Dendrites fenotípusok visszafordítása 16p11.2 mikroduplikációs egérmodell neuronokban egy hálózati hub farmakológiai célzásával

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: [email protected]

Szerkesztette: Salomon H. Snyder, a Johns Hopkins Egyetem Orvostudományi Kar, Baltimore, MD, és 2016. május 23-án jóváhagyta (2016. május 10-én kapott felülvizsgálatra)

Jelentőség

A neuronális dendritikus fák felépítése döntő fontosságú az agykapcsolat szempontjából, míg a dendritikus rendellenességek pszichiátriai rendellenességekkel társulnak. A ritka példányszám-variációk (CNV) a mutációk kategóriája, amelyek gyakran társulnak skizofrénia, autizmus és más mentális rendellenességek kapcsán. A CNV-rendellenességek genetikai összetettsége azonban komoly kihívást jelent a kísérletileg megközelíthető mechanizmusok azonosítása szempontjából. Itt hálózati elemzéssel azonosítottuk a fehérje – fehérje interakciós hálózatok topológiailag legfontosabb központját egy ilyen CNV-n belül és a pszichiátriai CNV-k szélesebb génhálózataiban. Ezután megmutatjuk, hogy ennek a csomópontnak a farmakológiai célzása megfordítja a dendritikus változásokat ennek a CNV neuronális modelljének, felvázolva a sejtes fenotípusok elemzésének és megfordításának stratégiáját CNV-vel kapcsolatos pszichiátriai rendellenességekben.

Absztrakt

A dendritikus nyílászárók felépítése hozzájárul az agy neuronkapcsolatához. Ezzel szemben a dendritek rendellenességeiről több mentális rendellenességről számoltak be, és úgy gondolják, hogy hozzájárulnak a patogenezishez. A ritka kópiaszám-variációk (CNV-k) olyan genetikai változások, amelyek a mentális rendellenességek széles skálájához kapcsolódnak, és nagyon behatolóak. A 16p11.2 mikroduplikáció egyike azoknak a CNV-knek, amelyek a skizofréniához és az autizmushoz kapcsolódnak legszorosabban, és több olyan gént is átfognak, amelyek esetleg részt vesznek a szinaptikus neurotranszmisszióban. Ugyanakkor a betegség szempontjából releváns 16p11.2 mikroduplikáció sejtfenotípusait és a vezető gén (et) még azonosítani kell. Megnövekedett dendrites arborizációt találtunk izolált kérgi piramis idegsejtekben a 16p11.2 duplikációjú egérmodellből (dp/+). A hálózati elemzés az ERK1 MAP kinázt kódoló MAPK3-at azonosította a fehérje-fehérje interakciós hálózatok topológiailag legfontosabb csomópontjaként a 16p11.2 régióban és a skizofrénia-társított CNV-k szélesebb génhálózatában. Az ERK farmakológiai célzása megfordította a dp/+ idegsejtekhez kapcsolódó dendritikus változásokat, stratégiát vázolva a sejtes fenotípusok elemzésére és visszafordítására CNV-vel kapcsolatos pszichiátriai rendellenességekben.

A dendrites gerendák felépítése meghatározza a piramis idegsejt dendrites receptív mezőjét (1). Ezenkívül a dendrites arborizáció mintázatai elengedhetetlenek az idegsejt számítási képességéhez (1). A megfelelő dendrites befogadó mezők létrehozása és fenntartása ezért elengedhetetlen a komplex viselkedés alapjául szolgáló idegi áramkör működéséhez. Ezzel szemben a dendritekben változások fordulnak elő pszichiátriai rendellenességekben, beleértve a skizofréniát és az autizmus spektrum rendellenességet (ASD) (2).

A pszichiátriai rendellenességek összetett genetikai felépítésűek, ezt részben a ritka, nagy penetranciájú változatok magyarázzák (3, 4). Bár e ritka mutációk előfordulási gyakorisága alacsony (4 ⇓ ⇓ –7), a ritka változatok betegségkockázatra háruló terhei az esetek jelentős hányadát jelenthetik a kapcsolódó rendellenességekben (8). A ritka variációk legjobban jellemezhető formái a nagy genomiális regionális duplikációk vagy deléciók, másolatszám-variációkként (CNV) ismertek. A CNV-k nagy, gyakran több gént is magában foglaló genomiális változásokat jelentenek, amelyek jelentős kockázatot jelentenek (esélyhányados = 3–30) (9). A megnövekedett ritka CNV-terhelés számos neurodevelopmentális pszichiátriai állapothoz kapcsolódik, beleértve a skizofréniát, az ASD-t és az értelmi fogyatékosságot (5, 7, 10, 11). A CNV-kben található nagyszámú gén miatt azonban a genotípus és a fenotípusok közötti kapcsolat megértése és a potenciális célpontok racionális azonosítása a kórosan releváns fenotípusok megfordítására CNV-rendellenességekben nagy kihívást jelentett.

Mivel azonban a CNV több szervrendszert és agyi régiót is érint (22, 23), nehéz megkülönböztetni a sejttípus-autonóm és a szisztémás hatásokat. Ennek a zavarnak a kezelésére itt megvizsgáltuk a kortikális piramis idegsejteket a 16p11,2-ortológ duplikációra (dp/+) heterozigóta egerekből származó primer tenyészetekből származó vadkultúrájú neuronokról és vad típusú alomtársaikról (+/+).

A pszichiátriai rendellenességek genetikai felépítésének összetettsége komoly kihívást jelent a kísérletileg megközelíthető mechanizmusok azonosítása szempontjából. Bár az ok-okozati viszony meghatározása összetett és kísérletileg nehezen megközelíthető, még ugyanazon a CNV-n belül is, úgy ítéltük meg, hogy a fenotípus megfordítása kísérletileg hozzáférhetőbb lehet. Feltételezik, hogy a betegség fenotípusai a megváltozott génutak vagy hálózatok következményei, és az optimális terápiás célpontoknak olyan csomópontoknak kell lenniük, amelyek nagymértékben befolyásolják a teljes hálózat működését (24). Mivel a hálózati alapú megközelítések alkalmazását feltételezték, hogy segítsenek azonosítani a patogenezis fő mozgatórugóit vagy a jelölt terápiás célpontokat (25), tovább indokoltuk, hogy a hálózati elemzés használata megközelítést nyújthat a komplexitás csökkentésére és olyan kiemelkedő mechanizmusok azonosítására, amelyek terápiásan kell kihasználni.

Itt hálózati elemzéssel azonosítottuk a fenotípus megfordulásának lehetséges jelöltjeit dp/+ egerekben, majd követtük a feltételezett mechanizmus kísérleti validálását. Megállapítottuk, hogy a dp/+ neuronok szignifikánsan megnövekedett dendrit komplexitást mutatnak a +/+ neuronokhoz képest. A hálózati elemzés az ERK1 MAP kinázt kódoló MAPK3-at azonosította a skizofrénia-asszociált CNV génekhez kapcsolódó fehérje-fehérje interakció (PPI) hálózat legfontosabb topológiás csomópontjaként, beleértve a 16p11.2-t is. Az ERK jelátvitel farmakológiai gátlása a dendritikus változások megfordulását eredményezte, ami a kezelés lehetséges megközelítéseire utal.

Eredmények

Fokozott dendrites arborizáció a dp/+ neuronokban.

A dendritek alkotják az idegsejtek befogadó mezejét, és a dendrit morfológiájának megváltozása hozzájárulhat a kortikális kapcsolat rendellenességeihez (26). Ezért megvizsgáltuk a dendrit morfológiáját a 16p11,2-ortológ duplikációra (dp/+) heterozigóta egerek és a vad típusú alomtársak (+/+) kortikális piramissejtjeiben. A fajok közötti fenotípus megőrzésének fokozása és a CNV több szervrendszerre gyakorolt hatása által okozott zavarok elkerülése érdekében megvizsgáltuk a dendriteket tenyésztett primer neuronokban. 21–24 d in vitro in vitro transzfektáltuk a tenyésztett idegsejteket GFP-t expresszáló plazmid DNS-sel, hogy lehetővé tegyük számunkra a sejtmorfológia megjelenítését (1. ábra A és B). Az egysíkú képeket 10x-es objektívvel készítették, és Sholl-elemzéshez követték és használták. Megállapítottuk, hogy a dp/+ piramis idegsejtek szignifikánsan növelték a dendrit komplexitást a +/+ neuronokhoz képest [genotípus: F (1, 25) = 6,21, P = 0,02; genotípus távolság szerint: F (49, 1225) = 1,63, P = 0,005] (1C ábra).

A MAPK3 a skizofrénia-társított CNV-hálózatok központi központja. (A) A 16p11.2 CNV régió és a szinonim régió vázlata az egér 7. kromoszómájában. A zöld sávok a 16p11.2 és 7F4 régiókat szegélyező kis példányszámú ismétlődő szekvenciákat mutatják be. Kimutatták, hogy a 16p11.2 mikroduplikációs régióból származó számos gén releváns szerepet játszik a neurodevelopmentális és szinaptikus folyamatokban. (B) DCNA. Az árnyékolt régió a központban (amely a gének többségét tartalmazza) olyan génekből áll, amelyek expressziója vagy kapcsolata sem különbözik szignifikánsan a skizofrénia és a kontrollhálózatok között; mind a 16p11.2 CNV gén ezen az árnyékolt régión belül helyezkedik el. (C) PPI hálózat öt skizofréniával társult CNV génjeihez. A csomópontok színskálájúak a centralitás-pontszám (CB) között. (D) az elsődleges CNV PPI hálózat C-től; a csomópontokat méretarányosan fokozatosan (D), színesen méretezik a CB.

Dózisfüggő fokozott ERK1 expresszió és foszforiláció dp/+ neuronokban.

Dendrit arborizáció dl/+ neuronokban. A teljes dendrit Sholl elemzése +/+ (n = 14) és dl/+ (n = 10) értékekben; nincs szignifikáns hatása a genotípusnak (P = 0,13) és nincs szignifikáns hatása a genotípus-távolság interakciónak (P = 0,21). Az értékek átlag ± SEM. A Bonferroni-korrekció után szignifikánsnak számító egyedi adatpontokat jelezzük: * Pl-cisztein (Sigma-Aldrich) 37 ° C-on], a kortikális sejteket mechanikusan disszociáltuk neuronális tápláló közegben [Neurobasal + B27 kiegészítő (Thermo Fisher Scientific) + 0,5 mM glutamin (Thermo Fisher Scientific) + penicillin/sztreptomicin (Thermo Fisher Scientific)] és poli-d-lizinnel bevont (Sigma-Aldrich) fedőlemezekre kenjük. 1 óra elteltével a táptalajt friss közegre cseréltük az elhalt vagy nem tapadó sejtek eltávolítására. Az idegsejt tenyészeteket 37 ° C-on tartottuk 5 térfogat% CO2-ban. 4 nap múlva az idegsejteket 200 μM dl -2-amino-5-foszfonopentánsavval (APV; Abcam Biochemicals) egészítettük ki, és 100 μM APV-vel kiegészített táptalajt használtunk 3 naponta etetéshez.

A plazmidokat (1–10 μg teljes DNS) és a Lipofectamine 2000-t (Thermo Fisher Scientific) DMEM-ben (Corning) és Hepes-ben (10 mM; Corning) hígítottuk, alaposan összekevertük, és 20–30 percig inkubáltuk 37 ° C-on. az elegyet in vitro, antibiotikummentes tápközegben adtuk a tenyésztett sejtekhez 21–24 d-kor. A transzfekciót követően a fedőlemezeket félig kondicionált, félig friss táptalajba helyeztük, antibiotikumokkal, és a sejteket 3 napig hagyták expresszálni a konstrukciókat.

Dendrit elemzés.

Western Blotting.

A teljes fehérje expresszió számszerűsítését Western-blot módszerekkel mértük, ahogyan azt korábban leírtuk (48). A homogenátumokat a +/+ és a dp/+ tenyésztett idegsejtek egyedi fedőlemezeiből állítottuk elő, és Western blot segítségével elemeztük az ERK1, ERK2, pERK1 és pERK2 expresszióját (3. ábra A, B és 4A). Az ERK1 és ERK2 T202 és Y204 maradékokon történő foszforilezése tükrözi a MEK upstream aktivációját. Western-blotolási kísérleteket 20 különféle tenyésztett alom 20 mintáján (11 +/+ és 9 dp/+) végeztünk. Az ERK gátlási kísérletekhez a dp/+ idegsejteket 24 órán át DMSO-val (n = 3) vagy 0,5 μM U0126-tal (DMSO-ban oldva, n = 3) kezeltük. A gátlás statisztikai szignifikanciájának meghatározásához egyfarkú Mann – Whitney t tesztet alkalmaztunk.

Protein – Protein Interaction Network Analysis.

Öt ritka skizofrénia-kapcsolt CNV-ben (1q21.1, NRXN1, 15q13.2, 16p11.2 és 22q11.2) (14) lévő gének által kódolt fehérjék listáját a DAVID segítségével a fehérje-csatlakozási számokhoz adaptált génlistákból állítottuk össze 50, 51). Fehérje-listákat importáltak a PINA2-ba elemzés céljából (31, 52). A fehérje – fehérje kölcsönhatásokat feltöltötte a PINA2-ből a Cytoscape-be (53, 54) a hálózati topológia vizualizálása céljából. A fok (D) és a centralitás (központosság központosság, CB; közelség központ, CC és fok centralitás, CD) értékeit a Cytoscape integrált hálózati elemző moduljával vontuk ki.

Differenciálcsatlakozási hálózati elemzés.

SI anyagok és módszerek

Differenciálcsatlakozási hálózati elemzés.

Az emberi dorsolaterális prefrontális kéreg génexpressziós adatait a Stanley Medical Research Institute-ból (https://www.stanleygenomics.org; Tadafumi Kato, Riken Brain Science Institute, Wako, Saitama, Japán) jóvoltából töltöttük le. A humán U133A Affymetrix GeneChip tömbök szondaintenzitásának adatait R-be (www.R-project.org) olvastuk be közvetlenül az CEL fájlokból az affy csomag (55) segítségével, és a korábban leírt módszerekkel dolgoztuk fel (56). A DCNA-t az expressziós adatokon hajtottuk végre Fuller és mtsai. (30) Röviden, a szomszédsági mátrixokat szerkesztettük és beolvastuk az R programozási környezetbe, és a WGCNA csomaggal elemeztük (57). Az adjacencia mátrixokat normalizálták és átalakították, hogy hasonlítsanak a súlyozott skálamentes hálózati topológiára Zhang és Horvath szerint (58). A transzformáció után minden alanycsoportra (minden alany, csak skizofrénia és csak kontroll alanyok) topológiai átfedési mátrixokat (TOM) generáltunk, amelyek meghatározzák az egyes gének hálózati távolságát.

A hálózati modulok azonosításához a TOM-okat diszimaritás-mátrixokká alakították át. Ezt követően hierarchikus klaszterezést és modulazonosítást hajtottak végre a dynamicTreeCut algoritmussal (59), amely a klaszterbontás és kombináció adaptív folyamatán alapul; addig folytatták a folyamatot, amíg a klaszterek száma stabil nem vált.

A skizofrénia és a kontrollhálózatok összehasonlítását úgy végeztük, hogy kiszámítottuk a differenciál kapcsolódási értékeket (DiffK) minden egyes gén esetében a skizofrénia és a kontrollfeltételek között. Az i gén DiffK-ját a D i f f K i = K c o n (i) - K s z képlet adja meg, ahol K (i) = k (i) m a x (k). Itt k (i) az i gén kapcsolati mértékét jelenti, és max (k) a maximális hálózati kapcsolatot.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük P.V. Gejman fogalmi tanácsért. Ezt a munkát az NIH Nemzeti Mentális Egészségügyi Intézete (NIMH) támogatta: MH071316 és MH097216 (PP-hez), MH071616 és MH084803 (LW és JGC-hez) és R21MH102685 (JD-hez) és egy Svájci Nemzeti Tudományos Alapítvány (SNSF) Early Postdoc Mobilitási ösztöndíj (MPF-hez).

Lábjegyzetek

↵ 1 Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: p-penzesnorthwestern.edu .

Szerző közreműködései: K.D.B., B.D.-C., L.W., J.G.C., J.D. és P.P. tervezett kutatás; K.D.B., B.D.-C., B.S. és M.D.M.-d.-S. végzett kutatás; K.D.B., B.D.-C., M.P.F., B.S., A.P.B. és M.D.M.-d.-S. elemzett adatok; és K.D.B., M.P.F. és P.P. írta a lap.

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.