A glükolipotoxicitás által gátolt miR-299-5p szabályozza a hasnyálmirigy β-sejtek működését és túlélését

Q.H., W.Y. és Y.L. hozzájárult ehhez a cikkhez.

Cikk ábrák és táblázatok

Ábrák

miRNS expresszió primer humán szigeteken, palmitáttal vagy anélkül inkubálva. V: Az emberi szigeteket (H-szigetek) 0,5 mmol/l palmitáttal vagy anélkül 48 órán át inkubáltuk, amikor qRT-PCR-t hajtottunk végre az érdeklődésre számot tartó miRNS-ek expressziós szintjének vizsgálatára. B: Szigeteket izoláltunk db/db egerekből (M-szigetek) és azok alomtárs-kontrolljaiból, és qRT-PCR-t hajtottunk végre az érdeklődő miRNS-ek expressziós szintjének vizsgálatára. C: Az INS-1 sejteket 0,25 mmol/l palmitáttal vagy anélkül inkubáltuk 24 órán át, amikor qRT-PCR-t hajtottunk végre a miRNS-ek érdeklődésének szintjének vizsgálatára. * P

Különösen differenciáltan expresszált miRNS-ek befolyásolják a β-sejtek működését és a túlélést. V: A palmitáttal vagy anélkül inkubált humán szigetek miRNS mikroarray profiljaiból érdeklődő, differenciálisan expresszált miRNS-ek hőtérképe. A piros és a zöld a megnövekedett és csökkent gén expressziós szintet jelzi. miR-34a-t vettünk pozitív kontrollként. B és D: Az oligonukleotid duplexeket, amelyek megfelelnek a kérdéses érett upregulált miRNS-eknek, valamint a miR-34a-t 48 órán át transzfektáltuk β-TC-6 sejtekbe, majd az inzulin szekréciót és az inzulin tartalmat GSIS assay-vel értékeltük. C és E: Az anti-miRNS molekulákat, amelyek specifikusan gátolják az érdeklődés alá tartozó, szabályozott miRNS-eket, 48 órán át transzfektáltuk β-TC-6 sejtekbe, amikor az inzulin szekréciót és az inzulin tartalmat GSIS assay-vel értékeltük. F és G: Az oligonukleotid duplexeket, amelyek megfelelnek az érdeklődő érett, felregulált miRNS-eknek, valamint a miR-34a-nak és az anti-miRNS molekulákat, amelyek specifikusan gátolják az érdeklődésre számot tartó, szabályozott miRNS-eket, 72 órán át transzfektáltuk β-TC-6 sejtekbe, a sejtek életképességét CCK-8 vizsgálattal értékeltük. H és I: Azokat, amelyek szignifikánsan befolyásolták a β-TC-6 sejtek életképességét, Hoechst 33342 festésre és piknotikus magszámlálásra választottuk ki. * P

A miR-299-5p csökkentése ex vivo és in vitro glükolipotoxicitással. V: A miR-299-5p expresszióját a 8-12 hetes db/db egerek szigetein és az életkoruknak megfelelő kontrollokat qRT-PCR-rel mértük. * P

A miR-299-5p gátlás károsítja a β-sejtek működését. A és B: Az anti-nc vagy anti-miR-299-5p-t 24 órán át primer egérszigetekbe (M-szigetek) transzfektáltuk, majd az elsődleges egérszigetek (M-szigetek) inzulinszekrécióját és inzulin tartalmát GSIS-sel elemeztük. próba. C és D: Az anti-nc vagy anti-miR-299-5p-t különböző dózisokban 12 órán át MIN6 sejtekbe transzfektáltuk, majd az inzulin szekrécióját és az inzulin tartalmát GSIS vizsgálattal elemeztük. E és F: A MIN6 sejteket nc-vel vagy miR-299-5p-vel transzfektáltuk 24 órán át, majd 24 órán át magas glükóz- és palmitát-kezeléssel, majd elemeztük az inzulin szekrécióját és az inzulin tartalmát. * P

A miR-299-5p expressziójának leütése β-sejt apoptózist eredményez. V: A MIN6 sejteket anti-nc vagy anti-miR-299-5p-vel transzfektáltuk 72 órán át, amikor DNS-létrás vizsgálatot végeztek. B: A PARP1-et, a hasított PARP1-et és a β-tubulin szintet 24 és 48 órán keresztül anti-nc vagy anti-miR-299-5p-vel transzfektált MIN6 sejtekben elemeztük Western-blottolással. C és D: Anti-nc vagy anti-miR-299-5p-t transzfektáltunk a primer Sprague Dawley patkány szigetekbe (R-szigetek). 48, 72, 96 és 120 órás transzfekció után hármas festést hajtottunk végre a DAPI, a TUNEL és az inzulin esetében. Minden szigetről fényképeket készítettünk konfokális mikroszkóppal. Méretarány = 40 μm. TUNEL-pozitív β-sejteket számláltunk. * P

A miR-299-5p célgénjeinek validálása. V: A várhatóan miR-299-5p MRE-ket tartalmazó négy célgén 3'UTR szekvenciája a miR-299-5p-hez igazodik, és mind a vad típusú (wt), mind a mutáns (mt) szekvenciákat felsoroljuk. B: Luciferáz-riporter vizsgálatot 24 órával a MIN6 sejtek együtttranszfekciója után végeztünk wt vagy mt riporter plazmidokkal, PRL-SV40 plazmiddal és nc-vel vagy miR-299-5p-vel. ** P

A Perp-deléció részben enyhítette a miR-299-5p gátlás és a glükolipotoxicitás káros hatásait a β-sejtekre. V: A 8 hetes db/db egerekből izolált szigeteket és alomtársuk kontrolljait összegyűjtöttük, és a PERP és a β-tubulin fehérjeszintjét Western-blottolással mértük (n = 8–10). B: A vad típusú Sprague Dawley patkányokból 4 hétig HFD-vel vagy normál étrenddel (ND) táplált primer szigeteken a PERP és a β-tubulin fehérjeszintjét külön-külön mértük Western-blot segítségével (n = 4). C: Az izolált humán szigeteket (H-szigetek) palmitáttal (0,5 mmol/l) vagy anélkül 48 órán át inkubáltuk, amikor qRT-PCR-t hajtottunk végre a Perp mRNS-szintjének mérésére. ** P

A PERP szabályozza az inzulin szekrécióját. A és B: A MIN6 sejteket 24 órán át vektor plazmiddal vagy Perp plazmiddal transzfektáltuk, amikor az inzulin szekréciót és az inzulin tartalmat GSIS assay-vel mértük (n = 8). C: A MIN6 sejteket 48 órán át együtt transzfektáltuk EGFP plazmiddal vagy EGFP-PERP plazmiddal és NPY-mOrange-szal, amikor az élő sejteket normál körülmények között készítettük. Reprezentatív élő sejtképek láthatók. Méretarány = 2 μm. D: A MIN6 sejteket 48 órán át együtt transzfektáltuk EGFP-PERP plazmiddal és NPY-mOrange-szal, amikor az élő sejteket alacsony (2 mmol/l) és magas glükózszintű (20 mmol/l) stimuláció mellett készítettük. h. Reprezentatív élő sejtképek láthatók. Méretarány = 2 μm. A nyilak a PERP tipikus drámai felhalmozódását jelzik a MIN6 sejtek magjai közelében. ** P