A hím elhízás hatása a spermiumokra és a következő generációs köldökvér DNS metilációjára

Szerepek vizsgálata, módszertan, validálás, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Humius Genetikai Intézet, Julius Maximilians Egyetem, Würzburg, Németország

Szerepek Formális elemzés

Hius Genetikai Intézet, Julius Maximilians Egyetem, Würzburg, Németország

Tartozási termékenységi központ; Wiesbaden, Németország

Szerepek konceptualizáció, finanszírozás megszerzése, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Hius Genetikai Intézet, Julius Maximilians Egyetem, Würzburg, Németország

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, felügyelet, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Humángenetikai Intézet, Julius Maximilians Egyetem, Würzburg, Németország, Egészségügyi és Élettudományi Főiskola, Hamad Bin Khalifa Egyetem, Oktatási Város, Doha, Katar

Ramya Potabattula,
Marcus Dittrich,
Martin Schorsch,
Thomas Hahn,
Thomas Haaf,
Nady El Hajj

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Potabattula R, Dittrich M, Schorsch M, Hahn T, Haaf T, El Hajj N (2019) A férfiak elhízási hatásai a spermiumokra és a következő generációs nátrium-vér DNS metilációjára. PLoS ONE 14 (6): e0218615. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0218615

Szerkesztő: Yvonne Böttcher, Osloi Egyetem, NORVÉGIA

Fogadott: 2019. január 7 .; Elfogadott: 2019. június 5 .; Közzétett: 2019. június 27

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a kéziratban és annak kiegészítő információs fájljaiban található.

Finanszírozás: R.P.-t a német kiválósági kezdeményezés ösztöndíjasa támogatta a Würzburgi Egyetem Élettudományi Doktori Iskolájával. Ezt a tanulmányt támogatta a Német Kutatási Alapítvány (EL 742/1-1 támogatás az N.E.H. számára) és az Európai Unió (ERAofART T.Hf. részére). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Rövidítések: ART, asszisztált reproduktív technológia; BMI, testtömeg-index; DLK1, delta-szerű 1 homológ; dNTP-k, dezoxiribóz-nukleozid-trifoszfátok; EDTA, etilén-diamin-tetraecetsav; EWAS, az epigenom egészére kiterjedő asszociációs vizsgálat; FCB, magzati köldökvér; FDR, hamis felfedezési arány; HCl, hidrogén-klorid; HIF3A, hipoxiában indukálható 3-as faktor alfa; HNA, a nem nyomott allél hipermetilezése; ICSI, intracitoplazmatikus spermium injekció; IG DMR, intergenikus, differenciálisan metilezett régió; IGF2, inzulinszerű növekedési faktor 2; IUGR, intrauterin növekedési korlátozás; IVF, in vitro megtermékenyítés; MEG-ek, anyai úton expresszált gének; MEST, mezoderm specifikus átirat; MgCl2, magnézium-klorid; NaCl, nátrium-klorid; NNAT, neuronatin; PCR, polimeráz láncreakció; PEG-k, apai úton expresszált gének; POMC, pro-opiomelanokortin gén; SDS, nátrium-dodecil-szulfát; SGCE, epsilon szarkoglikán; SNRPN, kis nukleáris ribonukleoprotein N polipeptid; WHO, a világ egészségügyi szervezete

Bevezetés

Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) adatai szerint az elhízás világszerte elterjedtsége 1980 óta csaknem megduplázódott. Az elhízást komplex, sokrétű betegségnek tekintik, amely számos tényezővel rendelkezik, beleértve a viselkedési és öröklődő okokat is [1]. Az elhízás becsült örökölhetősége körülbelül 75%, mindazonáltal az eddig azonosított genetikai variánsok az egyéni testtömeg-index (BMI) szintek és súlyváltozás kevesebb, mint 30% -át magyarázhatják [2]. A közelmúltban számos kutatási erőfeszítés arra összpontosított, hogy van-e olyan epigenetikai alap, amely befolyásolja az anyagcserezavarok kockázatát [3]. Egy nagy multicentrikus epigenómára kiterjedő asszociációs vizsgálat (EWAS) a hipoxia által indukálható 3-as faktor alfa (HIF3A) gén fokozott metilációját azonosította a vérben és a zsírszövetben, ami a megnövekedett BMI-vel társulhat [4]. Ezenkívül a pro-opiomelanocortin génben (POMC) egy változóan metilezett régió szabályozza az emberi testtömeg szabályozását [5].

A lenyomott génekről ismert, hogy a korai embriogenezis során elkerülik a metiláció átprogramozásának hullámát, és az epigenetikai információ hordozóiként javasolták őket a következő generációba [20]. Ennek eredményeként az imprintált gének bármely epigenetikai változása továbbterjedhet a csírasejteken keresztül, ezáltal hozzájárulva a betegség későbbi kockázatához. Az impresszummal jelölt lókuszok az anya vagy az apai allél epigenetikus elnémításával szabályozott, szülőtől származó, függő expressziót mutatnak. A metilációs jelek stabilan öröklődnek a csíravonalon keresztül, ami minden szomatikus szövetben monoallél expressziót eredményez [21]. Az impresszált gének jól ismertek a magzati növekedés szabályozására, ahol a szülői „konfliktuselmélet” azt javasolja, hogy az apai úton expresszált gének (PEG) elősegítsék az anya táplálékszerzését, míg az anyai úton expresszált gének (MEG) korlátozzák az utódok erőforrás-felhasználását [22]. Ismert, hogy a kinyomtatott gének fontos szerepet játszanak a biológiai folyamatok és betegségek széles körében, ideértve az intrauterin növekedés korlátozását (IUGR), az elhízást és a cukorbetegséget [23].

A hím elhízáshoz kapcsolódó spermiumváltozások és epigenetikus átvitelük következő generációba történő tanulmányozásához mélyreható metilációs elemzést végeztünk négy anyai lenyomatú gén, három apai lenyomatú góc szabályozási régióiban, valamint a hipoxiában indukálható 3-as faktor alfa-ban alegység (HIF3A) 294 humán spermiumminta nagy csoportjában in vitro megtermékenyítésen (IVF) vagy intracitoplazmatikus spermium injekción (ICSI) keresztül, valamint az utódaik összegyűjtött magzati vérében (FCB), amikor élő születés történt.

Anyagok és metódusok

Etikai jóváhagyás és hozzájárulás a részvételhez

A Würzburgi Egyetem orvosi karának etikai bizottsága jóváhagyta ezt a tanulmányt az emberi spermiumok és a magzati agy vérmintáiról (117/11. És 212/15. Sz.). Az összes résztvevő pártól írásos beleegyező nyilatkozatot gyűjtöttek.

Tanulmányminták

Az IVF/ICSI után a megmaradt úszó spermiumfrakciókat (anyagfelesleg) a Wiesbaden-i Fertility Center-ben összegyűjtötték, álnévvel azonosították és -80 ° C-on lefagyasztották további felhasználásig. Ebben a tanulmányban az emberi spermium kohorsz összesen 294 mintából állt, beleértve a 103 hím spermáját, ahol az asszisztált reprodukciós technológia (ART) után élve született. Sikeresen megszereztük a magzati kötél vérmintáit az együttműködő szülészeti klinikákon Németország-szerte. Az élveszületést követően a sikeres IVF/ICSI után összesen 113 FCB mintát (köztük 10 ikerpárt) gyűjtöttek újszülöttektől.

Genomikus DNS izolálás és nátrium-biszulfit konverzió

Biszulfit-piroszekvenálás

Az alapozó tervezéséhez (S1 táblázat) a Pyro-Mark Assay Design 2.0 szoftvert (Qiagen, Hilden, Németország) használtuk. Négy apán expresszált gén metilációs szintje PEG1/mezoderma specifikus transzkriptum (MEST), PEG4/kis magi ribonukleoprotein N polipeptid (SNRPN), PEG5/neuronatin (NNAT) és PEG10/epsilon szarkoglikán (SGCE), három apánál különböző módon lokalizált H19 intergen metilált régiót (IG DMR), inzulinszerű növekedési faktort 2 (IGF2), differenciálisan metilált 0 régiót (DMR0), és MEG3-IG DMR-t, valamint egy nem nyomott HIF3A gént számszerűsítettünk. A vizsgálatokat 0%, 25%, 50%, 75% és 100% metilezés metilációs standardok alkalmazásával állítottuk össze. Az egyes minták polimeráz láncreakcióját (PCR) 25 μl reakcióban hajtottuk végre, amely 2,5 μl 10x PCR puffert tartalmaz MgCl2-mal, 0,5 μl (10 mM) dNTP-ket, 1,25 μl (10 pmol/ml) mindkét fordított és előreindító primert, 0,2 μl (5). U/μl) FastStart Taq DNS-polimeráz (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország), 1 μl (

25 ng) biszulfit által konvertált DNS és 18,3 μl dH2O. A piroszekvenálást Pyro Q-CpG szoftverrel (Qiagen, Hilden, Németország) és PyroMark Gold Q96 CDT reagenskészlettel végeztük a PyroMark Q96 MD rendszeren. Metilálatlan és teljesen metilezett DNS-standardokat (Qiagen, Hilden, Németország) használtunk kontrollként minden piroszekvenálási futtatásban.

Statisztikai analízis

Az FCB adatokhoz a középtartományban lenyomott gének metilációs értékeivel többváltozós regresszióanalízist alkalmaztunk klasszikus lineáris modellek alkalmazásával. Benjamini és Hochberg módszerével többször elvégezték a hibás felfedezési arány (FDR) korrekcióját. A regressziós modellek magukban foglalták a gyermek születési súlyát és terhességi hetét, apai és anyai életkorát, apai és anyai BMI-jét, valamint a gyermek nemét, beleértve az apai, valamint az anyai BMI és a gyermek nemének kölcsönhatását, hogy lehetővé tegyék az apai és a gyermek eltérő anyai BMI az FCB nemei között.

Eredmények

A vizsgálatban szereplő minták jellemzői

A testtömeg-indexet (BMI) a résztvevő egyedek mért súlya (kilogrammban) és magassága (centiméter) alapján számítottuk ki. A WHO felnőttek BMI-besorolására vonatkozó irányelvei alapján a 294 spermiumminta közül egy minta (0,34%) 17,30 BMI-vel esett „alsúlyú” osztályba; 144 minta (48,97%) a „normál súlyú” osztályban (BMI: 19,00–24,90); 149 minta (50,68%) a ’Pre-obesity/obesity’ osztályban (BMI: 25.00–40.30). Pontosabban: 120 minta volt „elhízás előtti” (BMI: 25,00–29,90), a fennmaradó 29 mintát pedig elhízottnak (BMI: 30,00–40,30) sorolták. Az FCB vizsgálati kohorsz összesen 113 összegyűjtött FCB mintát (köztük 10 ikerpárt) tartalmazott utódoktól, akiket a sikeres IVF/ICSI után 294 spermadonorból 103-an születtek. Közülük 54 minta (47,79%) nő, 59 minta (52,21%) férfi volt. A születési súly szignifikánsan korrelált a gyermek terhességi hetével (rho = 0,67, p 1. táblázat. A sperma és a magzati agy vérmintáinak klinikai paraméterei.

A releváns demográfiai adatok, amelyeket a vizsgált spermium- és magzati vérminták regressziós modelljeiben figyelembe vettek.

A spermium DNS metilációs aláírásai korrelálnak a donor BMI-jével

A donor testtömeg-indexének (kg/m 2) korrelációja a spermában lévő nyolc elemzett amplikon DNS-metilációjával (%). A modellt a spermiumok koncentrációjához, a donor életkorához és az ART sikerességéhez igazították.

Az apai BMI-hatások átadása a spermiumról a következő generációra, nemekre jellemző módon

A MEG3-IG DMR, a HIF3A, az IGF2 és az NNAT metiláció és az apai BMI közötti korrelációt mutató szóródási diagramok a hím magzati kábel vérében (felső panel) és a női magzati kábel vérében (alsó panel). A diagram egyes pontjai több célzott CpG átlagos metilációját mutatják be az egyes kordnövényes vérmintákban a biszulfit-piroszekvenálással végzett mérés után. A regressziós vonal a korreláció irányát sugallja az apai BMI-vel. A RE minden egyes ábrán a regresszió becslését jelzi.

Az apa testtömeg-indexének (kg/m 2) korrelációja nyolc elemzett amplikon DNS-metilációjával (%) a következő generációs magzati köldökvérmintákban. A modell magában foglalta a gyermek születési súlyát és terhességi hetét, apai és anyai életkorát, az anyai BMI-t és a gyermek nemét, beleértve az apai BMI és a gyermek neme közötti kölcsönhatást, hogy lehetővé tegye az apai BMI változó hatását az FCB nemei között.

Az anya testtömeg-indexének (kg/m 2) korrelációja nyolc elemzett amplikon DNS-metilációjával (%) a következő generációs magzati köldökvérmintákban. A modell magában foglalta a gyermek születési súlyát és terhességi hetét, apai és anyai életkorát, apai BMI-jét és a gyermek nemét, beleértve az anyai BMI és a gyermek neme közötti kölcsönhatást, hogy lehetővé tegye az anyai BMI változó hatását az FCB nemei között. A vizsgált amplikonok egyike sem mutatott összefüggést a köldökvér metilációja és az anyai BMI között.

Vita

Továbbá azonosítottuk, hogy az elhízással kapcsolatos HIF3A gén DNS-metilációs szintje pozitív összefüggést mutat az apa BMI-jével a férfi gyermekek kordnövényében (p-érték = 0,041). Korábban a felnőttek teljes vérében és zsírszövetében végzett DNS-metiláció nagy kiterjedésű, az egész epigenomot átfogó vizsgálata (a jelen tanulmányban szereplő spermiumokkal és köldökvérrel ellentétben) szignifikáns összefüggést mutatott ki a BMI és a metiláció között három CpG-helyen a HIF3A első intronjában ]. Számos tanulmány megismételte a fent említett asszociációt a HIF3A lokuszban különböző szöveteken, beleértve az újszülöttek köldökzsinór DNS-ét [30–33]. Míg az egyik tanulmány arról számolt be, hogy a HIF3A gén vér DNS-metilációja és a donor BMI közötti összefüggés erősebb volt a fiatal korú (≤ 66 éves) populáció részcsoportjában [34], egy másik jelentés nem talált összefüggést a kettő között [35]. Jelen tanulmányunk eredménye ellentmond a szülői BMI és az utódok HIF3A metilációja között megfigyelt összefüggéseknek egy Richmond és mtsai (2016) tanulmányában. [36] Itt a szerzők a metilációt az Infinium HM450 BeadChip tömb felhasználásával mérték

1000 minta és egyesületeket vizsgált egyedi CpG szinten, azonban nem hajtottak végre nemspecifikus tesztet az utódokban [36]. Továbbá megmértük az IVF/ICSI után született gyermekek metilációját a köldökzsinór vérében, ami további zavaró tényező lehet tanulmányunkban. Fontos hangsúlyozni, hogy a korábbi jelentések a jelenlegi tanulmány mellett csak a HIF3A metiláció és a BMI szint közötti összefüggéseket vizsgálták, amelyek nem jelzik a HIF3A metilációjának elhízásváltozásainak okozati összefüggését. Az emberi vér [34–36] és a spermium [19] korábbi vizsgálataihoz hasonlóan a bemutatott adatok is alátámasztják azt az elképzelést, hogy a (HIF3A és más gének) DNS-metilációja inkább a hatás, mint a megnövekedett BMI oka volt.

Következtetések

Ebben a tanulmányban a spermium epigenetikus változásaira összpontosítottunk a donor BMI-jével kapcsolatban, és arra, hogy ezek a változások átterjedhetnek-e az utódokra. Finom metilációs elváltozásokat azonosítottunk a donor BMI-jével a hím spermiumokban az apánként benyomott MEG3-IG DMR lokuszon. Nemi specifikus összefüggést figyeltek meg az MEG3-IG DMR, HIF3A és IGF2 DMR0 DNS metilációja között az utódok köldökvérében és az apai BMI-ben. Eredményeink azt mutatják, hogy a hímek elhízása befolyásolhatja a spermiumok DNS-metilációs programozását és a következő generáció epigenomját is. Ezek a megállapítások összhangban vannak az emberen végzett korábbi kutatásokkal [17, 19, 37, 39]. Az epigenetikus öröklés segíthet megmagyarázni az elhízás növekvő előfordulását világszerte, amely önmagában nem tulajdonítható genetikai tényezőknek. Mindazonáltal továbbra is be kell mutatni, hogy ezek a változások befolyásolhatják-e az utódok felnőttkori felnőttkori elhízás kialakulásának kockázatát. A kérdés megválaszolásához tanulmányozott kohorszunk hosszirányú követésére van szükség.

Segítő információ

S1 táblázat. A biszulfit-piroszekvenáláshoz használt PCR és szekvenáló primerek.

Az S1 táblázat a polimeráz láncreakció és a biszulfit piróz szekvenálás előremenő és reverz primereit mutatja a tanulmányban elemzett mind a nyolc amplikon esetében. A csillag által jelzett primereket az 5 ’végén biotinilezzük, a kromoszóma elhelyezkedése pedig az Ensembl 89-es felszabaduláson alapul.

S1 fájl. DNS-metilációs összefüggések a zavaró tényezőkhöz való igazodás nélkül.

Az S1 fájl a metilációs statisztikákat mutatja, amikor a DNS-metiláció korrelál a BMI-vel anélkül, hogy bármilyen zavaró tényezőhöz igazodna.

S2 fájl. DNS-metilációs összefüggés a spermium és a köldökvér között.

Az S2 fájl mutatja a spearman rangsorrelációját a spermium DNS-metilációs szintjeivel és a megfelelő köldökvérmintákkal.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk a vizsgálatban résztvevő összes párnak és szülészeti klinikának.

Hivatkozások

Tárgyterületek

A PLOS tárgyterületeivel kapcsolatos további információkért kattintson ide.

Szeretnénk visszajelzését. Van-e értelme ezeknek a tárgyköröknek a cikk számára? Kattintson a célra a helytelen Tárgy mellett, és tudassa velünk. Köszönöm a segítséget!

A tárgykör "DNS-metilezés" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Sperma" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Testtömeg-index" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Vér" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Elhízottság" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Epigenetika" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Gyermekkori elhízás" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Regresszió analízis" alkalmazható erre a cikkre? igen nem