, egy tipikus BAT markert mindkét csoportban nem észleltünk (5b. ábra). A Western blotting elemzésből kiderült, hogy az étrendi RH jelentősen felülszabályozta a CIDEA-t és fokozta az AMPK foszforilációját (5c. Ábra), míg a megnövekedett PGC1α szint tendenciája nem érte el a szignifikáns különbségeket (5c. Ábra).

Vita

Az elhízás az energia homeosztázisának kiegyensúlyozatlanságából alakul ki, amikor az EI meghaladja az EE-t. Ez a fő kockázati tényező a 2-es típusú cukorbetegség, a dyslipidaemia, a szív- és érrendszeri betegségek és számos más betegség kialakulásában. Korábbi tanulmányaink azt mutatják, hogy az RH képes megakadályozni a súlygyarapodást [26], ezért arra törekedtünk, hogy megvizsgáljuk azokat a mechanizmusokat, amelyek révén az RH gyakorolja ezeket a hatásokat azáltal, hogy a C57BL/6 J egereket RH-val kiegészített HFD-vel támadjuk meg.

A CTR-csoporthoz képest az RH-kiegészítés megakadályozta a testtömeg-növekedést és csökkentette a glükóz-, inzulin- és koleszterinszintet, bár a két csoport hasonló EI-t mutatott. Ezután kalorimetrikus ketreceket használtunk az in vivo közvetett gázkalorimetria mérésére. Annak ellenére, hogy a 24 órás mérés során nem találtunk különbséget, az RH-vel táplált egereknél magasabb volt az EE EE értéke a sötét fázisban, míg a spontán kerék- és mozgásszervi aktivitások összehasonlíthatók voltak a két csoport között. A bomba kalorimetriás elemzése azt mutatta, hogy az RH-vel táplált egerek székletének energiatartalma magasabb volt a CTR csoporthoz képest, ami azt jelzi, hogy az RH csökkenti a bél energiafelvételét. Ez a hatás nagy valószínűséggel hozzájárul az RH elhízás elleni hatásához. Ezenkívül az RH-vel táplált egereknél nagyobb az anyagcsere sebessége intenzív fizikai edzés közben is. Az a tény, hogy az RH csoport egyik egere a kísérlet vége előtt befejezte a futópad tesztet, egy másik pedig közel volt a kimerültséghez, de nem érte el a kimerültséget, tükrözheti a zsírszövetből származó zsírsavak elégtelen szállítását a vázizomba, a barnulás miatti magasabb mitokondriális szétkapcsolási képesség eredményeként.

A CIDEA fehérje szinttel együtt az AMPK foszforilációja is megemelkedett az RH csoportban. Az elmúlt években az AMPK iránti érdeklődés nagy része annak a megfigyelésnek köszönhető, hogy aktivitása csökken az elhízás legtöbb genetikai modelljében [42]. Nemrégiben Wang és munkatársai bebizonyították, hogy a resveratrol az AMPK aktiválása révén barna jellegű adipocita képződést vált ki a fehér zsírban [19]. Az AMPK a PGC1α-t is foszforilezheti a mitokondriális biogenezis fokozása érdekében [43], és egy másik tanulmány kimutatta, hogy az AMPK elengedhetetlen a barna adipocita differenciálódásához és a WAT barnulásához [44]. Így az RH táplálásakor megfigyelt megnövekedett AMPK foszforiláció fontos mechanizmus lehet az elhízás csökkentésében és az EE növelésében, de további vizsgálatokat igényel.

Következtetések

Jelen tanulmányunkban két lehetséges mechanizmust határozunk meg, amelyek révén az RH elhízás elleni hatást fejthet ki. Először is, az étrendi RH bevitele az SCWAT megbarnulását idézi elő egyes BAT markerek felülszabályozása és az AMPK fokozott foszforilációja révén. Másodszor, az RH étrendi bevitele látszólag csökkenti a bél energiafelvételét. Így az RH bevitele elhízás elleni hatást fejt ki mind az EE-re, mind az EI-re gyakorolt hatásokon keresztül. Megerősítő kísérletek humán személyeken, valamint kiegészítő mechanisztikus vizsgálatok szükségesek ahhoz, hogy az RH "brit" jövőt nyújtson étrend-kiegészítőként az elhízás és a kapcsolódó anyagcserezavarok megelőzésére és kezelésére.