Növényekben a fitohormonok, fitotoxinok és illékony szerves vegyületek egyidejű elemzése

Közreműködött: James H. Tumlinson III, 2003. június 12

fitohormonok

Kapcsolódó cikk

Absztrakt

A fitohormonok számos szempontból szabályozzák a növények növekedését, fejlődését és a stresszre adott reakciókat. Történelmileg a fitohormon jeleket vizsgálták, mint az ingerre adott reakciót közvetítő egyéni utakat. A fitohormonok mára felismerték, hogy komplex jelátviteli hálózatokban működnek, gyakran interaktív hatásokkal, amelyeket áthallásnak neveznek, a növény stresszre adott válaszainak kifejeződésére, mint például aszály, sebesülés vagy rovar és kórokozó támadása (1-3). Pozitív és negatív kölcsönhatásokat írtak le a kémiai és molekuláris válaszok expresszióján a jázmonsav (JA) -etilén (E) (4-6), a szalicilsav (SA) -E (7-9) és az SA-JA ( 10-12). Mostanra bebizonyosodott, hogy a JA, az SA és az E összehangolt kölcsönhatásai kontrollálják a növény válaszait a biotikus stressz után (13). Hasonlóképpen, a fitohormon kölcsönhatások komplex szekvenciáit írták le farmakológiai kezelések és kórokozó fertőzés után (14, 15). A fitohormon szignál kölcsönhatások hálózatait bemutató legújabb munkák fokozott érdeklődést mutatnak a többkomponensű fitohormon elemzések kidolgozása és felhasználása iránt ezeknek a kölcsönhatásoknak a tisztázására.

Az egyik jel szintézisében vagy észlelésében bekövetkező változások befolyásolhatják a nem célzott jelek dinamikáját. Például az E termelésben vagy az észlelésben hiányos paradicsomnövények nem mutathatták ki a klorózis és a nekrózis tipikus mintázatait a Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (9). Megállapították, hogy a tipikus kiterjesztett sejthalál-válaszokért felelős patogén által kiváltott SA-akkumuláció E-függő (9). A Xanthomonas campestris pv. a campestris, Arabidopsis szintén kooperatív E és SA hatást mutat a betegség tüneteinek kialakulásában; az események sorrendje azonban ellentétes a paradicsommal (10). Az exogén citokininekre érzéketlen szignáltranszdukciós mutánsok után kutatva a jelölt génekről kiderült, hogy allélok az EIN2-re, az E-válasz útvonalban található génre (16). A citokinin alkalmazása stimulálja az E-termelést az 1-aminociklopropán-1-karboxilát-szintáz fehérjék stabilitásának növelésével (17). A cukorjelzés a fitohormon bioszintézis szintjén is hat. A GLUCOSE INSENSITIVE1 közelmúltbeli klónozása során kiderült, hogy az abszcizinsav (ABA) bioszintetikus útja összefügg a glükóz érzékelésével (18).

Anyagok és metódusok

Növényi, rovar- és kórokozóanyag. A kukorica (Zea mays cv. Delprim), a dohány (Nicotiana tabacum cv. Samsun-NN), a paradicsom (Lycopersicon esculentum cv. Luckulus) és az Arabidopsis thaliana cv. Columbia (Col-0) -ról számoltak be (7, 8, 29, 30). A növényevő kísérletben felhasznált korai harmadik stádiumú kukoricafülű (CEW) lárvákat (Helicoverpazea) W. J. Lewistól (az Egyesült Államok Mezőgazdasági-Agrárkutatási Szolgálata, Tifton, GA) szereztük be. A Pseudomonas syringae pv. paradicsom DC3000 (Pst) és Arabidopsis növények fertőzését írták le (8).

Vegyszerek. Indol, β-kariofillén, α-humulén, benzoesav (BA), BA metil-észter (ME), SA, SA-ME, transz-fahéjsav (CA), CA-ME, JA, JA-ME, IAA, IAA -ME-t és az ABA-t Aldrichtől vagy Sigmától szerezték be. A Dihydro-JA (dhJA) ME-t (Bedoukian Research, Danbury, CT) lúgos hidrolízisnek vetettük alá, hogy dhJA-t nyerjünk. Az N-jázmonoil-l-leucint (JALeu), az N-indanoil-l-izoleucint (I-Ile) és a COR-t szintetizáltuk és tisztítottuk bevett módszerekkel (31-33). Az izotóppal jelzett belső standardokat, köztük a [2H5] IAA-t, [2H6] SA-t és [2H5] CA-t a CDN izotópoktól (Pointe-Claire, QC, Kanada) vásároltuk; [13 C6] BA-t és [2 H6] ABA-t az ICON izotópoktól (Summit, NJ) vásárolták.

Minta előkészítés. A növényi szöveteket lefagyasztották és folyékony N2-ben őrölték; Mindegyik mintából 200 mg-ot 2 ml csavaros kupakkal ellátott FastPrep csövekbe (Qbiogene, Carlsbad, CA) vittünk át, amelyek 1 g Zirmil gyöngyöt (1,1 mm; SEPR Ceramic Beads and Powders, Mountainside, NJ) tartalmaztak. dhJA-t és izotóppal jelzett belső standardokat (egyenként 100 ng 5 μl EtOH-ban) adtunk a 2 ml-es csövekhez a minta hozzáadása előtt. A mintákat 300 μl 1-propanol/H2O/tömény sósavval (2: 1: 0,002, térfogat/térfogat) kevertük, és 30 másodpercig rázattuk FastPrep FP 120 szövethomogenizátorban (Qbiogene). Minden mintához metilén-kloridot (1 ml) adunk, majd 5 másodpercig újrázzuk a homogenizátorban, és 11 300 x g-vel 30 másodpercig centrifugáljuk. Az alsó metilén-klorid/1-propanol réteget ezután egy 4 ml-es üveg csavaros kupakú fiolába vittük. A karbonsavakat 2 μl 2,0 M trimetil-szilil-diazo-metán hexánban (Aldrich) hozzáadásával ME-vé alakították. Az üvegeket ezután lezártuk, és szobahőmérsékleten 30 percig hagytuk ülni. A felesleges trimetil-szilil-diazo-metánt ezután megsemmisítettük úgy, hogy mindegyik mintához 2 μl 2,0 M ecetsavat adtunk hexánban.

Az illékony metabolitokat az általunk gőzfázisú extrakciónak (VPE) nevezett eljárással választottuk el a komplex keveréktől. A teflonnal bélelt sapkákat nyitott tetejű sapkákra cserélték, amelyekre Thermogreen septa (11 mm; Supelco) volt felszerelve. ~ 20 mg SuperQ-t (Alltech Associates) tartalmazó inert szűrőcsapdát (29) helyeztek a septumon keresztül egy 22-es méretű, alacsony nyomású N2-áramot hordozó tűvel együtt. A csapdán át 500 ml · min -1 N2 áramlási sebességet Tygon vákuumvezetékkel és membrános vákuumszivattyúval (KNF Neuberger, Trenton, NJ) tűszeleppel és áramlásmérővel kalibráltuk. Az injekciós üvegeket 70 ° C-os alumínium fűtőtömbbe helyeztük, amíg az összes oldószer elpárolog és át nem mozdul a rendszeren. A száraz fiolát ezután egy második melegítőtömbbe helyeztük 200 ° C-on 2 percig. Ezekre az emelkedett hőmérsékletekre volt szükség a kevésbé illékony vegyületek visszanyerésének elősegítéséhez. A befogott illékony anyagokat ezután 150 μl metilén-kloriddal eluáltuk, és GC-MS-sel elemeztük. A SuperQ csapdákat nem sértették, és közvetlenül minden újrafelhasználás előtt 200 μl metilén-kloriddal öblítették.

12 szintetikus analitika visszanyerése és mennyiségi meghatározása VPE-vel belső és külső szabványok felhasználásával. A teljes gyógyulást (•) úgy számítottuk, hogy növényi szövetmintákhoz (200 mg) 0, 10, 25, 50, 100 vagy 150 ng következő VOC-t és szabad karbonsavakat adtunk. (A-1) BA (y = 0,84x). (B-2) SA (y = 0,50x). (C-3) Indol (y = 0,93x). (D-4) CA (y = 0,90x). (E-5) β-karifilén (β-kocsi; y = 0,99x). (F-6) a-Humulene (a-hum; y = 1,01x). (G-7) JA (y = 0,80x). (H-8) IAA (y = 0,86x). (I-9) ABA (y = 0,68x). (J-10) JA-Leu (y = 0,53x). (K-11) I-Ile (y = 0,34x). (L-12) COR (y = 0,57x). A minta előkészítése a leírt VPE protokollt követte (lásd: Anyagok és módszerek), és az [M + H] + m/z MS válaszokat összehasonlítottuk az egyes VOC és karbonsav ME esetén előállított külső standard görbék meredekségével. Kereskedelemben kapható belső standardok alkalmazásával a BA (A-1, y = 0,96x), SA (B-2, y = 0,96x), CA (D-4, y = 0,99x), JA (G-7, y = 1,00x), IAA (H-8, y = 0,99x) és ABA (I-9, y = 0,99x), elkészült egy második becslés a helyreállításra (○), amely számítási szempontból korrigálódott a veszteségekkel szemben. A meredekségek (y), a korrelációs együtthatók (mindegyik r 2 ≥ 0,97) és a hibasávok (átlag ± SEM, n = 4, ábrák által eltakart) jelzik a módszer helyreállítását, pontosságát és reprodukálhatóságát az egyes analitok esetében.

(A) Növényi mátrix háttéren a VOC-k és a karbonsav-ME-k belső és külső standardjainak kiválasztott ion-kromatogramjai (a fekete háttéren lévő fehér számok izotóppal jelzett vegyületeket jelölnek): 1, [13 C6] BA-ME; 2, [2H4] SA-ME; 3, indol; 4, [2H5] CA-ME; 5, p-kariofillén; 6, a-humulén; 7, dhJA-ME; 8, [2H5] IAA-ME; 9, [2H6] ABA-ME; 10, JA-Leu-ME; 11, I-Ile-ME; és 12., COR-ME. (B-E) Az endogén analitikák arányosan skálázott, egyionos kromatogramjai Pst-fertőzött Arabidopsis (B), CEW növényi kukorica (C), sebzett dohány (D) és aszály által megterhelt paradicsom (E) esetében. Megerősített és számszerűsített endogén vegyületek a következők: 1, BA-ME; 2, SA-ME; 3, indol; 4, CA-ME; 5, kariofillén; 7, JA-ME; 8, IAA-ME; 9. ABA-ME; és 12., COR-ME. A másodlagos metabolitok jelenléte miatt a fitohormonok vizuálisan kisebb alkotóelemekként jelennek meg; JA, IAA és ABA kiterjesztett egyionos kromatogramjainak példáit dohányban és paradicsomban szemléltetjük (D és E betétek). Az x tengely a GC retenciós időket és az [M + H] + m/z ionokat jelöli, amelyeket a belső standardok (fekete háttér) és a natív analitok (fehér háttér) mennyiségi meghatározásához használnak. Az y tengely a relatív ionintenzitás (%).

A 12 jelöletlen tesztvegyület visszanyerését először a kiválasztott ionok csúcsterülete és tiszta szintetikus VOC-kból és karbonsav-ME-kből felépített külső standard görbe meredeksége alapján számoltuk ki. A kezeletlen kukorica levélszövetet (200 mg) a három VOC-ból és kilenc szabad savból (n = 4) 0, 10, 25, 50, 100 és 150 ng-mal egészítettük ki, és a fenti protokoll alkalmazásával készítettük. A [13 C6] BA, [2 H6] SA, [2 H5] CA, dhJA, [2 H5] IAA és [2 H6] ABA felhasználásával belső standardként egy második helyreállítási becslést végeztünk BA, SA, CA, JA, IAA és ABA. A kukorica szövetmintákhoz hozzáadtunk 0, 10, 25, 50, 75 és 100 ng-ot e hat jelöletlen szabad savból (n = 4) és 100 ng-t a megfelelő belső standardokból szabad savakként.

Az elemző megerősítése. A kiválasztott mintákon és hiteles standardokon a strukturális megerősítést GC-MS/MS alkalmazásával végeztük metanolos kémiai ionizációval (Trace GC 2000 egy GCQ tömegspektrométerhez csatlakoztatva, Thermo Finnigan, San Jose, Kalifornia). A GC és az MS feltételei a (28, 29) leírás szerint, az alábbi módosításokkal. Az összes érdeklődésre számot tartó komponenst 0,53 másodperces letapogatási idő, három mikropásztázás és 25 ms maximális ionizációs idő alkalmazásával elemeztük. A szülő-ion szelekciót szakaszonként kapcsoltuk, minden egyes szülőionra ± 2 tömegegységgel rendelkező izolációs ablakkal és 8 ms izolációs idővel. Az ionforrás hőmérséklete, ütközési energiája, fő rádiófrekvenciás feszültsége és ütközési ideje 200 ° C, 2,0 V, 0,450 V, illetve 30 ms volt.

Eredmények és vita

Analiták visszanyerése és elemzése. A módszer magas szintű visszanyerést, reprodukálhatóságot és linearitást eredményezett 12 tesztvegyület mennyiségi meghatározásában (1. ábra). Növényi kivonatokból az összes természetesen előforduló analitist 50% -os vagy annál nagyobb hatékonysággal nyertük ki. A legalacsonyabb talált visszanyerés (30%) az I-Ile szintetikus kiváltószer volt (1K ábra). A növényi kivonatokba bekötött szabad savak visszanyerése a karbonsav-ME-k szelektált ionfigyelő külső standard görbéinek meredekségén alapult, és ezért konzervatív becslés. A várakozásoknak megfelelően a nagyobb tömegű, alacsonyabb volatilitású analitikák, például az ABA-ME és a COR-ME gyógyulása csökkent (1. ábra I-L). A VOC-k, például az indol, a β-kariofillén és az α-humulén visszanyerése közel 100% (1. ábra C, E és F). Az izotópos és telített belső standardok használata számítással korrigálva a BA, SA, CA, JA, IAA és ABA tökéletlen helyreállításához (1. ábra A, B, D és G-I). Fontos, hogy a VPE technika nagyfokú reprodukálhatóságot és linearitást mutatott az összes korrelációs együtthatóval (r 2)> 0,97 (1. ábra).

A Pst fertőzés a COR felhalmozódását és széleskörű változásokat eredményez.

Az Arabidopsis Pst-vel történő fertőzése az idők során nagy mértékű profilváltozásokat eredményez. A bemutatott átlagos (± SEM, n = 3) BA, SA, JA, IAA, ABA és COR (AF, ill.) Szöveti szint (ng/g FW) a kontroll (○) és a Pst-fertőzött (•) levélszövet . A csillagok a 0 idő kontroll fölötti szignifikáns növekedést jelzik (P 0,09). Ennek az eredménynek megfelelően az Arabidopsis növények alacsonyabb szintű víz-stressz által indukált géneket fejeztek ki, amikor Pieris rapae hernyók támadták meg, csak a mechanikus sebzéshez képest (53).

A CEW növényevő a JA és az illékony metabolitok szintjét indukálja, de csökkenti az IAA-t. (A) A kukoricanövények átlagos (+ SEM, n = 5) BA, SA, JA, IAA és ABA szintje (ng/g FW) 18 órával a növényevő növények megkezdése után. (B) A COC növényevő által kiváltott VOC-k (μg/g FW), indol (Ind) és kariofillén (Car) átlagos szintje. A csillagok jelentős különbségeket jelölnek a kezelések között (P 0.10) (60). A JA által okozott károsodás gyors és átmeneti, mégis szignifikáns 1,8-szoros növekedést észlelnek 6 óra múlva (5A. Ábra). A sebek által kiváltott JA-szintek közvetítik a proteáz-inhibitorok és a nikotin növekedését, ami viszont csökkenti a szövetek tápláló értékét a növényevők számára (34, 62). Solanaceus növényekben az ABA sebek okozta növekedése és az IAA csökkenése 24 óra elteltével hangsúlyosabbá válik (52, 63), de ezeket a mintákat az ABA 1,4-szeresének és az IAA 1,9-szeresének 6 órán belüli csökkenésével igazolták 5A. Ábra). A dohányban a sebzés után csökkent IAA-szintet írtak le, amely antagonizmust sugall a JA és az IAA jelek között. Ezek az interakciók azonban továbbra sem tisztázottak (34, 52, 64).

A sebzés növeli a JA és az ABA értékét, de csökkenti a dohány IAA szintjét, míg az aszályos stressz szelektíven növeli a paradicsom ABA szintjét. Átlagos (+ SEM, n = 4) BA, SA, JA, IAA és ABA szint (ng/g FW) a dohánylevelekben 6 órával a kezelés után (A) és a paradicsomlevelekben (B). A cserepes növényeket aszály okozta vízvisszatartás mellett 48 óra elteltével betakarított levélszövet mutatta, amely a csökkent turgor korai vizuális tüneteit mutatta. A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek a kezelések között (P 0,06). Az ABA befolyásolja a növényi vízháztartás szabályozását, és összefüggésbe hozható a sztóma apertúra csökkenésével és a génexpresszió indukciójával, amely az ozmoprotektorok és a károsodás-elhárítással kapcsolatos fehérjék szintéziséhez vezet (67, 68).

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük az értékelőknek a hasznos tanácsokat, amelyek jelentősen javították a kéziratot. Ezt a munkát az Egyesült Államok Mezőgazdasági-Agrárkutatási Szolgálatának és a Védelmi Haladó Kutatási Projekt Ügynökség pénzeszközeivel támogatták.

Lábjegyzetek

↵ † Kihez kell címezni a levelezést. E-mail: eschmelzgainesville.usda.ufl.edu .

Rövidítések: ABA, abszcizinsav; BA, benzoesav; CA, transz-fahéjsav; CEW, kukorica fülesféreg; COR, koronatin; dhJA, dihidro-JA; E, etilén; FW, friss súly; I-Ile, N-indanoil-1-izoleucin; IAA, indol-3-ecetsav; JA, jázmonsav; JA-Leu, N-jázmonoil-1-leucin; ME, metil-észter; Pst, Pseudomonas syringae pv. paradicsom DC3000; SA, szalicilsav; VOC-ok, illékony szerves vegyületek; VPE, gőzfázisú extrakció.