Határok a farmakológiában

Emésztőrendszeri és májfarmakológia

Szerkesztette
Raffaele Capasso

Nápolyi Egyetem, Federico II, Olaszország

Felülvizsgálta
Kazuo Nakamoto

Kobe Gakuin Egyetem, Japán

Erica Novo

Torinói Egyetem, Olaszország

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

matrine

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Lipidbiológiai és anyagcsere-betegségek laboratóriuma, Egészségügyi és Orvostudományi Kar, RMIT Egyetem, Melbourne, VIC, Ausztrália
  • 2 Biotechnológiai és Egészségtudományi Iskola, Wuyi Egyetem, Jiangmen, Kína

Bevezetés

Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) a leggyakoribb krónikus májbetegség, 25% -os gyakorisággal a felnőtteknél világszerte. Ez a metabolikus májbetegség a tünetmentes egyszerű zsírmájtól (vagy a májban a trigliceridek túlzott felhalmozódása miatt kialakuló hepatosteatózistól) a májcirrhosis vagy funkcionális elégtelenség visszafordíthatatlan végső szakaszáig terjed (Rinella, 2015; Friedman et al., 2018). Az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) kritikus szakasz az egyszerű hepatosteatosis korai és reverzibilis stádiumától a súlyos májkárosodás és fibrózis felé vezető progresszióban, amely bármilyen kezeléssel visszafordíthatatlanná válik. Ezenkívül a sérült hepatociták folyamatos javulása a NASH progressziója alatt kiválthatja a hepatocellularis carcinoma kialakulását, amely szintén a NAFLD másik végstádiuma (Diehl and Day, 2017). Ezért fontos a NASH hatékony kezelése, hogy megakadályozzuk vagy késleltessük a NAFLD romlását a gyógyíthatatlan magzati stádiumokig.

Az alkoholmentes steatohepatitist máj steatosis, sérülés (a keringésben megemelkedett májenzimek), gyulladás és változó fokú fibrózis jellemzi (Diehl és Day, 2017). Valójában a NASH hatékony kezeléséhez a gyógyszereknek terápiás hatékonysággal kell rendelkezniük ezeken a kulcsfontosságú végpont-patológiákon: nevezetesen metabolikus stressz (amelyet a hepatosteatosis enyhülése jelez), gyulladás és fibrózis a májban (Diehl and Day, 2017). Jelenleg a legtöbb NASH kezelésére szolgáló vizsgálati gyógyszer egy kijelölt sejtcélból indul ki, ilyen a PPARα/δ, PPARα/γ, FXR, CCR2/5, SCD-1, ASK-1, ACC, kaszpáz inhibitor, THR-β vagy egy néhányuk kombinációja (Friedman et al., 2018). A hatalmas erőfeszítések ellenére még mindig nincs jóváhagyott gyógyszer kifejezetten a NASH kezelésére (Diehl és Day, 2017).

Ma már széles körben elismert tény, hogy a NASH az egyszerű hepatosteatosis (első „találat”) kivételével több tényezőből (vagy „találatból”) származhat (Tilg és Moschen, 2010). Ezenkívül a több találat heterogén a különböző betegek között, és eltérő módon jelenhet meg a NASH patogenezisében (Suzuki és Diehl, 2017). Annak érdekében, hogy leküzdjük a NASH, mint kiindulási pont egy adott cellahelyzetének megcélzását, és a biztonsági információk ismeretének hiánya, átfogó megközelítést alkalmaztunk (Turner és mtsai., 2016), és a matrint potenciális új gyógyszerként azonosítottuk. a metabolikus stresszre, gyulladásra és fibrózisra vonatkozó jelentett hatásai alapján (Diehl és Day, 2017).

A matrint (Mtr, más néven Kushen alkaloid) eredetileg a növénytől izolálják Sophora flavescens (Cheng és mtsai., 2006), és hepatoprotektív gyógyszerként használták Kínában, minimális káros hatással (Liu és mtsai, 2003). Beszámoltak arról, hogy ez a kis molekulájú gyógyszer (MW: 248) gátolja a gyulladást (Zhang és mtsai, 2011; Sun és mtsai, 2016). Ezenkívül kimutatták, hogy a matrin védelmet nyújt a májkárosodás ellen egy ischaemia-reperfúziós patkány modellben (Zhu és mtsai., 2002). Újabban laboratóriumi tanulmányaink bizonyították terápiás hatékonyságát a magas zsírtartalmú étrendből vagy a magas fruktóztartalmú étrendből származó hepatosteatosis kiküszöbölésében egerekben (Zeng et al., 2015; Mahzari et al., 2018). Fontos, hogy ezek a terápiás hatások úgy tűnik, hogy magukban foglalják a hősokk-fehérje (HSP) útvonalát, de nem azok az általánosan elismert sejtcélok, mint a PPARα, a PPARγ vagy az AMPK (Zeng et al., 2015; Mahzari et al., 2018). E két egérmodellből azonban hiányoznak a májgyulladás és a fibrózis fenotípusai, hogy értékelni tudjuk terápiás hatásait a NASH-ra (Friedman et al., 2018).

Ezért a jelen tanulmány célja a matrin májkárosodásra, gyulladásra és fibrózisra gyakorolt ​​hatásainak értékelése volt, amelyet a metionin-kolinhiányos (MCD) étrend váltott ki, a NASH jól meghatározott modellje (Diehl and Day, 2017). Az érintett mechanizmust tovább vizsgáltuk a HSP útvonalában bekövetkező változások vizsgálatával, és összehasonlítással a metformin, egy antidiabetikus gyógyszer által termelt változásokkal, amelyről azt feltételezték, hogy előnyös a NASH számára (Clarke és mtsai, 2015).

Anyagok és metódusok

Állatgondozás és kísérleti tervezés

Hím C57BL/6J egereket (10 hetesek) vásároltunk, és legalább 1 hétig akklimatizálódtunk. Az egereket véletlenszerűen négy csoportba soroltuk: etetés ad libitum standard chow-étrenddel (CH-Con; Gordon's Specialty Stock Feeds, Yanderra, NSW, Ausztrália); Önmagában MCD (MCD-Con); MCD élelmiszer-adalékként matrin kezeléssel (MCD-Mtr; Mtr: 100 mg/kg/nap); és MCD, metformin kezeléssel, mint élelmiszer-adalékanyag (MCD-Met; Met: 250 mg/kg/nap) 6 hétig. A matrin és a metformin dózisát korábbi publikációink alapján vettük alapul (Zeng et al., 2015; Mahzari et al., 2018). A Matrine (tisztaság> 99,5%) Li-Hong Hu professzor ajándéka volt a Sanghaji Materia Medica Intézetből (Kína), a metformint pedig a Sigma-Aldrich (Ausztrália) cégtől vásárolták. A gyógyszerporokat -20 ° C-on tároltuk, majd súlyoztuk és minden nap gondosan összekevertük az étrenddel. Minden kísérletet az RMIT Egyetem Állatetikai Bizottsága (# 1415) hagyott jóvá az Ausztrál Országos Egészségügyi és Orvosi Kutatási Tanács iránymutatásainak megfelelően.

Anyagcsere értékelések

A testtömeget és az ételbevitelt naponta ellenőriztük a kísérlet során. A vizsgálat megkezdése előtt és 5 hét múlva, 5–7 órás ételtávolítás után, farokvénás vért gyűjtöttünk a glükózméréshez glükométerrel (Accu-Check II; Roche, Castle Hill, Perth, Ausztrália). A vizsgálat megkezdése előtt és a vizsgálat végén a plazmát összegyűjtötték és -80 ° C-on tárolták a későbbi biokémiai vizsgálatokhoz. Az egereket ketamin/xilazin keverékkel (legfeljebb 100 mg/testtömeg-kg ketamin és 20 mg/testtömeg-kg xilazin) altattuk intraperitoneális injekció formájában. Az egerek rögzítését ezután transzkardiális perfúzióval heparinizált foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS; 10–20 ml/egér), majd 4% paraformaldehiddel (PFA; 10–20 ml/egér; # C007, ProSciTech) végeztük. A PFA perfúzió befejeztével a máj jobb lebenyét boncoltuk és 4% PFA-val töltött szcintillációs fiolába merítettük további elemzés céljából.

A testzsírösszetétel és a máj trigliceridtartalmának meghatározása

Az egerek teljes testzsírtartalmát az EchoMRI TM -100H testösszetétel-analizátorral (EchoMRI) értékeltük. Az ártalmatlan és nem invazív elemzés során az egereket élőben visszatartottuk egy csőben. Az egész testzsír-összetétel mérésének elve az EchoMRI TM -100H alkalmazásával a mágneses rezonancia képalkotás (MRI) technikáján alapult, amely az élő testösszetételt, például zsírszövetet, sovány szövetet és szabad folyadékot mérte. A hepatosteatózist a máj TG-tartalmának mérésével határoztuk meg Folch módszerével és egy kolorimetrikus vizsgálati készlet alkalmazásával (Triglyceride GPO-PAP; Roche, Castle Hill, NSW, Ausztrália), a korábban leírtak szerint (Ren et al., 2012).

A májkárosodásra gyakorolt ​​hatás értékelése

A máj RNS valós idejű polimeráz láncreakciója

A teljes RNS-t az egérmájokból izoláltuk TRIzol-reagenssel (Invitrogen, # 15596026), a korábban leírtak szerint (Zeng et al., 2012). A valós idejű PCR-t az IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc., Egyesült Államok) alkalmazásával hajtottuk végre az érdekes gének esetében. A célgén expresszióját a háztartási génre (18S) normalizáltuk. A 18S primer szekvenciája (5 '- 3') a CGC CGCTAGAGGTGAAATTCT (értelmes) és a CGAACCTCCGACTTTCGTTCT (antiszensz); TNFa: CACAAGATGCTGGGACAGTGA (érzék) és TCCTTGATGGTGGTGCATGA (antiszensz); IL-1β: CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG (érzék) és GATCCACACTCTCCAGCTGCA (antiszensz); CD68: TGACCTGCTCTCTCTAAGGCTACA (érzék) és TCACGGTTGCAAGAGAAACATG (antiszensz); 1. kollagén: CTGCTGGTGAGAGAGGTGAAC (érzék) és ACCAAGGTCTCCAGGAACAC (antiszensz).

Western Blotting

A májlizátumokat SDS-PAGE-val választottuk el és specifikus antitestekkel immunblotolták (Chan és mtsai., 2013). Az antitesteket 1: 500 arányban (HSF1, HSP72 és HSP90 esetében) vagy 1: 1000 arányban (más antitestek esetén) 1% BSA-t, 0,02% nátrium-azidot és 0,0025% fenolvörösöt tartalmazó TBST pufferral hígítottuk (Sigma-Aldrich, Ausztrália). A HSP72 és HSP90 antitesteket az Enzo Life Sciences-től (Farmingdale, Egyesült Államok) szereztük be; MCP-1, HSF1, TGFβ, Smad3, emlős rapamicin célpont (mTOR), foszfo Ser2448 mTOR, α-Tubulin és GAPDH a Cell Signaling cégtől (Danvers, MA, Egyesült Államok) vásároltuk. A 3-at (NLPR3) tartalmazó bólintásszerű receptor-pirint az AdipoGen-től (San Diego, Egyesült Államok) vásároltuk. Kecske ellen egér, kecske nyúl és kecske patkány Santa Cruzból (Egyesült Államok). A fehérjéket ChemiDoc alkalmazásával számszerűsítettük, és a denzitometriás elemzést Image Lab szoftverrel (Bio-Rad Laboratories, Ausztrália) végeztük.

A májmetszetek szövettani értékelése

A májmintákat PFA alkalmazásával perfundáltuk és 5 μm-es szeletekre szeleteltük. A szabadon lebegő szakaszokat picrosirius vörös színnel festették a májfibrózis miatt, majd állatonként öt, egymást nem átfedő látómezőben számszerűsítették egy Olympus BX41 mikroszkóppal 20 × objektíves lencsével és egy Olympus DP72 digitális fényképezőgéppel (Olympus, Ausztrália) ( Witek és mtsai, 2009; Li és mtsai, 2016). Az átlagértéket minden kísérleti csoportra kiszámoltuk az ImageJ szoftvercsomag küszöbfüggvényével (NIH, Bethesda, MD, Egyesült Államok). Az adatokat mezőnként a pozitív terület százalékában (%) képviseljük. A statisztikai szignifikancia megszerzéséhez tárgylemezenként legalább öt véletlenszerű mezőt készítettünk, és csoportonként legalább hét egeret pontoztunk (n = 7).

Statisztikai analízis

Valamennyi eredmény átlag ± SEM értékként jelenik meg. Az egyirányú varianciaanalízist alkalmaztuk a statisztikai szignifikancia értékelésére az összes csoportban. Amikor jelentős különbségeket találtak, a Tukey-Kramer többszörös összehasonlításokat post hoc tesztet használtunk a csoportok közötti különbségek megállapítására. Különbségek itt: o ∗ o ∗∗ o † o ∗ o † o †† o ∗ o † o †† o ∗∗ o †† o ∗ o ∗∗ o † o †† o ∗ o † o †† o Kulcsszavak: matrin, NASH, gyulladás, fibrózis, HSP72, mTOR, metionin-kolinhiányos étrend

Idézet: Mahzari A, Li S, Zhou X, Li D, Fouda S, Alhomrani M, Alzahrani W, Robinson SR és Ye JM (2019) A Matrine megvédi a NASH MCD által kiváltott fejlõdését a HSP72 szabályozásával és az mTOR csökkentõ szabályozásával, modellezõen megkülönböztetõ módon Metforminból. Elülső. Pharmacol. 10: 405. doi: 10.3389/fphar.2019.00405

Beérkezett: 2018. november 03 .; Elfogadva: 2019. április 01 .;
Publikálva: 2019. április 24.

Raffaele Capasso, a Nápolyi Egyetem Federico II, Olaszország

Kazuo Nakamoto, Kobe Gakuin Egyetem, Japán
Erica Novo, Torinói Egyetem, Olaszország