A hosszú távú, magas sótartalmú étrend magas vérnyomást okoz és csökkenti a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor vese expresszióját Sprague-Dawley patkányokban

Absztrakt

Arra törekszünk, hogy meghatározzuk: 1) vajon a hosszú távú magas sótartalmú étrend magas vérnyomást és vesekárosodást okoz-e Sprague-Dawley (SD) patkányokban, és 2) vajon a magas sótartalmú diéta által kiváltott magas vérnyomás és vesekárosodás összefügg-e a csökkent VEGF expresszióval. 12 tizenkét hét hetes SD patkány magas sótartalmú étrendet (HS, 8%) és tizenkét SD patkány normál sótartalmú étrendet (NS, 0,5%) kapott 8 héten keresztül. Farok mandzsetta segítségével a heti ellenőrzés azt mutatta, hogy a vérnyomás 6, 7 és 8 hét után szignifikánsan nőtt a HS csoportban, az NS csoporthoz képest (P Kulcsszavak: hosszú távú magas sótartalmú étrend, Sprague-Dawley patkány, magas vérnyomás, vese VEGF

Bevezetés

A fent említett összes megállapítás alapján feltételezzük, hogy a hosszú távú, magas sótartalmú étrend vesekárosodást és magas vérnyomást okozhat, amelyek a normotenzív rágcsálóknál, például Sprague-Dawley patkányoknál csökkent vese VEGF-expresszióval társulnak. Jelen tanulmányban arra törekszünk, hogy meghatározzuk: 1) vajon a hosszú távú magas sótartalmú étrend (8 hét) hipertóniát és vesekárosodást okoz-e Sprague-Dawley (SD) patkányokban és 2) vajon a magas sótartalmú étrend okozta magas vérnyomás és vese a sérülés a csökkent VEGF expresszióval jár együtt.

Mód

Állati jegyzőkönyv

A vérnyomás mérései

A 8 hetes kísérleti periódus alatt a szisztolés vérnyomást hetente mérték NS és HS SD patkányokban (n = 12 csoportonként) farokpletizmográfiával (IITV, Inc). 4 hetes vagy 8 hetes kísérlet után az SD patkányok mindkét csoportját (n = 6 minden csoportban) izoflurán inhalációval érzéstelenítettük gázpárologtatóval (Harvard Apparatus, Holliston, MA). Aszeptikus technikák alkalmazásával egy mikrokatétert helyeztek a nyaki artériába, és a bőr alá vezették a nyak hátsó részébe, és rögzítették. Két nappal azután, hogy a patkányok felépültek a műtét után, a katétert egy számítógépes monitorozó rendszerhez csatlakoztatták, az úgynevezett PowerLab (AD Instruments, Castle Hill, Ausztrália) helyiségbe, hogy folyamatosan regisztrálják a MAP és a pulzusszámot (HR) a tudatos SD patkányokban 4 óra/nap 2 napig. Az egyes patkányokban a MAP és a HR mérését egyidejűleg végeztük, és mindegyik patkány összes értéke a 2 napos mérések 4 óra/nap átlagát jelentette.

Northern Blot elemzés

A teljes RNS-t SD patkányok veséiből állítottuk elő (n = 6 csoportonként) 8 hét normál sós vagy magas sótartalmú étrend után módosított guanidinium-alapú módszerrel (Total RNS isolation kit, Ambion, Austin, TX), az előzőekben leírtak szerint (34) A genomi DNS-t RNáz-mentes DNáz I-gyel kezeljük, majd fenol/kloroform extrakcióval és etanollal kicsapjuk. Az RNS integritását MOPS-formaldehid-agaróz gélen ellenőriztük a cDNS-szintézis előtt. A VEGF mRNS expresszióját a vesékben Northern-blottolással vizsgáltuk, a korábban leírtak szerint (34). A VEGF cDNS próba az egér VEGF cDNS 580 bázispárnyi EcoRI-BamHl fragmense volt, amelyet pBluescrip plazmidba klónoztunk. A cDNS-próbát α-32P-dCTP-vel (New England Nuclear, Boston, MA) jelöltük Multiprime véletlenszerűen alapozott DNS-jelölő készlet segítségével (Amersham, Egyesült Királyság). A VEGF mRNS expressziójának kvantálását olyan foltok képein hajtottuk végre, amelyeket egy foszfor-képalkotó segítségével gyűjtöttünk össze (Molecular Dynamics; szoftver: ImageQuant 3.3, Molecular Dynamics). A teljes RNS relatív mennyiségének igazolásához a szűrőket 32 P-jelölt 28S rRNS antiszensz oligonukleotid próbával hibridizáltuk (Ambion). A VEGF mRNS expresszióját minden mintában 28S rRNS-sel szemben normalizáltuk.

A VEGF és az sFlt-1 fehérjeszintjének mérése ELISA módszerrel

Az SD patkányok plazmájában, vizeletében és teljes veseszövetében a VEGF és az sFlt-1 fehérje szintjét egér VEGF és egér sFlt-1 ELISA készletek (R&D Systems, Minneapolis, MN) felhasználásával határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően. Az egész vese szövetmintáit jéghideg PBS pufferben homogenizáltuk, amely proteáz inhibitor koktélt tartalmazott, és az összes fehérjét NE-PER citoplazmatikus extrakciós reagensekkel (Pierce, Rockford, IL) extraháltuk a gyártó protokollja szerint. Ezek az extrakciós reagensek nem befolyásolták a citokinek szöveti fehérjéinek mérését más szokásos fehérje-extrakciós módszerekhez képest. A szöveti felülúszó teljes fehérjekoncentrációját Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) alkalmazásával határoztuk meg. A VEGF fehérje szintjét a teljes veseszövetben normalizáltuk, és pikogrammban fejeztük ki milligramm összes szövetfehérjében.

Szövettani elemzés fénymikroszkóppal

A bal vesék közepes koronális szakaszait, amelyeket mind a normál sóval táplált, mind a magas sótartalmú csoportokból összegyűjtöttünk, pufferelt formalinban rögzítettük és paraffinba ágyazottuk a szövettani vizsgálatokhoz, a korábban leírtak szerint (20, 35). A mintákat 3 um-os metszetekre vágtuk, és periodikus sav-Schiff reagenssel (PAS) festettük, majd hematoxilin ellenfestést végeztünk. Valamennyi metszetet szemikvantitatív szövettani besorolással (0 = hiányzik, 1+ = enyhe, 2+ = mérsékelt és 3+ = súlyos) elemeztük a gyulladásos sejtekkel történő tubulointerstitialis infiltráció súlyossága, a fokális szegmentális glomerulosclerosis, a tubulointerstitialis sérülés és az extracelluláris mátrix tágulás szempontjából . Az átlagos glomeruláris területet a PAS-szennyezett részeken 30-40 glomerulus alapján határoztuk meg minden vesében a számítógép képernyőjén Image-Pro Plus szoftverrel (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD).

Statisztikai elemzések

Az összes meghatározást duplikált sorozatban hajtottuk végre. Ahol meg van jelölve, az adatokat átlag ± SE-ként adják meg. Két csoport statisztikailag szignifikáns különbségeket teszteltünk egy párosítatlan Student t-teszttel. ANOVA-t alkalmaztak két csoport közötti különbségek elemzésére, több összehasonlítással. P értéke 1 ábra A. azt mutatja, hogy a vérnyomás fark mandzsetta használatával történő heti ellenőrzésével nincs 1–5 hét alatt szignifikáns különbség a szisztolés vérnyomásban az SD patkányok NS és HS csoportjai között, de a szisztolés vérnyomás 6, 7 és 8 hét után szignifikánsan megnő. A HS csoport az NS csoporthoz képest (P Az 1B. Ábra azt mutatja, hogy a magas sótartalmú étrend 4 hete (8%) nem változtatja meg szignifikánsan a MAP-t SD patkányokban, összehasonlítva a normál sótartalmú SD patkányokkal (123 ± 6,1 vs. 118 ± 2,7 Hgmm; n = 6; P> 0,05); azonban a diétás program 8 hete után a MAP szignifikánsan magasabb a HS-ben, mint az NS csoportban (140 ± 5,3 vs. 112 ± 2,2 Hgmm; n = 6; P 0,05). Nem volt szignifikáns különbség a testtömegben a HS és a HS csoportok között (370,0 ± 8,9 vs. 359,3 ± 8,0 g; n = 6; P = 0,41).