Határok a mikrobiológiában

Rendszerek mikrobiológiája

Ez a cikk a kutatási téma része

Rovarok mikrobioma: A sokféleségtől az alkalmazásokig Az összes 22 cikk megtekintése

Szerkesztette

Adly M. ABDALLA

Rovarkártevő laboratórium, FAO/NAÜ közös élelmiszeripari és mezőgazdasági nukleáris technikák osztálya, Nemzetközi Atomenergia Ügynökség, Bécs, Ausztria

Felülvizsgálta

Martin Kaltenpoth

Johannes Gutenberg Egyetem, Mainz, Németország

Henry J. Ogola

Jaramogi Oginga Odinga Természettudományi és Műszaki Egyetem, Kenya

Leen Van Campenhout

KU ⁯Leuven, Belgium

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

Cikk letöltése
- PDF letöltése
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Kiegészítő
  Anyag
Exportálás
- EndNote
- Referencia menedzser
- Egyszerű TEXT fájl
- BibTex

OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

1 Dipartimento di Scienze gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente (DeFENS), Milánói Studi di Università, Milánó, Olaszország
2 Vörös-tengeri Kutatóközpont (RSRC), Abdullah King Tudományos és Technológiai Egyetem (KAUST), Thuwal, Szaúd-Arábia
3 Alkalmazott Tudományok Iskolája, Edinburgh Napier Egyetem, Edinburgh, Egyesült Királyság

Bevezetés

Az elmúlt években a BSF mikrobiotát vizsgálták, figyelembe véve a gazdaszervezet különböző fejlődési szakaszait és táplálkozási körülményeit. A tanulmányok rámutattak, hogy mind az étrend forrása, mind az életszakasz közvetlenül befolyásolta a mikrobiota sokféleséget (Jeon et al., 2011; Zheng et al., 2013b; Varotto Boccazzi et al., 2017; De Smet et al., 2018; Jiang et al. al., 2019; Wynants és mtsai, 2019) és nemrégiben bebizonyosodott, hogy a baktériumok közössége sűrűségében és filogenetikai összetételében a középbél elülső, középső és hátsó része mentén változott (Bruno és mtsai, 2019).

Anyagok és metódusok

Rovartelep

Hermetia illucens az olasz Milánói Egyetem rovartani létesítményében nevelték (Jucker et al., 2017). A BSF lárvákat etettük ad libitum táplálkozási szempontból teljes normál étrenden (SD), amely 50% búzacsíra, 30% lucerna, 20% kukoricaliszt tartalmaz, amelyhez Hogsette (1992) szerint azonos térfogatú vizet adunk, ellenőrzött körülmények között 25 ° C-on, 60–65% relatív páratartalom (RH).

A lárva bél disszekciója és a baktériumok izolálása

Baktériumok azonosítása

Az egyes izolátumokból származó teljes DNS-t forró lízissel extraháltuk (Ferjani és mtsai., 2015) vagy fenol-kloroform DNS-extrakción alapuló protokoll (Sambrook és mtsai., 1989) alkalmazásával, 16S rRNS PCR amplifikáció sikertelensége esetén a forró lízis. A baktériumgyűjtést ITS-PCR ujjlenyomat-kivétellel távolítottuk el az ITS-F (5′-GTC GTA ACA AGG TAG CCG TA-3 ′) és az ITS-Reub (5′-GCC AAG GCA TCC ACC-3 ′) primer párral ( Mapelli és mtsai, 2013; Soldan és mtsai, 2019). Mindegyik ITS-csoporthoz egy/két jelöltet választottunk ki, és a 16S rRNS gént amplifikáltuk a 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3 ') és az 1492R (5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA - primerek alkalmazásával. 3 ′) (Mapelli et al., 2013; Soldan et al., 2019). A PCR-fragmenseket részben szekvenálták Macrogen-ben (Dél-Korea), majd a szekvenciákat összehangolták az EzBioCloud adatbázissal (Yoon et al., 2017). A szekvenciákat az Európai Nukleotid Archívumban tárolták PRJEB30516 csatlakozási szám alatt.

A baktérium-izolátumok metabolikus aktivitásának szűrése

Az amilázszűréshez baktériumtenyészeteket észleltünk egy keményítővel (1%) kiegészített NB agar lemezen, majd 48 órán át 30 ° C-on inkubáltuk. Inkubálás után a lemezeket 1% -os Lugol jódoldattal (Jacob és Gerstein, 1960) öntöttük a sejten kívüli amiláz aktivitás azonosítására.

A cellulózszűrést Ventorino és mtsai. (2015) 0,1% [NH4] NO3-ot, 0,1% élesztő-kivonatot, 50 ml standard sóoldatot, 1 ml nyomelemoldatot (0,01% H3BO3, 0,012% MnSO4 H2O, 0,125% ZnSO4 7H2O, 0,078% CuSO4 5H2O) tartalmazó táptalaj felhasználásával. 0,01% MoO3), 0,5% CMC, 0,1% kongovörös (Sigma-Aldrich) és 1,5% agar pH 7-nél. Öt mikroliter folyékony baktériumkultúrát egy éjszakán át 30 ° C-on rázási körülmények között növesztettünk a lemezeken, és 30 ° C-on inkubáltuk. ° C-on 4 napig. Inkubálás után a cellulolitikus aktivitású törzsek tiszta halo zónákat mutattak a telepek körül.

A pektinázszűrő tápközeg 0,67% élesztő nitrogénbázist, 1,0% pektint és 1,5% agart tartalmazott pH 7,0 ± 0,2 mellett (Park és mtsai, 2007). A lemezeket ezután 1% n-hexadecil-trimetil-ammónium-bromid oldattal (CTAB) kezeltük, és a kolóniák körül tiszta halo megfigyelésével értékeltük a pektin lebomlását.

Az észteráz aktivitást 1,0% pepton, 0,5% NaCl, 0,01% CaCl2 Ca2H2O, 1 ml tween 80 és 2,0% agar tartalmú táptalaj alkalmazásával értékeltük 7,4 ± 0,2 pH mellett (módosítva: Mazzucotelli és mtsai., 2013). A kolóniák körül fehér csapadék képződés, amely a kalcium só kristályainak lerakódásából ered, a zsírsavak oldódását jelzi az észteráz aktivitás miatt.

Az észteráz/lipáz aktivitást tributirin agar táptalajon detektáltuk, amely 0,8% NB-t, 10 ml tributirint, 4 ml tween 20-at és 1,5% agart tartalmazott pH 7,5 ± 0,2-nél. A tributirin agar lemezeket foltos izolátumokkal inkubáltuk 30 ° C-on 72 órán át. A hidrolízis tiszta zónája észteráz- és/vagy lipázaktivitásra utal Gupta és mtsai. (2003).

A valódi lipázaktivitást 0,8% NB-t, 0,4% NaCl-t, 3,125% olívaolajat, 10 ml rodamin B-t (1 mg/ml oldat) és 2% agart tartalmazó pH-jú 7-es rodaminolaj-agar (ROA) táptalajon vizsgáltuk. Kumar et al. (2012). 48 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után a baktériumtelepek körül UV fényben narancssárga fluoreszcens halók képződésével azonosítottuk a pozitív törzseket.

Az extracelluláris proteáz aktivitást tej agar tápközeggel értékeltük, amely 0,5% kazein hasnyálmirigy emésztést, 0,1% glükózt, 0,25% élesztő kivonatot, 3,5% sovány portejet és 1,5% agart tartalmazott (módosítva: Jeon et al., 2011). A lemezeket 72 órán át 30 ° C-on végzett inkubálás után vizsgáltuk. A tiszta zóna megjelenése a foltos izolátumok körül extracelluláris proteáz termelését jelzi.

Az ammóniatermelést Cappuccino és Sherman (1992) leírása szerint értékeltük. Röviden, egy éjszakán át inkubálás után 30 ° C-on TSB-ben rázó állapotban 500 μl baktériumtenyészetet oltottunk be 10 ml peptonvízbe, és inkubáltuk 30 ° C-on 4 napig. Ezután minden tenyészethez 1 ml Nessler-reagenst adunk: a narancssárga szín kialakulása jelzi a törzs képességét ammónia előállítására. Az oltatlan tápközeg zöld színt kapott, valamint baktériumok ammóniatermelő képesség nélkül.

A karbamid lebomlásának kimutatására az izolátumokat triptikus szójaleves (TSB) folyékony táptalajba oltottuk, és egy éjszakán át inkubáltuk 30 ° C-on shacking körülmények között; A tenyészetek 0,5 ml-ét ezután 1,5 ml-es csövekbe helyeztük, és kétszer 0,9% -os nátrium-klorid-oldattal (5 perc, 4500 fordulat/perc, szobahőmérsékleten) mostuk a maradék tenyésztőközeg eltávolítása céljából. A pelleteket 470 μl B oldattal (0,1% KH2PO4, 0,1% K2HPO4, 0,5% NaCl, 0,013% NiCl2, 1 ml fenolvörös 0,2% és 100 ml dH2O) és 30 μl A oldattal (2 g karbamid, 2% etanolt és 4 ml dH2O-t), és 30 ° C-on inkubáltuk 1-2 órán át. A színt ezután ellenőriztük: a pozitív törzsek színváltozást mutattak sárga színről élénk rózsaszínre (módosítva: Mora et al., 2002).

A húgysav lebontását az NB-UA lemezekre folt izolátumok (0,8% NB, 0,5% húgysav és 1,5% agar) körül átlátszó haloerek képződésének megfigyelésével 48 órán át 30 ° C-on inkubáltuk (Morales-Jiménez cég módosítása). et al., 2013).

A fitázszűrő tápközeg (PSM) 1% glükózt, 0,4% Na-fitátot, 0,2% CaCl2-t, 0,5% NH4NO3-ot, 0,05% KCl-ot, 0,05% MgS04-7H2O-t, 0,001% FeSO 4-7H 2O-t, 0,001% MnSO 4-H 2 O-t és 1,5% -ot tartalmazott. % agar pH 7-nél. A Na-fitát lebomlását 4 napig 30 ° C-on végzett inkubálás után értékeltük. A lemezeken foltos izolátumok körüli tiszta zónák jelenlétét a fitát lebomlásának jelzésének tekintették (Jorquera et al., 2008).

Az exopoliszacharidok (EPS) termelését Santaella és mtsai. (2008) szacharóz (2%) hozzáadásával módosított RCV táptalaj felhasználásával. A baktériumtörzseket az RCV táptalaj agarlemezeire csíkoztuk, és 5 napos, 30 ° C-on történő inkubálás után az áttetsző és mukoid növekedést mutató telepeket pozitívnak tekintettük az EPS termelésére.

Az összes baktérium-szűrést aerob körülmények között végeztük.

Baktériumok beadása a rovardiétához

Bacillus licheniformis HI169 és Stenotrophomonas maltophilia HI121 sejteket adtunk be H. illucens, egyesével vagy vegyesen. A laboratóriumi törzs Escherichia coli A vizsgálatok során DH5α pKan-t (DsRed) használtunk kontrolltörzsként, a BSF kommensális közösségének kívülállójaként (Crotti et al., 2009). A HI169 és HI121 törzseket triptikus szója táptalajba (TSB táptalaj) oltottuk be, és egy éjszakán át tenyésztettük 30 ° C-on, míg E. coli A DH5a pKan-t (DsRed) Luria Bertani táptalajba (LB táptalaj) oltottuk be, és egy éjszakán át tenyésztettük 37 ° C-on. A következő napon 5 ml tenyészetet beoltottunk 100 ml megfelelő táptalajba, és 24 órán át inkubáltuk. Növekedés után a sejteket 3000 fordulat/perc sebességgel 15 percig, 4 ° C-on centrifugáltuk, a felülúszókat eldobtuk, és a pelletet háromszor sóoldattal (0,9% NaCl) mostuk a kiégett táptalaj eltávolítása céljából. Az összegyűjtött sejteket megfelelően hígítottuk sóoldatban 108 cfu/ml végkoncentrációra.

A törzsek közötti esetleges antagonista kölcsönhatás értékelése érdekében, B. licheniformis HI169 és S. maltophilia A HI121-et ugyanazon a lemezen együtt tenyésztettük. Röviden, egy törzset egyetlen csíkkal oltottunk be egy TSA lemez közepére, és 48 órán át inkubáltuk 30 ° C-on. Ezután a második törzs három csíkját merőlegesen hajtottuk végre az előzőhöz közel. Minden törzshez három ismételt lemezt készítettünk. Az együttes kultúrákat 30 ° C-on inkubáltuk, és 24 és 48 óra után ellenőriztük a törzsek növekedési gátlásának bizonyítását.

Statisztikai analízis

A kezelések közötti rovar teljesítménybeli különbségek felmérése (magyarázó kategorikus változónk; szintek: Vezérlés, E. coli DH5α pKan (DsRed), HI121, HI169 és HI121 + HI169) folyamatos válaszváltozóként mértük a lárva növekedését, a lárva végső tömegét, a prepupák számát, a baba súlyát és a baba hosszát. A lárvák növekedésére és a prepupák számának megjelenésére az ilyen különbségeket egy általánosító additív modell-statisztika segítségével teszteltük (GAM, mgcv csomag „r” -ben; Wood, 2001), míg a lárva végső súlyára, valamint a baba súlyára és hosszára lineáris vegyes modell, ahol a faktor köteget kontrolláltuk (az „r” lmerTest csomag használatával; Kuznetsova et al., 2015). Az ANOVA elemzéshez páros összehasonlítást végeztünk Tukey HSD teszttel. Az összes statisztikai elemzést R-ben végeztük (R Core Team, 2018).

Eredmények

Baktériumok izolálása a BFS lárva bélből

1.ábra. Kördiagramok, amelyek a relatív tenyészthető baktériumok sokféleségét mutatják H. illucens lárvák. A baktériumok sokféleségét a nemzetség (külső kör) és a család (belső kör) szintjén fejezik ki.

A teljes gyűjteményen belül a legtöbbet képviselt nemzetség volt Providencia (22%) és Morganella (6%) a Morganellaceae családban, Klebsiella (21%) és Escherichia (7%) az Enterobacteriaceae családon belül, Acinetobacter (8%) a Moraxellaceae családban, Stenotrophomonas (7%) a Xanthomonadaceae családban, Pseudomonas (6) a Pseudomonadaceae családban, és Enterococcus (6%) az Enterococcaceae családon belül (1. ábra).

Hidrolitikus profilok és EPS gyártás

Az összes 193 izolátumot átvilágítottuk, hogy jellemezzük a bakteriális partnerek potenciális hozzájárulását a gazda szén- és nitrogénfelvételéhez, valamint megvizsgáljuk a baktérium azon képességét, hogy tapadó anyagok, azaz EPS előállításával tapadhassanak a bélhámhoz (2. ábra). és 1. kiegészítő táblázat).

2. ábra. Metabolikus aktivitás és EPS - termelési képesség a bélből nyert baktérium izolátumok számára H. illucens lárvák. A sávok jelzik az egyes baktériumosztályok százalékos arányát az elemzett hidrolitikus aktivitások és az EPS termelés tekintetében.

A poliszacharidok lebomlását illetően azt találtuk, hogy az összesen 193 izolátum közül 15 képes lebontani a cellulózt, 3 amilolitikus, míg 47 pektinolitikus baktérium. Az izolátumok között lipiddegradációs képesség volt jelen: közülük 21-en képesek lebontani a Tween 80-at, 26-an tributirin felhasználására, 44-en pedig pozitívak voltak az olívaolaj lemezeken a valódi lipáz vizsgálatra. A nitrogén étrend-vegyületeket figyelembe véve 175 izolátum, a törzsgyűjtemény 89% -a képes volt ammóniát előállítani peptidekből, és 32 izolátum lebonthatta a fehérjéket. A rovarok metabolikus hulladékvegyületeiből származó nitrogén újrafeldolgozásának potenciálját 63, illetve 31 izolátumban azonosították, amelyek pozitív eredményt adtak a karbamid és a húgysav lebomlására. Figyelmünket a fitázaktivitás jelenlétére is összpontosítottuk a baktériumgyűjteményben, amely biológiailag hozzáférhető foszfátot szabadíthat fel az étrend összetevőiből: azt találtuk, hogy 119 törzs pozitív volt a fitát-degradáció szűrésére.

A hidrolitikus képességek széles körben elterjedtek gyűjteményünkben. Egyes tevékenységek egyes taxonómiai csoportokra specifikusak voltak, azaz a pektinolitikus aktivitás Klebsiella spp. és Stenotrophomonas spp. törzsek (1. kiegészítő táblázat). Ezenkívül több törzs többszörös hidrolitikus képességet mutatott: az izolátumok 31% -a ≥ 4 aktivitást mutatott, és ezek közül 13 törzs mutatott multiaktivitási profilt, ami pozitív eredményt adott 5 vagy 6 aktivitáshoz az általunk elvégzett 11 közül (1. kiegészítő táblázat) . Végül megvizsgáltuk az EPS termelési képességét 59 pozitív törzs előállítására (a gyűjtemény 30% -a; 2. ábra).

Pontosan megállapítottuk, hogy a specifikus lebontási aktivitáshoz dúsított tenyészetekből nyert baktériumok nem mindegyike mutatta a várt enzimatikus aktivitást specifikus lemezalapú vizsgálatokkal tesztelve (1. kiegészítő táblázat). Ennek oka valószínűleg a szerves anyagok szivárgása az eredeti homogenizátumokból a hígítási/dúsítási fázisok során, vagy a kísérő törzsek jelenléte a dúsító kultúrákban, amelyek képesek fenntartani a nem hidrolitikusak növekedését.

A baktériumtörzsek kiegészítésének hatása a lárva fejlődésére

A nagyobb számú metabolikus aktivitással rendelkező 13 izolátum közül két szinergetikus és komplementer képességet mutató törzset választottunk ki a perspektívában, hogy megvizsgáljuk a baktériumok által közvetített metabolikus hozzájárulást a holobionthoz. A két törzs a gyűjtemény legjobban képviselt filogenetikai csoportjaihoz, azaz Bacillusokhoz és Gamma-proteobaktériumokhoz tartozott. Bacillus licheniformis A HI169 megmutatta a cellulóz és a keményítő lebontásának képességét, uricolitikus aktivitást mutatott, képes volt ammóniát felszabadítani, 80-at feloldani és EPS-t termelni. Stenotrophomonas maltophilia A HI121 fordítva képes megemészteni a kazeint, felszabadítani az ammóniát, lebontani a szerves foszfort, lebontani a pektint, és lipáz aktivitással rendelkezik (1. kiegészítő táblázat). A két törzs közötti közvetlen antagonista lemezvizsgálatokban nem észleltünk gátlást, ami megerősítette annak lehetőségét, hogy kombináljuk őket etetési kísérletekben (kezelés „B. licheniformis HI169 + S. maltophilia HI121 ”). A kiválasztott törzseket ezért orálisan, önmagukban vagy kombinációban adtuk be a BSF 9 napos lárváknak, amelyeket táplálkozási szempontból nem megfelelő étrenden tartottak (FD) (Jucker et al., 2017): a lárvák növekedési sebessége és végső tömege valamint a prepupális megjelenést, valamint a baba súlyát és hosszát a rovarfejlődési ciklus alatt követtük nyomon (3., 4. ábra).

3. ábra. A baktériumok beadását követően a lárva végső tömege és növekedési sebessége. (A) A különböző kezelésekhez 10 lárva grammban megadott végső tömegét mutatjuk be. (B) 10 nem steril gyümölcsalapú étrenden tenyésztett 10 BSF lárva növekedési üteme a kiválasztott baktériumtörzsekkel vagy anélkül. A vízszintes tengely az időt (napokat) jelzi, míg a függőleges tengely 10 lárva (gramm) tömegét jelzi. Kontroll: nem steril étrend kiválasztott törzsek nélkül; DH5α: a külső törzsből táplált lárvák E. coli DH5a pKan (DsRed); HI121: lárvák hozzáadva S. maltophilia HI121 törzs; HI169: lárvák kiegészítve B. licheniformis HI169 törzs; A HI169 + HI121 lárvák a két kiválasztott törzzsel táplálkoztak.

4. ábra. A baba súlya, hossza és megjelenése a baktériumok beadását követően. (A) A baba súlya és (B) hosszát mutatják be a különböző kezeléseknél. (C) A prepupalis megjelenést az egyes kezelések populációján belüli progresszív átlagos százalékokként jelentik. Kontroll: nem steril étrend kiválasztott törzsek nélkül; DH5α: a külső törzsből táplált lárvák E. coli DH5a pKan (DsRed); HI121: lárvák hozzáadva S. maltophilia HI121 törzs; HI169: lárvák kiegészítve B. licheniformis HI169 törzs; A két kiválasztott törzzsel táplált HI169 + HI121 lárvák.

A baktérium-kiegészítés szignifikánsnak bizonyult a lárva végső tömegének meghatározásában (ANOVA, F4,10 = 16; o Kulcsszavak: fekete katona légy, hulladékértékesítés, tápanyagok újrafeldolgozása, lárva súlya, baba súlya, baktériumok izolálása, probiotikumok

Idézet: Callegari M, Jucker C, Fusi M, Leonardi MG, Daffonchio D, Borin S, Savoldelli S és Crotti E (2020) A tenyésztett bélbaktériumok közösségének hidrolitikus profilja Hermetia illucens. Elülső. Microbiol. 11: 1965. doi: 10.3389/fmicb.2020.01965

Beérkezett: 2020. március 30.; Elfogadva: 2020. július 24.;
Megjelent: 2020. augusztus 12.

Adly M. M. Abdalla, Nemzetközi Atomenergia Ügynökség, Ausztria

Henry Joseph Oduor Ogola, Jaramogi Oginga Odinga Természettudományi és Műszaki Egyetem, Kenya
Martin Kaltenpoth, a mainzi Johannes Gutenberg Egyetem, Németország
Leen Van Campenhout, KU Leuven, Belgium