Határok a biomérnöki munkában
és a biotechnológia

Bioprocesszoros mérnöki munka

Ez a cikk a kutatási téma része

Bioprocesszorok, tisztítási technikák és szállító rendszerek bioaktív anyagokhoz az élelmiszerekben és az élelmiszeriparban, II. Rész Az összes cikk megtekintése

Szerkesztette
Arnoldo Lopez-Hernandez

Wisconsin-Madison Egyetem, Egyesült Államok

Felülvizsgálta
NOPPOL -. LEKSAWASDI

Chiang Mai Egyetem, Thaiföld

Monica Alvarez

Spanyol Nemzeti Rákkutató Központ (CNIO), Spanyolország

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

szuperkritikus

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Molecular Oncology and Nutritional Genomics of Cancer, IMDEA-Food Institute, CEI UAM + CSIC, Madrid, Spanyolország
  • 2 Új élelmiszerek osztályának gyártása és jellemzése, CIAL Élelmiszertudományi Kutató Intézet, CEI UAM + CSIC, Madrid, Spanyolország
  • 3 Egészségügyi élelmiszerek gyártása és fejlesztése, IMDEA-Food Institute, CEI UAM + CSIC, Madrid, Spanyolország

Bevezetés

Az elmúlt években nagy aggodalomra ad okot az anyagcserével kapcsolatos krónikus betegségek, köztük a metabolikus szindróma, a szív- és érrendszeri betegségek, az inzulinrezisztencia, az elhízás és a rák, növekedése. Fontos, hogy a becslések szerint a rákos megbetegedések legfeljebb egyharmada megelőzhető a kulcsfontosságú kockázati tényezők, például az étrend és a testmozgás módosításával, az elhízással való összefüggésük miatt (Parkin et al., 2011; Brown et al., 2018) . Számos epidemiológiai tanulmány kimutatta, hogy az elhízás növeli a különböző típusú rák kialakulásának kockázatát (Lauby-Secretan és mtsai, 2016), és bizonyítékok felhalmozása bizonyítja, hogy az egyén teljes anyagcsere-állapota hozzájárulhat a karcinogén folyamat során bekövetkező molekuláris változásokhoz. A tumorgenezis során kulcsfontosságú esemény a rák energetikai anyagcseréjének újraprogramozása (Hanahan és Weinberg, 2011), és az elhízással kapcsolatos változások (hormonok, növekedési faktorok, citokinek és más gyulladásos molekulák) elősegíthetik a protumorális jeleket a pre- vagy neoplasztikus sejtekben azáltal, hogy kölcsönhatásba lépnek receptoraikon és/vagy a downstream intracelluláris jelátviteli útvonalakon keresztül (Gunter et al., 2015; Renehan et al., 2015; Murphy et al., 2018).

A közelmúltban kifejlesztett erőteljes „omika” technológiák [genomika, transzkripptika (Chen és mtsai., 2007), proteomika (Sun és mtsai., 2018), metilomika (Gaunt és mtsai, 2016; Richmond és mtsai, 2016), metabolomika (Shin és mtsai, 2014; Würtz és mtsai, 2014), a lipidomika, a mikrobiomika (Wang és mtsai, 2018)] új utakat nyitott a táplálkozástudományok felé precíziós táplálkozás. A rák összefüggésében, a klinikákon alkalmazott kemoterápiával és/vagy sugárterápiával együtt a precíziós táplálkozás segíthet természetes kivonatok, bioaktív vegyületek és táplálkozási ajánlások alkalmazásával a génexpresszió és/vagy a rákkal kapcsolatos kockázati tényezők, például a elhízásként, amely hatással lesz e betegség kialakulásának vagy előrehaladásának kockázatára.

Az ilyen táplálkozási beavatkozások sikere több lépést igényel: in vitro és a kiválasztott kivonatok és/vagy bioaktív vegyületek tumorellenes hatásainak preklinikai bemutatása; ii. a hatásmechanizmusuk és a molekuláris célpontok ismerete, amely meghatározza a betegek speciális alcsoportjait, akik részesülnek ezekből; (iii) a beavatkozásra adott differenciális válaszokhoz kapcsolódó genetikai variánsok vizsgálata; és iv. az új készítmények innovatív megközelítései a in vivo a bioaktív összetevők biohasznosulása. További tényezők, például a bél mikrobioma összetétele, az immunrendszer és a táplálkozási állapot finomítja a végeredményt.

A fitokemikáliák és az étrendi eredetű vegyületek alkalmazása a rák megelőzésében és/vagy kezelésében jól bizonyított (Mouhid et al., 2017; Pan et al., 2017; Kumar et al., 2018; Imran et al., 2019; Tarasiuk és Fichna, 2019), mint például a taxol és a kamptotecin, amelyeket széles körben használnak a klinikákon (Denda et al., 2019; Sanoff et al., 2019; Ulusakarya et al., 2019). A metabolikus újraprogramozás rákban nemcsak támogatja a szaporodást, hanem elősegíti a rákos sejtek rosszindulatú daganatát és elterjedését is. Ebben a tekintetben a szaporodó rákos sejtek fokozott glükózfelvétele (Warburg-hatás) (Hanahan és Weinberg, 2011; Derle és mtsai, 2018), a proliferációt és redox homeosztázist támogató fokozott glutaminolízis (Li and Le, 2018; Bott et al., 2019), vagy a rák disszeminációjával járó lipid anyagcsere-változások (Currie és mtsai, 2013; Luo és mtsai, 2018; Munir és mtsai, 2019) jól dokumentáltak.

A bioaktív vegyületek egyik legnépszerűbb forrása a zöldség és a növény. A fitokémiai anyagok fontos biológiai aktivitást fejtenek ki, mint például gyulladáscsökkentő, vérnyomáscsökkentő, antioxidáns, rákellenes, antidiabetikus vagy elhízásgátló.

Ezen okokból kifolyólag a bioaktív vegyületek és/vagy természetes kivonatok előállítására irányuló innovatív módszerek kifejlesztésére törekszenek a jelenlegi erőfeszítések. A legígéretesebb módszerek között létezik a szuperkritikus folyadékok zöld technológiája, amelyben a szuperkritikus CO2-t speciálisan alkalmazzák az alacsony polaritású vegyületek kivonásában. Ezt a technológiát különféle oldószerek segíthetik az extrakció teljesítményének növelése érdekében.

Itt vizsgáltuk a szuperkritikus CO2 kivonat tumorellenes tulajdonságait és hatásmechanizmusát Calendula officinalis, körömvirág néven ismert, a hasnyálmirigyrák összefüggésében.

A hasnyálmirigyrák világszerte a rákhoz kapcsolódó halálozások második helyzetéhez vezet. Ennek a ráknak rossz a prognózisa, és az 5 éves teljes túlélési arány + a mitokondriális intermembrán térből (7–9 mérés), és ezáltal a maximális légzés aktiválása. Végül antimycin A-t és rotenont (0,5 μM) adtunk a mitokondriális légzés teljes gátlásához (10–12 mérés).

Celluláris ATP tartalom mérése

Az ATP-tartalom számszerűsítéséhez ATP-alapú tesztet (CellTiter-Glo, Luminescent Cell Vability kit) használtunk (Promega, Madison, WI, USA; Cat. # G7571) a gyártó ajánlásait követve. Röviden: a MiaPaca-2 sejteket először körömvirág SFE-vel előkezeltük (½ × IC50, 1 × IC50 és 2 × IC50), az IC50 értéke 39,8 (± _4,6) μg/ml volt, amint azt korábban leírtuk (Mouhid és mtsai., 2018). A nem kezelt sejteket kontrollként tartottuk. Összesen 10 000 MiaPaca-2 sejtet ültettünk 96 lyukú, tiszta alsó fekete polisztirollemezekre.

Western Blot

Körömvirág SFE-vel végzett 48 órás kezelés után a MiaPaca-2 vagy a Panc-1 hasnyálmirigyrák sejteket tripszinnel mostuk és leválasztottuk. A sejtek lizálására proteáz és foszfatáz inhibitorokat tartalmazó RIPA puffert használtunk. 10 percig 4 ° C-on végzett centrifugálás (12 000 g) után a felülúszókat kinyerjük. A fehérjéket denaturáltuk és 4–15% Mini-Protean TGX Protein Protein Gel (BioRad) -ba töltöttük elektroforetikus szétválasztás céljából, majd nitrocellulóz membránra vittük őket. A membránokat blokkoltuk 5% zsírmentes száraz tej alkalmazásával, TBS 0,05% Tween-20-ban. Az elsődleges antitesteket egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on, a szekunder antitesteket pedig 1 órán át. P-Actin vagy Ponceau festést alkalmaztunk töltés kontrollként. Az elsődleges ellenanyagok a nyúl poliklonális anti-LC3 (PM036, 1: 1000 hígítás, MBL), a nyúl monoklonális anti-foszfo-AMPKa (T172) (40H9, 1: 1 000 hígítás, sejtjelzés) és a nyúl monoklonális anti-AMPKα antitestek voltak. (23A3, 1: 1 000 hígítás, sejtjelzés). A betöltési kontrollokhoz β-aktint (Sigma-Aldrich) vagy Ponceau festést alkalmaztunk. A jeleket az ECL plus (GE Healthcare, Little Chalfont, Egyesült Királyság) segítségével vizualizálták.

Immunfluoreszcencia

A MiaPaca-2 sejteket M24 kútlemezeken szétterítettük üveg fedőlapok tetején o/n értékre. Ezután a sejteket különböző dózisú körömvirág SFE-vel (1 × IC50, 2 × IC50) kezeltük 48 órán át. A nem kezelt sejteket tartottuk kontrollként. A sejteket 4% PFA/PBS-ben fixáltuk 10 percig szobahőmérsékleten. Ezután a sejteket szobahőmérsékleten 20 percig 100 μg/ml digitaloninnal permeabilizáltuk. PBS-sel végzett mosás után anti-LC3 antitestet (1: 1 000) adunk hozzá, és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Mosás után 1: 500 arányú Alexa Fluor 488 kecske anti-nyúl IgG-t (Invitrogen, A11008) inkubáltunk 30 percig szobahőmérsékleten. A DAPI-t 5 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. A pozitív kontrollokat 6 órán át inkubáltuk Hank oldatában 37 ° C-on. Az E64d és a pepstatin A kezelést 10 μM, illetve 10 μg/ml koncentrációval végeztük.

Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció

A MiaPaca-2 és Panc-1 sejteket (0,35 × 106 sejt) körömvirág SFE-vel kezeltük 48 órán át, különböző dózisokban: ½ IC50, 1 × IC50, 2 × IC50, az IC50 értékek 39,8 μg/ml (± _4,6), illetve 43,2 μg/ml (± 7,9) a MiaPaca-2 és a Panc-1 esetében, a korábban leírtak szerint (Mouhid et al., 2018). A nem kezelt sejteket kontrollként tartottuk.

A teljes RNS-t Tri Reagenssel (Sigma) extraháltuk. Egy mikrogramm RNS-t fordítottunk át nagy kapacitású RNS-cDNS Master Mix rendszerrel (Life Technologies). A kvantitatív polimeráz láncreakciót (qPCR) a 7900HT valós idejű PCR rendszerben (Life Technologies) hajtottuk végre a VeriQuest SYBR Green qPCR Master Mix (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) alkalmazásával, és Taqman szondákat használtunk: Hs01629120_s1, Hs01029413_m1, Hs00245183_m1 és Hs99999901_s1 BMP8B, TFAP2A, ZFP36L1, illetve 18S; vagy oligók az epithelial-mesenchymalis átmenet (EMT), a szár és az endoplazmatikus retikulum (ER) stressz markerek esetében (az S1 táblázat mutatja az alkalmazott primerek listáját és szekvenciáit). A relatív génexpresszió kiszámításához a 2 -ΔΔCt módszert alkalmaztuk (Livak és Schmittgen, 2001).

Microarray Gene Expression Assay

A MiaPaca-2 sejteket p100 lemezekre szélesztettük (2 × 106), majd 12 órával később 48 órán át 30 és 70 μg/ml körömvirág SFE-vel kezeltük. A nem kezelt sejteket kontrollként tartottuk. A teljes RNS-t RNeasy Mini Kit-rel (Qiagen Iberica) izoláltuk. A kontroll és a kezelt sejtek közötti mikroarray génexpressziós elemzést az Országos Biotechnológiai Központ (CNB-Madrid, Spanyolország) Genomic Service végezte. Az RNS integritásának validálása után az RNS-eket reverz átírással és fluoreszcensen jelöltük meg az egyszínű Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies) segítségével. Az alkalmazott mikroarray gén expressziós platform az Agilent Sure Print G3 Human 8 × 60 K (Whole Human Genome Microarray Kit) volt.

BMP8B Kiürülés si-RNS-készletekkel

A sejteket (0,25 × 106) hat lyukú lemezekre szélesztjük si-RNS-medencékkel (siTOOLs Biotech GmbH, Planegg, Németország) az emberi BMP8B Az mRNS átmenetileg kimeríti a BMP8B. A lipofektamin RNAimax-ot (Life Technologies, Darmstadt, Németország) alkalmaztuk a MiaPaca-2 és Panc-1 hasnyálmirigyrák sejtjeinek 4-6 órán át történő transzfektálására. Ezt követően a sejteket 48 órán át kezeltük a körömvirág SFE megadott dózisaival. Kontrollként negatív kontroll siPOOL-val transzfektált sejteket tartunk kontrollként. A funkcionális szerepe BMP8B a sejtek bioenergetikájának kimerülését tovább elemeztük.

Inváziós vizsgálatok

Matrigel bevonatú kamrákat (BD Biosciences Madrid, Spanyolország) használtunk inváziós vizsgálatokhoz. A képeket az Olympus CKX41 mikroszkóppal készítettük. Az elemzés a GETIT szoftverrel történt.

Statisztikai analízis

A microarray génexpressziós adatokat FIESTA szoftverrel (1.0 verzió) elemeztük. A statisztikai elemzéseket Limma (Smyth, 2005) alkalmazásával végeztük. A P a kontroll sejtekhez képest kétszeres változást mutatunk be a 6A. ábrán. Kvantitatív valós idejű PCR (RT-qPCR) elemzéssel a BMP8B a körömvirág után az SFE dózisfüggő módon történő kezelését validáltuk (30 és 70 μg/ml) (6B. ábra, bal oldali panel). Hasonló eredményeket kaptunk egy másik hasnyálmirigyrákos sejtvonallal, a Panc-1-vel, amelyet agresszívebbnek írtak le a MiaPaCa-2 sejtekhez képest (Yang et al., 2011) (6B. Ábra, jobb oldali panel).

6. ábra. BMP8B a körömvirág SFE molekuláris célpontja. (A) A differenciálisan expresszált gének mikroszkópos adatai a MiaPaCa-2 hasnyálmirigyrák sejtvonal 30 és 70 μg/ml körömvirág SFE-vel történő kezelését követően 48 órán át. Az adatok minden feltételhez tartozó három független kísérlet legjelentősebb próbájának értékét képviselik. Statisztikailag szignifikáns különbségű gének (P érték # Az siRNS BMP8B és az siRNS összekeveredett transzfektált sejtek közötti statisztikai különbségeket jelzi az egyes állapotok esetében: # P ## P ### P #### P Kulcsszavak: precíziós táplálkozás, szuperkritikus kivonat, körömvirág, sejt bioenergetikák, rák

Idézet: Gómez de Cedrón M, Mouhid L, García-Carrascosa E, Fornari T, Reglero G és Ramírez de Molina A (2020) Körömvirág szuperkritikus kivonat mint potenciális társadjuváns a hasnyálmirigyrákban: A BMP8B által kiváltott energetikai katasztrófa véget ér az autofágia okozta sejtpusztulással. Elülső. Bioeng. Biotechnol. 7: 455. doi: 10.3389/fbioe.2019.00455

Beérkezett: 2019. augusztus 06 .; Elfogadva: 2019. december 19 .;
Publikálva: 2020. január 24.

Arnoldo Lopez-Hernandez, University of Wisconsin-Madison, Egyesült Államok

Noppol-Leksawasdi, Chiang Mai Egyetem, Thaiföld
Monica Alvarez, Spanyol Nemzeti Rákkutató Központ, Spanyolország