A kalória-korlátozás csökkenti az egér és az emberi hasnyálmirigy daganatának növekedését, a nukleáris faktor-KB aktiválódását és a gyulladással összefüggő génexpressziót inzulinszerű növekedési faktor-1-függő módon

Egyformán járultak hozzá ehhez a munkához: Alison E. Harvey, Laura M. Lashinger

Táplálkozástudományi tagozat, Texasi Egyetem, Austin, Austin, Texas, Amerikai Egyesült Államok

Egyformán járultak hozzá ehhez a munkához: Alison E. Harvey, Laura M. Lashinger

Táplálkozástudományi tagozat, Texasi Egyetem, Austin, Austin, Texas, Amerikai Egyesült Államok

A Texasi Egyetem Molekuláris Karcinogenezis Tagsági Osztálya MD Anderson Rákközpont, Smithville, Texas, Amerikai Egyesült Államok

Táplálkozástudományi Tanszék, Texasi Egyetem, Austin, Austin, Texas, Amerikai Egyesült Államok, Molekuláris Karcinogenezis Tanszék, Texas Egyetem MD Anderson Rákközpont, Smithville, Texas, Amerikai Egyesült Államok

Alison E. Harvey,
Laura M. Lashinger,
Drew Hays,
Lauren M. Harrison,
Kimberly Lewis,
Susan M. Fischer,
Stephen D. Hursting

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Harvey AE, Lashinger LM, Hays D, Harrison LM, Lewis K, Fischer SM és mtsai. (2014) A kalória korlátozás csökkenti az egér és az emberi hasnyálmirigy daganata sejtjeinek növekedését, a nukleáris faktor-KB aktiválódását és a gyulladással összefüggő génexpressziót inzulinszerű növekedési faktor-1 - függő módon. PLoS ONE 9 (5): e94151. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094151

Szerkesztő: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson Egyetem, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2013. november 16 .; Elfogadott: 2014. március 11 .; Közzétett: 2014. május 7

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt az Országos Egészségügyi Intézetek (NIH) támogatása, az R01 CA135386, amelyet S.D. kapta. Hursting és S.M. Fischer és az NIH által támogatott posztdoktori ösztöndíjak, R25T CA57730 és T32 CA135386, amelyeket L. M. Lashinger kap. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A hasnyálmirigyrák a rákhoz kapcsolódó halálozás negyedik oka az Egyesült Államokban [1], 5 éves túlélési aránya csak 3-5% [2]. A legújabb epidemiológiai vizsgálatok azt sugallják, hogy az elhízás a hasnyálmirigyrák kétszer nagyobb kockázatával jár együtt mind a férfiaknál, mind a nőknél [3]. Ezenkívül 10 prospektív kohorszvizsgálat a hasnyálmirigyrák megnövekedett kockázatáról számol be olyan elhízott egyének esetében is, akiknek testtömeg-indexe (BMI) meghaladja a 30-at, az egészséges testsúlyú egyénekhez képest, akiknek a BMI-értéke 5 Panc02 egér hasnyálmirigy-adenokarcinóma sejt (Dr. J Schlom, NCI, ref [34]) a jobb szárba, majd folytatta étrendjét, és további 5 hétig ellenőrizték a tumor növekedését. A daganatokat tapintással tapasztaltuk, és hetente Vermeer féknyergekkel mértük, és a daganat térfogatát a 4/3∏ (r1) 2 (r2) képlet segítségével számítottuk ki. 5 hetes daganatnövekedés után az egereket 12 órán át éheztettük, izofluránnal altattuk a vér szúrás útján történő vérvételéhez, majd a méhnyak diszlokációjával elöltük. A daganatokat kivágtuk és lemértük, majd vagy folyékony nitrogénben lefagyasztva fagyasztva -80 ° C-on tároltuk, vagy egy éjszakán át 10% semleges pufferolt formalinban rögzítettük, majd etanolra váltottuk, amíg feldolgozásukra és paraffinba ágyazódtak.

Az injekció előkészítése során a kémiailag indukált II fokozatú adenokarcinómából származó Panc02 sejteket (Corbett és mtsai, 1984) 37 ° C hőmérsékletű inkubátorban 5% CO2 atmoszféra alatt magas glükózszintű McCoy 5A módosított táptalajjal (Invitrogen, Carlsbad) 10% magzati szarvasmarha-szérum (FBS; Hyclone), 2 mM glutamin (Invitrogen), 10 000 E/ml penicillin, 10 000 E/ml sztreptomicin, 1X nem esszenciális aminosav, 10 mM HEPES puffer és 1 mM nátrium-piruvát.

MiaPaCa-2 humán hasnyálmirigy daganatsejt transzplantációs vizsgálat.

Harminc 6 hetes hím atlétikai meztelen egeret vásároltunk a Jackson Laboratories-tól (Bar Harbor, ME), és egy hétig chow-diétára helyeztük őket, miután megérkeztünk az UT Austin Animal Resource Center-be. Az egereket (n = 15/csoport) randomizálták, hogy vagy a kontroll étrendet, vagy az előző vizsgálatban használt 30% -os CR diétát kapják. Az állatokat egyedül helyezték el, és 23 hétig diétáztak. Az étrendcsoportonkénti átlagos testtömeget 16 héten keresztül (1 héttel a tumorsejt-injekció előtt) rögzítettük. A diétás kezelés 17. hetében az egereket szubkután 4 x 106 MiaPaCa-2 humán hasnyálmirigyrák sejtekkel (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA) injektáltuk a jobb szárba. A tumor növekedését monitoroztuk és rögzítettük az előzőekben leírtak szerint további 6 hétig. Ezután az egereket 12 órán át éheztettük, izofluránnal altattuk, majd a nyaki diszlokációval leöltük. A daganatokat kivágtuk és lemértük, majd az előbbiek szerint elkészítettük. Teljes vért is gyűjtöttünk és előállítottunk a korábban leírtak szerint. Minden csoportból egy egérben nem alakult ki daganat, ezért kizártuk az elemzésből, így a végső minta mérete 14.

Az injekció beadása előtt a MiaPaCa-2 sejteket DMEM-ben tartottuk 10 000 E/ml penicillinnel, 10 000 E/ml sztreptomicinnel, 1x nem esszenciális aminosavval, 10 mM HEPES pufferrel és 1 mM nátrium-piruváttal.

Szérum marker elemzések

A Panc02 transzplantációs vizsgálathoz 21 hetes étrend után vért gyűjtöttünk, és elemeztük az inzulin, a leptin, az adiponektin és az MCP-1 keringő szintjét, amelyet a Lincoplex gyöngyalapú multiplex tesztekkel mértünk (Millipore Corporation, Billerica, MA). BioRad Bioplex 200 analizátoron (BioRad, Hercules, CA) a gyártó utasításainak megfelelően. A szérum IGF-1 szinteket szintén ebben az időpontban elemeztük az ELISA segítségével a gyártó utasításai szerint (Quantikine MG-100, R&D Systems, Minneapolis, MN). Az egyes analiták elemzéséhez a minta mérete csoportonként nyolc véletlenszerűen kiválasztott egér volt. A vizsgálat végpontjának idején (26 hét diétás étrenden) az éhomi vércukorszintet terminális vérmintákon mértük Contour glükométerrel és Contour glükóz tesztcsíkokkal (Bayer HealthCare LLC, Mishawaka, IN Glucometer).

Valós idejű RT-PCR analízis a gyulladásos, angiogenezis és a sejtciklushoz kapcsolódó génexpresszióról

A teljes RNS-t a Panc02 és MiaPaCa-2 daganatokból extraháltuk a Qiagen RNeasy Mini Kit alkalmazásával a gyártó protokollja szerint (Qiagen, CA). Összesen 2 µg RNS-t fordítottunk át és írtunk át nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készletekkel (Ambion, Austin, TX). Gyulladásos, angiogén és sejtciklushoz kapcsolódó gének, köztük az F4/80, a kemokin (CC motívum) ligandum (CCL) 2, S100A9, Ccdn1, Vegfa, Birc5, Ptgs2, IL-6, RELA (p65 alegység) és XIAP expressziója valós idejű PCR-rel határoztuk meg TaqMan primer-próbákkal (Ambion, Austin, TX). A génexpressziót a háztartási génre, a β-aktinra normalizáltuk és a ΔΔCT módszerrel elemeztük.

Foszfo-p65 (p-p65) immunhisztokémiai festése

Citokin és kemokin elemzések IGF-1-vel kezelt sejtek felülúszóiban

A Panc02 sejteket 6 lyukú lemezekre oltottuk 10% FBS-sel kiegészített táptalajban 24 órán keresztül. Négy órás szérum éhezést követően a sejteket 24 órán át IGF-1-gyel (400 ng/ml; R&D Systems) kezeltük, majd a felülúszót összegyűjtöttük és -20 ° C-on tároltuk a vizsgálat elvégzéséig. A fehérje expresszió szintjét a Lincoplex gyöngyalapú citokin/kemokin panel segítségével (Millipore Corporation, Billerica, MS) elemeztük BioRad Bioplex 200 analizátoron (BioRad) a gyártó utasításainak megfelelően. A koncentráció megválasztása (400 ng/ml) a keringő IGF-1 fiziológiailag releváns szintjein alapult, amelyeket a jelen vizsgálatban használt kontroll étrenddel etetett egereknél figyeltek meg [35], [36], [37]. A felülúszókat három külön kísérletből gyűjtöttük össze.

P65 immunfluoreszcenciája

NF-κB DNS-kötő vizsgálat

Körülbelül 1 × 106 Panc02 sejtet oltottunk 10 cm-es csészékbe a fent leírtak szerint. A sejteket hagytuk szaporodni a szokásos DMEM + 10% FBS tápközegben 24 órán keresztül, majd 4 órán át szérum éheztettük. A szérum éhezést követően a sejteket 4, 8 és 16 órán át DMEM plusz 10% FBS, szérummentes DMEM vagy szérummentes DMEM + IGF-1 (400 ng/ml) kezeléssel kezeltük (az adatokat nem közöljük). betakarították. Röviden, a hozzákapcsolt sejteket mostuk és 1x PBS/foszfatáz inhibitorokba (Active Motif, Carlsbad, CA) gyűjtöttük, és 500xg-vel 4 ° C-on centrifugáltuk. A felülúszó eltávolítását követően a sejtpelletet kb. 60–100 µl fehérje-lízis pufferben (RIPA puffer, II. És III. Foszfatázinhibitor, Sigma; Roche MiniTab) szuszpendáltuk, jégen tartottuk 30 percig, 10 percenként enyhe keverés mellett, és centrifugáltuk 16 000 x g-vel 10 percig 4 ° C-on. A teljes sejtfehérje-extraktumokat Bradford-vizsgálattal (Bio-Rad; Hercules, CA) számszerűsítettük és szarvasmarha-szérum albuminná (BSA, 1 mg/ml) normalizáltuk.

TransAM enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálatot (ELISA) alkalmaztunk az NF-KB alegység, p65 aktivációjának mérésére a gyártó utasításai szerint (Active Motif, Carlsbad, CA). Röviden: 20 µg teljes sejtfehérje-lizátumot hígítottunk lízispufferben (a fent leírtak szerint), és két példányban egy 96-lyukú lemezre töltöttük, amely egy oligonukleotiddal volt bevonva, amely az NF-KB konszenzus helyet (5′-GGGACTTTCC-3 ′) tartalmazta. Minden egyes üregbe NF-KB/p65 primer antitestet adunk, és csak az NF-KB epitópjának kimutatására használjuk, amely csak akkor érhető el, ha aktiválódik és a cél DNS-hez kötődik. HRP-konjugált másodlagos antitestet adtunk hozzá, hogy kolorimetriás reakciót hozzunk létre, amelyet 450 nm-en spektrofotometriával detektáltunk 655 nm referencia hullámhosszon. A vizsgálatokat három külön kísérleten végeztük.

NF-κB transzkripciós aktiváció

Körülbelül 1,8x105 Panc02 sejtet oltottunk 6 üregű lemezekre, és hagytuk egy éjszakán át 37 ° C-on kapcsolódni. Huszonnégy órával később a sejteket pNF-KB/Luc és pRenilla/Luc-szal transzfektáltuk (Dr. Linda DeGraffenried bőkezűen szolgáltatta) FuGENE6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) alkalmazásával. A sejteket transzfekciós ágenssel inkubáltuk további 24 órán át, majd a szérum 4 órán keresztül éhezett. A szérum éhezést követően a sejteket McCoy plusz FBS-sel, szérummentes McCoy-szal vagy IGF-1-gyel (400 ng/ml) kezeltük 6 órán át, és a fehérjét Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) alkalmazásával gyűjtöttük be a gyártó által megadott módon. utasítás. A vizsgálatokat három külön kísérleten végeztük.

Kis interferáló RNS konstrukciók és transzfekciók

Az NF-κB elnémítást úgy végeztük, hogy siRNS konstrukciókat céloztunk vagy a p65-re, vagy a kódolt szekvenciára (Ambion, Austin, TX) az Opti-MEM csökkentett szérum táptalajával (Invitrogen; Carlsbad, CA) és a siPORT amin transzfekciós reagenssel (Ambion, Austin, TX). . A transzfekciós komplexet 6 lyukú lemezen adtuk a sejtekhez, és hagytuk egy éjszakán át inkubálódni. Huszonnégy órával később a transzfekciós komplexet tartalmazó táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket 4 órán át szérum-éheztettük. A szérum éhezést követően a sejteket 10% FBS-sel, szérummentes McCoy-kkal vagy 400 ng/ml IGF-1-gyel kiegészített McCoy-kkal kezeltük 18 órán át, majd RNS-t gyűjtöttünk az NF-κB downstream génanalízishez (az előzőekben leírtak szerint).

Statisztika

A testtömeg, a testzsír, a vércukorszint, a tumor térfogata és a tömeg adatai átlag ± SD, míg a szérumhormon, PCR, felülúszó fehérje expresszió, ELISA és riporter vizsgálati adatok átlag ± SEM. A kimeneteli különbségeket Student t-tesztjével elemeztük, kivéve a Panc02 gén expressziójának különbségeit a hangtompító konstrukciókkal végzett IGF-1 kezelést követően, amelyeket egyirányú ANOVA-val, majd Tukey post hoc teszttel elemeztünk. A Vegf-különbségeket Tamhane T2-vel post hoc tesztként értékelte az egyenlőtlen variancia miatt). Az adatokat szignifikánsnak tekintettük, ha p 1. ábra. A test összetétele, a vércukorszint és a szérum faktorok C57BL/6 egerekben 21 hetes diétás kezelést követően.

Kalória-korlátozás (CR) csökkent A testtömeg (az étrenden legfeljebb 20 hétig számoltak be, a tumorsejt injekciója előtt); B, testzsír százalék (21 hetes diétán); és C, éhomi vércukorszint (21 hetes étrenden) a CON étrendhez viszonyítva (n = 15/csoport). A bemutatott adatok az átlag ± SD értéket képviselik. CR megváltoztatta a D, inzulin átlagos éhomi szérumszintjét; E, IGF-1; F, leptin; és G, adiponektin (n = 8/csoport). A bemutatott adatok az átlag ± SEM értéket képviselik. * jelentős különbségeket jelöl a CR és a CON között. CR, kalória-korlátozás; CON, kontroll étrend; IGF-1, inzulinszerű növekedési faktor-1.

Az energiaegyensúlyra reagáló hormon és a növekedési faktor szintjének szérumanalízise azt mutatta, hogy a 21 hetes diétás kezelést követően az éhomi inzulin (1D. Ábra), az IGF-1 (1E. Ábra) és a leptin (1F ábra) szintek alacsonyabbak voltak a CR-ben egerek a kontrollhoz képest (p 2. ábra. A CR csökkentette a Panc02 tumor térfogatát és gyulladásos profilját.

A CR csökkentette az A, a tumor növekedését és a B, a daganat medián tömegét a CON egerekhez képest (n = 15/csoport). A bemutatott adatok átlag ± SD, kivéve a szórásdiagramban levő vonalat, amely a daganat középsúlyát reprezentálja. A C, CR csökkentette az mRNS expresszióját a tumor mikrokörnyezetében a CON egerekhez képest (CON, n = 6; CR, n = 5). Az adatok a CR gén expresszióját képviselik a CON-hez viszonyítva. D, Az MCP-1 átlagos éhomi szérumszintje (n = 8/csoport, véletlenszerűen kiválasztva). E, p-p65-vel festő tumorszakaszok reprezentatív mikrográfiái (40x). F, A festés mennyiségi meghatározása. Az oszlopdiagram a p-p65-pozitív sejtek százalékos arányát mutatja, az intracelluláris lokalizáció további szemléltetésével (mag, fekete; citoplazmatikus, fehér) (CON, n = 10 és CR, n = 7). A bemutatott adatok átlag ± SE-t képviselnek. * jelentős különbségeket jelöl a CR és a CON között. CR, kalória-korlátozás; CON, kontroll étrend; MCP-1, monocita kemoattraktáns-1; p-p65, foszforilezett p65.

A gyulladásos génexpresszió elemzése kimutatta, hogy a CR egerek daganatai a kontrollokhoz viszonyítva (n = 3 egér/csoport) 70% -kal csökkentek a gyulladásos markereket, F4/80 és S100a9 kódoló gének expressziójában (p 3. ábra. Hatás IGF-1 vizsgálata a p65 mag lokalizációján és az NF-κB út aktiválásán Panc02 sejtekben.

A, A p65 lokalizációjának reprezentatív fluoreszcens képei különböző időpontokban az IGF-1 kezelést követően (400 ng/ml), kizárólag 300 nM DAPI-t, egyedül p65 antitestet (p65) vagy DAPI-val festett p65 antitestet (egyesítve). 4 különálló vizsgálat adatai. B, a p65 DNS-kötés ELISA-ja 4 órás IGF-1 kezelésre adott válaszként (400 ng/ml). C, NF-KB luciferáz riportervizsgálat 6 órás IGF-1 kezelés után (400 ng/ml). * jelentős különbségeket jelöl az SF és az IGF-1 között. D, NF-κB downstream géncélok mRNS-expressziójának PCR-analízise 18 órás IGF-1 kezelés után. E, RANTES, LIF és VEGF (n = 3) expresszió ELISA mérése Panc02 felülúszóban 24 órás IGF-1 kezelés után. * jelentős különbségeket jelöl az SF és az IGF-1 között az egyes érdekes gének vagy fehérjék tekintetében. Minden kísérlethez 400 ng/ml IGF-1-et használtunk. Az oszlopdiagramok az átlag ± SEM értékét mutatják (n = 3 külön kísérlet, amelyet három példányban végeztek B, C és D esetében). SF, szérummentes; IGF-1, inzulinszerű növekedési faktor-1; DAPI, 4′-6-diamidino-2-fenilindol; RANTES, aktiválásra szabályozva, normál T-sejt expresszálva és szekretálva; LIF, leukémia-gátló faktor; VEGF, vaszkuláris endoteliális növekedési faktor.

A p65 expresszió elhallgattatása minimalizálja az IGF-1 által indukált génexpressziót

A Panc02 sejtek p65-re specifikus siRNS-sel történő transzfekciója 48 órán belül 70-80% -kal csökkentette a p65 által indukált génexpressziót (p 4. ábra. A csendes p65 hatása a downstream NF-κB célok IGF-1 által indukált expressziójára Panc02 sejtekben.

A, p65 mRNS expressziója Panc02 sejtekben, összekevert vagy p65-specifikus kis interferáló RNS-nek való kitettség után. B, Ccdn1; Vegfa; Birc5; és COX-2 mRNS expresszió 18 órás IGF-1 kezelés után (400 ng/ml). Az oszlopdiagramok az átlag ± SEM értékét ábrázolják (n = 3 külön kísérletet hajtottak végre három példányban az egyes gének esetében). Különböző betűk vagy csillag jelöli a csoportok közötti jelentőséget. IGF-1, inzulinszerű növekedési faktor-1.

A CR csökkentette a MiaPaCa-2 testtömegét, a tumorterhet és a gyulladásos génexpressziót

A C57BL/6 egerekben tett eredményeinkkel párhuzamosan a kontroll és a CR diéták két különböző súlyú fenotípust generáltak a hím atlikus meztelen egerekben (5A. Ábra). A CR egerek súlya lényegesen kevesebb volt, mint a kontroll étrenden, három hetes étrend után (p 5. ábra. A diéta hatása a MiaPaCa-2 tumor terhelésére és a génexpresszióra.