A hosszú távú alacsony szénhidráttartalmú étrend káros anyagcsere-megnyilvánulásokhoz vezet a cukorbeteg egerekben

Harmadik Belgyógyászati Klinika, Cukorbetegség, Endokrinológia és Metabolizmus Osztály, Kyorin Egyetem Orvostudományi Kar, Mitaka, Tokió, Japán

A Kyorin Egyetem Orvostudományi Egyetem Anatómiai Tanszéke, Mitaka, Tokió, Japán

Shiga Orvostudományi Egyetem Orvostudományi Tanszéke, Otsu, Japán Shiga

Molekuláris Biológia Tartományi Osztály, Genomkutató Intézet, Tokushima Egyetem, Kuramoto, Tokushima, Japán

Harmadik Belgyógyászati Klinika, Cukorbetegség, Endokrinológia és Metabolizmus Osztály, Kyorin Egyetem Orvostudományi Kar, Mitaka, Tokió, Japán

A Kyorin Egyetem Orvostudományi Egyetem Anatómiai Tanszéke, Mitaka, Tokió, Japán

Molekuláris Biológia Tartományi Osztály, Genomkutató Intézet, Tokushima Egyetem, Kuramoto, Tokushima, Japán

Harmadik Belgyógyászati Klinika, Cukorbetegség, Endokrinológia és Metabolizmus Osztály, Kyorin Egyetem Orvostudományi Kar, Mitaka, Tokió, Japán

Keiko Handa,
Kouichi Inukai,
Hirohisa Onuma,
Akihiko Kudo,
Fumiyuki Nakagawa,
Kazue Tsugawa,
Atsuko Kitahara,
Rie Moriya,
Kazuto Takahashi,
Yoshikazu Sumitani

Javítás

2016. május 16 .: Handa K, Inukai K, Onuma H, Kudo A, Nakagawa F és mtsai. (2016) Javítás: A hosszú távú alacsony szénhidráttartalmú étrend káros anyagcsere-megnyilvánulásokhoz vezet a cukorbeteg egerekben. PLOS ONE 11 (5): e0155751. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155751 Javítás megtekintése

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Handa K, Inukai K, Onuma H, Kudo A, Nakagawa F, Tsugawa K és mtsai. (2014) A hosszú távú alacsony szénhidráttartalmú étrend káros anyagcsere-megnyilvánulásokhoz vezet a diabéteszes egerekben. PLoS ONE 9 (8): e104948. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104948

Szerkesztő: Julie A. Chowen, Hosptial Infantil Universitario Niño Jesús, CIBEROBN, Spanyolország

Fogadott: 2014. március 25 .; Elfogadott: 2014. július 14 .; Közzétett: 2014. augusztus 29

Adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az eredmények alapjául szolgáló összes adat korlátozás nélkül teljes mértékben elérhető. Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt a Grant-in-Aid for Scientific Research támogatta. 25350898 (a KI-nek) a japán oktatási, kulturális, sport-, tudományos és technológiai minisztériumtól. URL: http://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzőknek nem jelentenek a cikk szempontjából releváns összeférhetetlenséget.

Bevezetés

Az elmúlt évtizedben a megfelelő étrendi beavatkozások azonosítása vita forrása volt. Az alacsony szénhidráttartalmú étrend figyelem középpontjába került. Az alacsony szénhidráttartalmú étrend terápiás hatásait számos klinikai állapotban kiterjedten vizsgálták, ideértve az elhízást, az anyagcserezavarokat, a szív- és érrendszeri eseményeket és a mortalitást [1], [2], [3], [4], [5], [6], [ 7]. Legfeljebb egy évig tartó rövid távú vizsgálatokban [1], [2], [3] a mediterrán vagy más alacsony szénhidráttartalmú étrendet fogyasztó elhízott betegek kedvezőbb feltételeket mutattak az elhízás, a diszlipidémia és a glikémiás kontroll szempontjából. A levont következtetéseket azonban korlátozta a vizsgálat megtervezése, vagyis kis szám, rövid időszakok és a speciális étrendek rossz betartása. Az alacsony szénhidráttartalmú étrend hosszú távú biztonságosságát és hatékonyságát a szív- és érrendszeri betegségek kockázatának kezelésében még meg kell határozni.

A közelmúltban egy prospektív kohortvizsgálatban [4] kimutatták, hogy az alacsony szénhidráttartalmú és magas fehérjetartalmú étrend a szív- és érrendszeri betegségek fokozott kockázatával jár. Sőt, a korlátozott szénhidráttartalmú étrendről számoltak be, hogy növeli a mortalitást [5]. Így klinikailag az alacsony szénhidráttartalmú étrend káros hatásait az elmúlt években megállapították. Az a tudományos mechanizmus azonban, amely révén az alacsony szénhidráttartalmú étrend negatív hatást gyakorol az érrendszer egészségére, továbbra sem foglalkozik.

Eddig a legtöbb rágcsáló-tanulmány egy rendkívül alacsony szénhidráttartalmú, magas zsírtartalmú étrendre (HFD), az úgynevezett ketogén étrendre (KD) összpontosított [8], [9], [10], [11]. Ezek az egerek fogyást mutattak, valószínűleg a csökkent táplálékfelvétel miatt [8], [9]. Valójában az étkezési szénhidrát csökkenése az étkezési zsír és fehérje növekedésével jár. Mindazonáltal lehetetlen lenne, hogy a betegek hosszabb ideig folytassák a KD fogyasztását. Gyakorlati szempontból alacsony szénhidráttartalmú étrendet kell mérsékelten magas zsírösszetétellel vizsgálni rágcsáló modellekben.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Az összes állatprotokollt a Kyorin Egyetem laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató szerint hajtották végre. A protokollt a Kyorin Egyetem állatkísérlet-etikai bizottsága hagyta jóvá (Jóváhagyott szám: 2014-152).

Állatok

Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt és inzulin tolerancia teszt

A glükóz tolerancia tesztek céljából az egereket 8 órán át éheztettük, és intraperitoneálisan 10% glükóz oldatot adtunk be (2 mg/g test vad típusú egereknél, 1,5 mg/g test test diabéteszes egereknél) a korábban leírtak szerint [13]. A glükózméréseket az injekció beadása előtt, valamint az injekció beadása után 30, 60 és 120 perccel végeztük. Az inzulin tolerancia tesztek céljából az étkezés utáni állapotban lévő egereket intraperitoneálisan 1,0 U/kg test testinzulinnal injektálták (Eli Lilly, Indianapolis, IN, USA). A glükózméréseket az injekció beadása előtt, valamint az injekció beadása után 30, 60 és 90 perccel végeztük. A plazma glükózszinteket glükózanalizátorral mértük (Sanwa Kagaku Kenkyusho, Co., Nagoya, Japán).

Az orvosbiológiai markerek mérése

A leölés előtt az állatokat 8 órán át éheztettük. A vérmintákat szívpunkcióval vettük fel heparinizált fecskendőkkel, és 5 percig 12 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A szérum lipid elemzéseket a Skylight-Biotech Analysis Center-ben (Akita, Japán) végeztük. A hormonkoncentrációkat kereskedelemben kapható módszerekkel mértük, azaz az immunreaktív inzulint (IRI) radioimmunassay-vel (Morinaga Institute of Biological Science, Inc., Yokohama, Japán) és a szérum fibroblast 21-es növekedési faktort (FGF21) Quantikine ELISA egér/patkány segítségével mértük. FGF-21 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). A máj triglicerideket (TG) Bligh és Dyer [14] módszereivel extraháltuk, és a TG kereskedelemben kapható reagensével elemeztük (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japán). A vizeletet ketonok, kreatinin és albumin szempontjából standard laboratóriumi módszerrel elemeztük.

Zsírsav-analízis HPLC segítségével

A máj mRNS és fehérjék mennyiségi elemzése

Immunhisztokémia máj oxidatív stressz markerekhez (4-HNE és 8-OHG)

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SE-ként mutatjuk be. Folyamatos változók log transzformációját alkalmazták, amikor a paraméteres tesztek elosztási követelményeinek kielégítésére volt szükség. Két csoport összehasonlítását Student t-teszttel végeztük. Három csoport összehasonlításakor egyirányú ANOVA-t használtak a Tukey-próbával. A P érték 1. ábra. Testtömeg-változások, májsúly, epididymális zsírtömeg és máj TG-tartalom minden csoportban (n = 6).

(A) A vad típusú (bal oldali panel), az STZ (középső panel) és a KKAy (jobb oldali panel) egereket standard etetéssel (SC étrend, folytonos vonalak), alacsony szénhidráttartalmú (LC diéta, szaggatott vonalak) vagy súlyosan szénhidráttartalmú étrend (SR diéta, szaggatott vonalak) 16 hétig. A máj végén (B), az epididymális zsírsúlyban (C) és a máj TG-tartalmában (D) minden csoportban elemeztük a vizsgálat végén (1. sor: WSC, 2. sor: WLC, 3. sor: WSR, 4. sor: SSC), 5. vonal: SLC, 6. vonal: SSR, 7. vonal: KSC, 8. vonal: KLC, 9. vonal: KSR). * p 2. táblázat: Az egyes csoportok biokémiai paraméterei.

Az intraperitoneális glükóz tolerancia tesztben a WSR és a KSR markáns glükóz intoleranciát mutatott, összehasonlítva a WSC és a KSC egerekkel (2A., 2B. Ábra). Az STZ egereknél nem volt szignifikáns különbség a három étrend között, ami arra utal, hogy az inzulinhiány miatti glükóz tolerancia romlása olyan szembetűnő, hogy a glükóz intoleranciára gyakorolt étrendi hatás elhanyagolható lehet. Az inzulin tolerancia tesztben (2C. Ábra, 2D. Ábra) az SR táplálékkal táplált egerekben csökkent az inzulinérzékenység az SC étrendet kapókhoz képest, és ez a csökkenés a diéta szénhidrát mennyiségétől függ. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az alacsony szénhidráttartalmú étrend káros hatással van az inzulinérzékenységre mind a cukorbeteg, mind a nem cukorbeteg egerekben.

(A) Az SC táplálékkal táplált egereket (folytonos vonalak), az LC étrendet (szaggatott vonalak) és az SR étrendet (szaggatott vonalak) 8 órán át éheztettük, és intraperitoneálisan glükózoldatot adtunk be (vad típusú egereknél 2 mg/g test, vad típusú egereknél 1,5 mg/g · test cukorbeteg egerek számára). (B) A görbe alatti területet (AUC) kiszámítottuk a glükóz tolerancia romlás mértékének mérésére. (C) Az étkezés utáni állapotban lévő egereknek intraperitoneálisan 1,0 U/kg test humán inzulint adtak be. (D) Az AUC-t kiszámították az inzulin tolerancia károsodásának mértékének mérésére. * p 3. ábra A glükóz intolerancia okának szűrése különböző gének májtranszkripciós szintjének vizsgálatával vad típusú, STZ és KKAy egerekben SC vagy SR étrenddel etetve.

Az SC vagy SR étrenddel táplált vad típusú (A), STZ (B) és KKAy (C) gének mindegyikének máj mRNS-expresszióját RT-PCR-rel értékeltük, és az SR-vel etetett egerekhez képest a növekedés számának növekedése volt diéta. * p 4. ábra: Máj mRNS expresszió és az FGF21 szérumszintje.

A vad típusú (A), STZ (B) és KKAy (C) egerek FGF21 mRNS szintjét kvantitatív valós idejű PCR-rel elemeztük. A szérum FGF21 szinteket (D) ELISA készlet segítségével mértük (1. vonal: WSC, 2. vonal: WLC, 3. vonal: WSR, 4. vonal: SSC, 5. vonal: SLC, 6. vonal: SSR, 7. vonal: KSC, 8. vonal: KLC, 9. vonal: KSR egerek). * p 5. ábra. A PGC1α mRNS- és fehérjeszintje WAT-ban.

(A) A vad típusú és a KKAy egerek PGC1a mRNS-szintjét RT-PCR-rel elemeztük. * p 6. ábra: Hepatic SCD1 mRNS és fehérje szintek vad típusú, STZ és KKAy egerekben.

A C16: 1/C16: 0, C18: 1/C18: 0 (A) és C18: 0/C16: 0 (B) arányokat a szérum zsírsavanalízis adatai alapján számoltuk (1. sor: WSC, 2. vonal: WLC, 3. vonal: WSR, 4. vonal: KSC, 5. vonal: KLC, 6. vonal: KSR). Az összes egér modell SCD1 (C) és Elovl6 (D) mRNS szintjét kvantitatív, valós idejű PCR-rel elemeztük (fehér sáv: egerek táplálták SC diétát, szürke sáv: egerek táplálták LC diétát, fekete sáv: egerek táplálták az SR étrendet) . A vad típusú (E), az STZ (F) és a KKAy (G) egerek máj SCD1 fehérje szintjét Western-blottolással elemeztük. A középső paneleken reprezentatív adatokat (csoportonként két mintát) mutatunk be. Az alsó paneleken minden oszlop az átlag ± S.E. 6 egérből nyertük (fehér sáv: egerek táplálták az SC étrendet, szürke sáv: egerek táplálták az LC diétát, fekete sávok: az egerek etették az SR diétát) A felső paneleken a belső kontroll látható anti-β aktin antitest alkalmazásával. * p 7. ábra. Immunhisztokémia 4-HNE és 8-OHG esetében.

Minden állat három metszetét (n = 3) véletlenszerűen választottuk ki és fényképeztük mikroszkóppal. Az eredeti nagyítás × 50. A festés intenzitását Image J. alkalmazásával számszerűsítettük. A színes képeket először szín dekonvolúciónak vetettük alá, G. Landini plugin segítségével külön képeket kaptunk a DAB-ról és a hematoxilin szürkeskálában. Megmértük a DAB festés átlagos optikai sűrűségét a citoplazmában a 4-HNE (A) és a magok területén a 8-OHG (B) esetében, hematoxilin képekből létrehozott magok bináris maszk képeit alkalmazva, és értékeltük a festés intenzitását . A felső panelek negatív kontrollok, elsődleges antitest hiányzik. A vad típusú (középső panelek) és a KKAy (alsó panelek) egerek egyik reprezentatív képe, táplált SC táplálékkal (bal oldali panelek: hematoxylin festés nélkül, középső panelek: hematoxilin festéssel) és az SR diéta (jobb oldali panelek: hematoxylin festéssel). bemutatott. A jobb oszlopdiagramok a festés intenzitásának átlagát mutatják. * p 3. táblázat: Az egyes csoportok zsírsav-összetétele (mg/ml).

Vita

Mivel ennek a tanulmánynak a célja egyszerűen a különböző makrotápanyagok biológiai fenotípusokra gyakorolt hatásainak vizsgálata volt vad típusú és diabéteszes egerekben, nem tudtunk megfelelő kontroll egereket előállítani, azaz STZ egereket a PBS-be injektált egerekhez képest, vagy KKAy-t a KK egerekhez képest. Megfigyeléseink tehát nem engedik következtetéseket levonni az állatmodellek közötti különbségekről. Előzetes kísérletben STZ egereket készítettünk hagyományos módszerrel [24]. Az SR diétával táplált STZ egerek (SSR egerek) azonban az injekció beadása után egy hétnél tovább nem éltek túl, ami súlyos ketoacidózisnak tulajdonítható. Így megváltoztattuk a protokollt, és kisebb mennyiségű STZ-t fecskendeztünk be, amint azt a Methods említi. Ezzel a módosítással a vizsgálatunkban alkalmazott STZ egerek kevesebb plazma glükózszint-emelkedést és magasabb éhomi inzulinszintet mutattak, mint a korábban leírt STZ egerek [24], jelezve, hogy ezek az egerek nem olyanok, mint az 1-es típusú cukorbetegség modelljei, ehelyett a 2-es típusú cukorbetegség modelljeihez hasonlítanak. β sejt kimerültség.

Vizsgálatunk egyik korlátja az, hogy nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy megfigyeléseinket befolyásolhatták a biztosított magas fehérjetartalmú étrendek, mivel a fehérje és a szénhidrát aránya fordítottan arányos. Egy nagyon friss rágcsáló-vizsgálat során kiderült, hogy a szénhidrát/fehérje arány, nem pedig a kalóriabevitel határozza meg az egerek kardiometabolikus egészségi állapotát, öregedését és hosszú élettartamát [39]. Bár eredményeink nem teszik lehetővé annak azonosítását, hogy mely makrotápanyagok, azaz alacsony szénhidráttartalmú vagy magas fehérjetartalmú egészségkárosító tényezők, figyelemre méltó, hogy eredményeink rávilágítottak a karbojidrát/fehérje arány által befolyásolt kardiometabolikus fenotípusokra.

Vizsgáltuk az alacsony szénhidráttartalmú étrend hosszú távú hatásait a diabéteszes egérmodellekre. Ezek az egerek alacsony szénhidráttartalmú étrendben táplálva glükóz-intoleranciát mutattak, csökkent az FGF21 szérumszintje, és csökkent a máj SCD1 expressziója is. Mindezek a csökkentések az étrendben lévő szénhidrát mennyiségétől függtek. Ezek a megnyilvánulások nem voltak összefüggésben a cukorbeteg egerek súlyszabályozásával. Tudomásunk szerint ez az első jelentés, amely azt jelzi, hogy az alacsony szénhidráttartalmú étrend káros metabolikus megnyilvánulásokhoz vezet a cukorbeteg egerekben, ami megmagyarázhatja az ilyen étrend szoros kapcsolatát, valamint a klinikai körülmények között megfigyelt magas kardiovaszkuláris események és morbiditás kockázatát.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Tomoko Miurának az immunhisztokémiai kísérletekhez nyújtott technikai támogatást.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: KI HK SO HI. Végezte a kísérleteket: KH AK FN KT HO AK YS. Elemezte az adatokat: RM TH. Közreműködött a kézirat megírásában: KI KT.