A halolajból származó omega-3 zsírsavak elnyomják az NLRP3 zsírszöveteket az emberi elhízásban

Kailey Roberts Lee

Endokrinológiai és Diabetes Osztály, Philadelphia Gyermekkórház, Philadelphia, Pennsylvania

Yasmeen Midgette

Endokrinológiai és Diabetes Osztály, Philadelphia Gyermekkórház, Philadelphia, Pennsylvania

Rachana Shah

Endokrinológiai és Diabetes Osztály, Philadelphia Gyermekkórház, Philadelphia, Pennsylvania

Absztrakt

Kontextus

Az NRLP3 inflammaszóma egy multiprotein veszélyérzékelő komplex, amely kritikus összeköttetésként szolgál az elhízással összefüggő zsírgyulladás és az inzulinrezisztencia között, és állatkísérletekben kimutatták, hogy halolajból származó hosszú láncú omega-3 többszörösen telítetlen zsírsavak (n -3 PUFA).

Célkitűzés

Klinikai vizsgálatot és in vitro kísérleteket hajtottunk végre azon hipotézisünk tesztelésére, miszerint az n-3 PUFA elnyomja az NLRP3 gyulladását az emberi elhízásban azáltal, hogy az adipocitákban és makrofágokban gyulladáscsökkentést eredményez.

Tervezés

Placebo-kontrollos klinikai vizsgálat és in vitro kokultúrás kísérletek primer humán adipocitákkal (biopsziás mintákból) és humán THP-1 monocita eredetű makrofágokkal, amelyeket eikozapentaénsavval (EPA) és/vagy dokozahexaénsavval (DHA) kezeltek, szemben a vivőanyag-kontrollal.

Beállítás

Általános közösség, kutatólaboratórium.

Betegek és egyéb résztvevők

Elhízott (testtömeg-index ≥ 30 kg/m 2), nem cukorbeteg férfiak és nők 18-50 éves korban. N = 25.

Beavatkozások

Klinikai vizsgálat: Nyolc hetes kezelés 4 g Lovazával (EPA és DHA) vagy placebóval. Sejtkultúra: EPA és/vagy DHA 100 ug/ml koncentrációban vagy hordozó kontroll táptalajban.

Fő eredménymérések

IL-1β és IL-18 zsírszövet vagy adipocita/makrofág mRNS expressziója és keringő IL-18 szintek.

Eredmények

Elhízott emberi alanyok halolaj-kiegészítőkkel történő kezelése csökkentette a zsíros gyulladásos gének expresszióját, beleértve a gyulladásos asszociált IL-18 és IL-1β és a keringő IL-18 szinteket. Az EPA és a DHA egyaránt csökkentette a gyulladásos génexpressziót az elhízott emberi zsírban, valamint az emberi zsírsejtekben és makrofágokban.

Következtetések

Az N-3 PUFA csökkenti az NLRP3 gyulladását az emberi zsírban azáltal, hogy az adipocitákban és monocitákban/makrofágokban gén expresszióját csökkenti, és táplálkozási terápiás szerként képes elhízással kapcsolatos gyulladás megelőzésére.

Az elhízás jól ismert, mint alacsony fokú gyulladásos állapot; a metabolikusan aktív szövetekben, beleértve a zsírszöveteket is, a gyulladás hozzájárulhat az elhízással összefüggő anyagcsere-diszfunkcióhoz és a kardiometabolikus betegséghez. Az olyan tényezők, mint a zsírszövet-depóna bővülése és a szabad zsírsavfelesleg, olyan gyulladásos utak aktiválódásához vezetnek, amelyek proinflammatorikus makrofágokat toboroznak a zsírszövetbe. Az adipociták és az aktivált makrofágok együttesen fokozzák a gyulladásos citokinek (köztük a TNFα és az IL-1β) szekrécióját, amelyek közvetlenül és közvetetten hatnak az inzulinszignál útvonalakra az inzulinrezisztencia elősegítése érdekében [1–13].

Az IL-1β inzulinrezisztenciát eredményez az NF-κB és JNK jelátvitel aktiválásával [21], amely elősegíti az IRS1 szerin-foszforilációját, az inzulinjelzéshez szükséges tirozin-foszforilezés helyett a pusztulástól célozza meg [22]. Bár kevésbé egyértelmű, hogy az IL-18 hogyan befolyásolja az inzulinjelet, egy humán tanulmány kimutatta, hogy a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő alanyok makrofágjainak magasabb volt az IL-18-szekréciója, mint az egészséges kontrolloknak, és hogy az inzulin-szenzibilizáló szerrel, a metforminnal végzett kezelés csökkentette az IL-18 szekrécióját [23].

Megállapították, hogy az elhízott emberek és az egerek zsírszövetében fokozódik az NRLP3 komponensek expressziója [24, 25], az embereknél a súlycsökkenés csökkent expressziót eredményezett a fehér zsírszövetben [25]. Számos állatmodell kimutatta, hogy a gyulladásos összetevők hiánya összefügg az elhízással kapcsolatos inzulinrezisztencia elleni védelemmel [25–27]; bár következetlenség van ebben a válaszban, mivel egy másik csoport kimutatta, hogy az elhízással összefüggő gyulladás nem társult a megnövekedett kaszpáz-1 hasítással, és az Nlrp3 null egerek nem voltak védettek a zsírszöveti gyulladásoktól [28]. Az NRLP3 elhízásban és metabolikus diszregulációban betöltött szerepének további hitelessége miatt a genom egészére kiterjedő társulási vizsgálatok (eddig a kínai Han populációkban számoltak be) kimutatták, hogy az NLRP3 egy nukleotid polimorfizmusa összefügg az elhízással [29], valamint a 2-es típusú cukorbetegséggel és az inzulinrezisztenciával. [30, 31].

Számos állat- és in vitro modellt használó tanulmány kimutatta, hogy a telített zsírsavak az NLRP3 gyulladásos anyag aktivátorai [15, 16, 32–34]. Ezzel szemben a telítetlen zsírsavak, különösen a halolajból származó hosszú láncú omega-3 többszörösen telítetlen zsírsavak (n-3 PUFA), gátolhatják a gyulladásos rendszert [35]. Az elhízás okozta zsírgyulladásban a halolajok általános gyulladáscsökkentő hatását állat- és embermodellekben ismételten kimutatták [36–39]. A 3T3-L1 adipocitákban a magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) halolajjal táplált egerek makrofágjaival végzett kokultúrában csökkent az IL-1β, az IL-18 és a kaszpáz-1 expresszió, valamint csökkent a kaszpáz-1 aktivitás a HFD-vel összehasonlítva halolaj nélkül [35]. A mai napig nem publikáltak tanulmányokat az n-3 PUFA hatásáról az ember vagy az emberi sejttenyésztési modellek gyulladásos állapotára.

Az n-3 PUFA kiegészítés klinikai vizsgálatát végeztük a zsírszövet NLRP3 gyulladásos aktivitásával az elhízás során, valamint ex vivo zsír- és kokultúra kísérleteket végeztünk humán primer adipocitákkal és THP-1 monocita eredetű makrofágokkal az n-3 PUFA hatásának bemutatására az NLRP3 gyulladásos.

1. Anyagok és módszerek

A. Klinikai vizsgálat

Az összes ismertetett klinikai vizsgálatot a Pennsylvaniai Egyetem (UPenn) Intézményi Felülvizsgálati Testületének jóváhagyásával hajtották végre, miután az összes kutatási résztvevő írásos tájékoztatáson alapuló beleegyezését megszerezte, és regisztrálták a klinikai vizsgálatokon.gov (> NCT02010359). A halolaj- és zsírgyulladáscsökkentő vizsgálatba 18–50 éves, egészséges testtömeg-indexű testtömegindexű, ≥ 30 mg/m 2 testtömeg-indexet vettünk fel az általános közösségből. Összesen 25 alany (13 Lovaza, 12 placebo) fejezte be a vizsgálatot, és szerepelnek ezekben az elemzésekben.

A kizárások között szerepelt a cukorbetegség diagnózisa (glükóz-éhezés> 126 mg/dl, vagy véletlenszerű> 200 mg/dl, vagy bármilyen antidiabetikus szer alkalmazása), bármely lipidcsökkentő gyógyszer, gyulladásos betegség vagy gyulladáscsökkentő szerek (beleértve a a fájdalomcsillapítók és az inhalációs/topikális/orrszteroidok), a szokásos halbevitel> havi három adag és/vagy nem hajlandó megszüntetni az összes halbevitelt a vizsgálat során, a halolaj-kiegészítő bevitele 6 hónapon belül, olyan körülmények, amelyek ellenjavallták a Lovaza alkalmazását (májműködési zavar, vérszegénység, aritmia, koagulopátia), terhesség és szoptatás.

Azok a résztvevők, akik telefonos/e-mailes interjúval teljesítették a kezdeti kritériumokat, szűrővizsgálaton vettek részt kórelőzményben, fizikai vizsgálatokon, elektrokardiogramon, vizelet terhességi teszten nőknél, valamint az éhomi glükóz, a teljes vérkép, a májfunkciós panel és a lipidek laboratóriumaiban. Ha erre jogosult, akkor visszatértek egy randomizációs látogatásra, amely magában foglalta az éhomi vérvételt és a gluteális zsírszövet biopsziáját, amint arról korábban beszámoltunk [40, 41]. Röviden: a szubkután zsírmintákat 4 mm-es gluteális bemetszésen keresztül, magtű aspirációval gyűjtöttük össze. Az alanyokhoz alanyazonosítót rendeltek, és kettős-vak módon randomizálták a Lovaza 4 g/nap vagy a placebo csoportba (az UPenn Investigational Drug Service-en keresztül kezelték). Az alanyok visszatértek a tanulmány befejezésére tett látogatásra, amelyet 8-10 hét tanulmányi gyógyszer után terveztek be, amely ismét az éhomi vérvételt és a zsír biopsziát jelentette az ellenoldali gluteális helyről. A zsírszövet- és vérmintákat alikvotizáltuk, és további elemzésig -80 ° C-on tároltuk.

B. A keringő metabolitok és a gyulladásos markerek mérése

Az éhomi glükóz inzulin és lipid méréseket a Pennsylvaniai Egyetem Translational Core Laboratory végezte a Roche Cobas c311 (Roche, Basel, Svájc) felhasználásával. A HOMA-IR-t a következő képlet segítségével számoltuk: éhomi inzulinszint (µIU/ml) × éhomi éhomi glükózszint (mM-ben)/22,5. A gyulladásos markerek [IL-6, monocita kemoattraktáns fehérje-1 (MCP-1), IL-18 és IL-1β] és a nagy molekulatömegű (HMW) adiponektin mennyiségét enzimhez kapcsolt immunszorbens teszttel számoltuk két példányban, a gyártó utasításainak megfelelően. (R&D Systems, Minneapolis, MN) [42–45] és egy Epoch Microplate Spektrofotométeren olvasható (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT). A variancia együtthatói 2 voltak. A sejteket 80% -os összefolyásig növesztettük, mielőtt megkülönböztettük volna őket, a korábban leírtak szerint [41].

E. THP1 makrofág differenciálás és polarizáció

A kereskedelemben vásárolt THP1 monocitákat (Sigma-Aldrich Corp.) 1 × 106 sejt/ml koncentrációban tenyésztjük THP1 tenyésztő táptalajban [RPMI táptalaj 1 -glutaminnal (2 mM), HEPES (10 mM), nátrium-piruváttal (1). mM), d-glükóz (625 mg/l), betamercaptaetanol (100 ul/l) és 10% marhahús magzati szérum]. A differenciálódást 3x103 sejt/cm2 THP1 tenyésztő táptalajba 200 µM phorbol 12-mirisztát-13-acetáttal (PMA) 72 órán át történő szélesztésével értük el. Ezen a ponton a PMA-t eltávolítottuk, és a sejteket PMA-mentes THP1 táptalajban tenyésztettük 5 napig, mielőtt polarizáltuk. Az előzetes időbeli lefolyás és a dózis-válasz kísérletek meghatározták ezeket a tenyésztési körülményeket semleges, nem polarizált (M0) makrofágok előállítására (az adatokat nem mutatjuk be). Az M0 makrofágokat ezután klasszikusan aktivált, proinflammatorikus makrofágokká polarizáltuk úgy, hogy a sejteket THP1 táptalajban tenyésztettük lipopoliszacharid (100 ng/ml) és INF-y (20 ng/ml) alkalmazásával 24 órán át.

F. Elsődleges adipocita/makrofág együtt-tenyésztési kísérletek

Az elsődleges adipocitákat klasszikusan aktivált THP1 makrofágokkal tenyésztettük a Costar Transwell kokultúra rendszer (Corning Life Sciences, Corning, NY) alkalmazásával. A kokultúrát megelőzően az elsődleges adipocitákat egy 12 üreges lemez alsó rekeszébe szélesztettük 1x106 sejt/ml koncentrációban, és differenciáltuk. Egy külön 12 lyukú lemezen, sejtek nélkül az alsó rekeszben, 1x105 THP1 sejteket szélesztettünk, differenciáltunk és polarizáltunk a transz-kútba illesztett felső rekeszben. Miután mind az elsődleges adipocitákat, mind a THP1 makrofágokat megkülönböztették és polarizálták, a klasszikusan aktivált makrofágokat tartalmazó transzlyukakba helyezett betéteket az alsó adipocitákat tartalmazó rekesz belsejébe helyezték.

Az elsődleges adipocita és THP1 makrofág kokultúrákat halolaj eredetű LC n-3 PUFA EPA-val és DMSO-ban oldott DHA-val kezeltük. Mindkét sejttípust 100 µM EPA-val, 100 µM DHA-val, 50 µM EPA és 50 µM DHA kombinációjával vagy vivőanyaggal (DMSO) kezeltük 48 órán át. A kezelés időzítését és koncentrációját előzetes dózis-válasz és időbeli kísérletek alapján határoztuk meg (az adatokat nem mutatjuk be).

G. RNS extrakció, cDNS szintézis és kvantitatív PCR

A teljes zsírszövetet homogenizáltuk, vagy in vitro kísérletekhez az adipocitákat és a monocitákat mostuk és lizáltuk RNS izolálás céljából TRIzol reagens alkalmazásával (Life Technologies, Foster City, CA). Az RNS koncentrációját és minőségét Epoch Microplate Spektrofotométerrel (BioTek Instruments, Inc.) határoztuk meg, és a cDNS-t nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet (Life Technologies) felhasználásával készítettük el. A gének expresszióját kvantitatív, valós idejű PCR-rel határoztuk meg TaqMan Universal PCR MasterMix, valamint a Life Technologies és a QuantStudio6 kvantitatív PCR-rendszerek primereivel és próbáival. A génexpressziós szinteket a háztartás GAPDH génjére normalizáltuk, és a relatív expressziót 2- ΔΔCt módszerrel határoztuk meg [46].

H. Statisztikai elemzés

A statisztikai elemzést a GraphPad Prism 6 szoftver segítségével készítettük el. A kontroll és az együtt tenyésztett sejtek közötti különbség statisztikai szignifikanciáját Student t teszttel vagy Mann-Whitney U teszttel határoztuk meg, attól függően, hogy feltételezhető-e a normalitás. Az EPA és DHA kezelt sejtek közötti statisztikai különbség mérésekor egyirányú ANOVA-t használtunk. Kétirányú ANOVA-t alkalmaztunk a viscerális és a szubkután szövet génexpressziójának statisztikai szignifikanciájának meghatározására ex vivo kísérletekben.

2. Eredmények

A. A halolaj-kiegészítők csökkentették az NLRP3 gyulladásos gének zsírszövet-expresszióját és az IL-18 keringését az emberi elhízásban

Az adatokat folyamatos változók átlagaként (SD) vagy a kategorikus változók százalékaként mutatjuk be.

Rövidítések: HDL, nagy sűrűségű lipoprotein; LDL, alacsony sűrűségű lipoprotein.